Glukose-konjugierte Hemmstoffe als Strategie der gezielten Hemmung des DNA-Reparaturproteins O 6 -Methylguanin-DNA-Methyltransferase in Tumorzellen und der Einfluss von ATP-binding cassette Transportern

Das DNA-Reparaturprotein O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase [MGMT] ist der Hauptresistenzfaktor gegenüber der zytotoxischen Wirkung von SN1-alkylierenden Zytostatika in der Tumortherapie. Die Verwendung der MGMT-Hemmstoffe O6-Benzylguanin [O6BG] und O6-(4-Bromothenyl)guanin [O6BTG] führte zu einer Sensibilisierung des Normalgewebes, was eine Dosis-Reduktion der Zytostatika erforderlich machte und die erhoffte Therapieverbesserung verhinderte. Aus diesem Grund ist eine Strategie der selektiven Hemmung des MGMT-Proteins (Targeting-Strategie) erforderlich, um die systemische Toxizität in der Kombinationsbehandlung zu reduzieren. In dieser Arbeit wurde die Anwendbarkeit der Glukose-Konjugation als Targeting-Strategie untersucht, da Tumorzellen einen erhöhten Glukoseverbrauch aufweisen und demzufolge Glukosetransporter überexprimieren. Die Glukose-Konjugate O6BG-Glu und O6BTG-Glu inhibierten MGMT in Tumorzellen und sensibilisierten die Zellen gegenüber den alkylierenden Agenzien Temozolomid [TMZ] und Lomustin [CCNU]. Des Weiteren inaktivierten die Glukose-Konjugate die MGMT-Aktivität im Tumor eines Xenograft-Mausmodells und reduzierten das Tumorwachstum nach einer TMZ-Behandlung im gleichen Ausmass wie die Inhibitoren O6BG und O6BTG. Trotzdem war auch mit den Glukose-Konjugaten keine Steigerung der Zytostatika-Dosis im Mausmodell möglich. Die Untersuchungen der Aufnahme von O6BG-Glu und O6BTG-Glu wiederlegten eine Involvierung der Glukosetransporter. Der Einsatz von spezifischen Glukosetransporter-Inhibitoren und Kompetitions-Experimenten führte zu keiner Verminderung der MGMT-Hemmung oder Aufnahme vom radioaktiven H3-O6BTG-Glu in die Zelle. Dies legt nahe, dass die Glukose-Konjugate über einen unspezifischen Mechanismus (aktiv) in die Zellen gelangen. Der Grund für eine mögliche unselektive Aufnahme könnte im hydrophoben Alkyllinker, der für die Konjugation des Glukosemoleküls verwendet wurde, begründet sein. Dies führt zur Generierung von amphipathischen Konjugaten, die eine initiale Bindung an die Plasmamembran aufweisen und eine Aufnahme über den Flip-Flop-Mechanismus (transbilayer transport) wahrscheinlich machen. Die amphipathische Molekülstruktur der Glukose-Konjugate führte zu einer Partikelbildung in wässrigen Lösungen, die eine Reduktion der Menge an aktiven Monomeren von O6BG-Glu und O6BTG-Glu bewirken, die zur Hemmung von MGMT zur Verfügung stehen. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Rolle von ABC-Transportern hinsichtlich einer Targeting-Strategie von MGMT-Hemmstoffen. Obwohl eine hohe Expression dieser ABC-Transporter in Tumoren zur Resistenzentwicklung gegenüber Zytostatika führt, wurde ihr Einfluss auf MGMT-Hemmstoffe oder einer MGMT-Targeting-Strategie niemals untersucht. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal ein aktiver Efflux von MGMT-Hemmstoffen durch ABC-Transporter nachgewiesen. Die Inhibition von ABC-Transportern bewirkte eine schnellere Inaktivierung von MGMT durch die Glukose-Konjugate. Des Weiteren zeigten Kompetitions-Experimente mit den MGMT-Hemmstoffen eine verminderte Efflux-Rate von Fluoreszenzfarbstoffen, die spezifisch von ABC-Transportern exportiert werden. ABC-Transporter reduzieren die wirksame Konzentration des Hemmstoffes in der Zelle und beeinträchtigen somit die Effektivität der MGMT-Inhibition. Eine simultane Hemmung der ABC-Transporter P-glycoprotein (P-gp), multi resistance protein 1 (MRP1) and breast cancer resistance protein (BCRP) erhöhte die Effektivität der MGMT-Hemmstoffe (O6BG, O6BTG, O6BG-Glu, O6BTG-Glu) und verstärkte auf diese Weise die TMZ-induzierte Toxizität in Tumorzelllinien. Die Involvierung von ABC-Transportern in der intrazellulären Speicherung von MGMT-Hemmstoffen ist wahrscheinlich die Ursache für die beobachteten Unterschiede in der Sensibilisierung verschiedener Tumorzelllinien gegenüber Zytostatika durch das Glukose-Konjugat O6BG-Glu. Eine Strategie, den Einfluss von ABC-Transportern zu reduzieren und zukünftliche MGMT-Targeting-Strategien effizienter umzusetzen, ist die Verwendung von O6BTG als Ausgangssubstanz. Die höhere Inhibitionsfähigkeit der Bromthiophenmoleküle vermindert die erforderliche intrazelluläre Konzentration für eine vollständige MGMT-Hemmung und reduziert auf diese Weise den Einfluss von ABC-Transportern.

