DNA-Reparatur-assoziierte genetische und epigenetische Faktoren für die Zweittumorentstehung nach Tumoren im Kindes- und Jugendalter

Die Ursachen der Zweittumorentwicklung bei Personen, die eine Krebserkrankung in der Kindheit überlebten, sind weitgehend unklar. Strahlenexposition oder Chemotherapie führen in normalen somatischen Zellen zu DNA-Schäden, welche bei fehlerhafter Reparatur eine Karzinogenese auslösen können. Es ist denkbar, dass genetische Unterschiede z. B. in den Signalwegen der Zellzykluskontrolle und der DNA-Reparatur nach therapieinduzierten DNA-Schäden eine entscheidende Rolle bei der Zweittumorentwicklung spielen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 20 Personen, die eine Krebserkrankung in der Kindheit überlebten und einen unabhängigen Zweittumor entwickelten, mit 20 gematchten Kontrollpersonen ohne Zweittumorentwicklung verglichen. Die primären Fibroblasten der Patienten wurden auf somatische, genetische und/oder epigenetische Unterschiede in DNA-Reparaturnetzwerken untersucht. Die biologisch relevantesten Ergebnisse lieferten Proteinuntersuchungen mittels Antikörper-Microarrays. Hierbei wurde eine konstitutiv erniedrigte Menge an RAD9A und einigen anderen DNA-Reparatur-Proteinen (BRCA1, DDIT3, MSH6, p53, RAD51) in den Zweittumorpatienten im Vergleich zu den Eintumorpatienten festgestellt. Nach einer DNA-Schädigung durch 1 Gray Bestrahlung erhöhte sich die RAD9A-Proteinmenge, wobei die Zweittumorpatienten eine geringere Induktion als die Eintumorpatienten zeigten. Bei der Quantifizierung der mRNA-Expression mittels RTq-PCR wurde ein niedrigerer RAD9A-mRNA-Level sowohl in den unbehandelten und als auch in den 1 Gray bestrahlten Zellen der Zweittumorpatienten festgestellt. SNP-Array und Methylierungsanalysen konnten keine Auffälligkeiten im RAD9A-Lokus nachweisen. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass Modulationen von RAD9A und anderen Zellzyklusarrest- und DNA-Reparaturproteinen zum Risiko einer Zweittumorentwicklung in Kinderkrebspatienten beitragen. Bei einem diskordanten monozygoten Zwillingspaar wurde in ca. 20% der Zellen des Zweittumorzwillings eine Hypermethylierung des Tumorsuppressorgens BRCA1 festgestellt, die mit einer konstitutiv erniedrigten BRCA1-Proteinexpression einhergeht und einen möglichen Krebsrisikofaktor darstellt. Die partielle Deletion des Gens RSPO3, die wahrscheinlich als somatisches Zellmosaik beim Zweittumorzwilling vorliegt, korreliert mit einer niedrigeren RSPO3-mRNA-Expression und ist vermutlich auch mit einer erhöhten Krebsprädisposition assoziiert.

Synthese und immunologische Evaluierung von Antitumor-Impfstoffen aus dem epithelialen tumorassoziierten Mucin MUC1

Eine Immuntherapie von Tumorerkrankungen, die mit Hilfe von Antitumorimpfstoffen prophylaktisch und therapeutisch erfolgen könnte, wäre eine attraktive Alternative zu den bisher angewendeten Krebsbehandlungen. Aufgrund charakteristisch veränderter Aktivitäten von Glycosyltransferasen in der Glycoprotein-Biosynthese werden auf malignen Zellen stark verkürzte, frühzeitig sialylierte mucinartige Glycoproteine exprimiert. Diese verkürzten Kohlenhydrate repräsentieren tumorassoziierte Antigene. Sie haben zur Folge, dass Peptidepitope der Mucin-Glycoproteine, die auf gesundem Gewebe durch den hohen Glycosylierungsgrad maskiert sind, für das Immunsystem freiliegen. Diese Strukturunterschiede sollten einen selektiven Angriff auf das Tumorgewebe erlauben, ohne dass gesundes Gewebe beeinträchtigt wird, wenn es gelänge, das Immunsystem auf diese veränderten Strukturelemente zu fokussieren. Dabei ist es wichtig, dass die Immunantwort mit synthetisch definierten Glycopeptidepitopen ausgelöst wird, um Autoimmunreaktionen zu vermeiden. Somit ist die Synthese von exakt definierten tumorassoziierten Glycopeptiden von zentraler Bedeutung für die Entwicklung eines Antitumor-Impfstoffes. rnDa die tumorassoziierten Kohlenhydratstrukturen Antigene darstellen, die vom Immunsystem weitgehend toleriert werden, ist es notwendig, ihre Immunogenität mit Hilfe immunstimulierender Epitope so zu erhöhen, dass eine effiziente Immunreaktion erfolgt. Nach diesem Konzept wurden in der vorliegenden Arbeit Methoden und Strategien entwickelt, synthetische Impfstoff-Konjugate zu synthetisieren und immunologisch in Mausexperimenten zu evaluieren. So konnte gezeigt werden, das mit vollsynthetischen Analoga aus tumorassoziierten Glycopeptid-Oberflächenmolekülen in Kombination mit immunstimulierenden Substanzen, wie Trägerproteinen oder Mitogenen, hochselektive humorale Immunantworten ausgelöst werden können.rn

Proteomics-driven approach for the detection of breast cancer biomarkers

Breast cancer (BC) is the most often diagnosed cancer entity of women worldwide. No molecular biomarkers are usable in the clinical routine for the early detection of BC. Proteomics is one of the dynamic tools for the successful examination of changes on the protein level. In this thesis different proteomics-based investigations were performed for the detection of protein and autoantibody biomarkers in serum samples of BC and healthy (CTRL) subjects. First, protein levels of candidates from previous profiling studies were investigated via antibody-microarray platform. Three proteins were found in distinct levels in both groups: secretoglobin family 1D member 1, alpha-2 macroglobulin and inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain family member 4. The second part was dedicated to the de novo exploration of potentially immunogenic tumor antigens (TA’s) with immunoprecipitation and Western immunoblotting followed by identification over mass spectrometry. Autoantibody levels were verified in individual serum profiling via the protein microarray platform. Two autoantibody’ cohorts (anti-Histone 2B and anti-Recoverin) were found in different levels in both groups. The findings of this PhD thesis underline deregulated serum protein and autoantibody levels in the presence of BC. Further investigations are needed to confirm the results in an independent study population.

Development of a highly potent bispecific antibody format targeting the novel tumor-specific antigen CLDN18.2

Due to multiple immune evasion mechanisms of cancer cells, novel therapy approaches are required to overcome the limitations of existing immunotherapies. Bispecific antibodies are potent anti-cancer drugs, which redirect effector T cells for specific tumor cell lysis, thus enabling the patient’s immune system to fight cancer cells. The antibody format used in this proof of concept study–bispecific ideal monoclonal antibodies termed BiMAB–is a tailor-made recombinant protein, which consists of two fused scFv antibodies recognizing different antigens. Both are arranged in tandem on a single peptide chain and the individual variable binding domains are separated by special non-immunogenic linkers. The format is comprised of a scFv targeting CLDN18.2–a gastric cancer tumor associated antigen (TAA) –while the second specificity binds the CD3 epsilon (CD3ε) subunit of the T cell receptor (TCR) on T cells. For the first time, we compared in our IMAB362-based BiMAB setting, four different anti-CD3-scFvs, respectively derived from the mAbs TR66, CLB-T3, as well as the humanized and the murine variant of UCHT1. In addition, we investigated the impact of an N- versus a C-terminal location of the IMAB362-derived scFv and the anti-CD3-scFvs. Thus, nine CLDN18.2 specific BiMAB proteins were generated, of which all showed a remarkably high cytotoxicity towards CLDN18.2-positive tumor cells. Because of its promising effectiveness, 1BiMAB emerged as the BiMAB prototype. The selectivity of 1BiMAB for its TAA and CD3ε, with affinities in the nanomolar range, has been confirmed by in vitro assays. Its dual binding depends on the design of an N-terminally positioned IMAB362 scFv and the consecutive C-terminally positioned TR66 scFv. 1BiMAB provoked a concentration and target cell dependent T cell activation, proliferation, and upregulation of the cytolytic protein Granzyme B, as well as the consequent elimination of target cells. Our results demonstrate that 1BiMAB is able to activate T cells independent of elements that are usually involved in the T cell recognition program, like antigen presentation, MHC restriction, and co-stimulatory effector molecules. In the first in vivo studies using a subcutaneous xenogeneic tumor mouse model in immune incompetent NSG mice, we could prove a significant therapeutic effect of 1BiMAB with partial or complete tumor elimination. The initial in vitro RIBOMAB experiments correspondingly showed encouraging results. The electroporation of 1BiMAB IVT-RNA into target or effector cells was feasible, while the functionality of translated 1BiMAB was proven by induced T cell activation and target cell lysis. Accordingly, we could show that the in vitro RIBOMAB approach was applicable for all nine BiMABs, which proves the RIBOMAB concept. Thus, the CLDN18.2-BiMAB strategy offers great potential for the treatment of cancer. In the future, administered either as protein or as IVT-RNA, the BiMAB format will contribute towards finding solutions to raise and sustain tumor-specific cellular responses elicited by engaged and activated endogenous T cells. This will potentially enable us to overcome immune evasion mechanisms of tumor cells, consequently supporting current solid gastric cancer therapies.