Modulation der Genexpression und des neuronalen Zelltods durch das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP)

Das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) spielt eine zentrale Rolle in der Entstehung und Entwicklung von Morbus Alzheimer. Hierbei ist die proteolytische Prozessierung von APP von entscheidender Bedeutung. Das Verhältnis von neurotoxischen und neuroprotektiven Spaltprodukten, die über den amyloidogenen und nicht-amyloidogenen Weg der APP-Prozessierung gebildeten werden, ist für das Überleben von Neuronen und deren Resistenz gegen zytotoxische Stress-Stimuli von hoher Relevanz. Störungen der Calcium-Homöostase sind ein bekanntes Phänomen bei Morbus Alzheimer. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von überexprimiertem APP in der Regulation des neuronalen Zelltods nach Calcium Freisetzung untersucht. Die Calcium Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum wurde durch die Inhibition der sarko- und endoplasmatischen Calcium-ATPasen (SERCA) ausgelöst. Dies führt zur Induktion der sogenannten „unfolded protein response“ (UPR) und zu einer Aktivierung von Effektor-Caspasen. Für APP-überexprimierende PC12 Zellen konnte bereits zuvor eine im Vergleich zur Kontrolle nach der durch Calcium Freisetzung-induzierten Apoptose eine erhöhte intrazelluläre Calcium Konzentration nachgewiesen werden. Über die Messung der Aktivierung von Effektor-Caspasen konnte zudem ein gesteigerter Zelltod in den APP-überexprimierenden Zellen gemessen werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass der pro-apoptotische Transkriptionsfaktor CHOP, nicht aber die klassischen UPR-Zielgene spezifisch hochreguliert wurden. Die APP-modulierte gesteigerte Induktion von Apoptose nach Calcium Freisezung konnte durch Komplexierung der intrazellulären Calcium Ionen und durch Knockdown von CHOP im Vergleich zur Kontrolle gänzlich unterdrückt werden. Ferner bewirkte die Inhibition der Speicher-aktivierten Calcium-Kanälen (SOCC) eine signifikante Unterdrückung der beobachteten erhöhten intrazellulären Calcium Konzentration und der gesteigerten Apoptose in den APP-überexprimierenden PC12 Zellen. In diesem Teil der Arbeit konnte eindeutig gezeigt werden, dass APP in der Lage ist den durch Calcium-Freisetzung-induzierten Zelltod zu potenzieren. Diese Modulation durch APP verläuft in einer UPR-unabhängigen Reaktion über die Aktivierung von SOCC’s, einer erhöhten Aufnahme von extrazellulärem Calcium und durch erhöhte Induktion des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors CHOP. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die sAPPα-vermittelte Neuroprotektion untersucht. Dabei handelt es sich um die N-terminale Ektodomäne von APP, die über die Aktivität der α-Sekretase prozessiert wird und anschließend extrazellulär abgegeben wird. Ziel dieser Versuchsreihe war die neuroprotektive physiologische Funktion von APP im Hinblick auf den Schutz von neuronalen Zellen vor diversen für Morbus Alzheimer relevanten Stress-Stimuli bzw. Apoptose-Stimuli zu untersuchen. Durch die Analyse der Effektor-Caspasen konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist PC12 Zellen potent vor oxidativem Stress, DNA-Schäden, Hypoxie, proteasomalem Stress und Calcium-Freisetzung zu schützen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass sAPPα in der Lage ist den pro-apoptotischen Stress-induzierten JNK/Akt-Signalweg zu inhibieren. Eine Beteiligung des anti-apoptotischen PI3K/Akt-Signalwegs bei der sAPPα-vermittelten Protektion konnte über die Inhibition der PI3-Kinase ebenfalls demonstriert werden, die eine Aufhebung der sAPPα-vermittelten Neuroprotektion bewirkte. Diese Daten zeigen neue molekulare Mechanismen auf, die dem sAPPα-vermittelten Schutz vor pathophysiologisch relevanten Stress-Stimuli in neuronalen Zellen zugrunde liegen. Im letzten Teil der Arbeit wurden verschieden Gruppen von pharmakologischen Substanzen im Hinblick auf ihre neuroprotektive Wirkung untersucht und mit ihren Effekten auf den APP-Metabolismus korreliert. Die Untersuchungen ergaben, dass Galantamin, ein schwacher Acetycholinesterase Inhibitor und allosterisch potenzierender Ligand von nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren in der Lage war, naive, und mit noch höherer Effizienz APP-überexprimierende Zelllinien vor dem Stress-induzierten Zelltod zu schützen. Zudem bewirkte Galantamin in APP-überexprimierenden HEK293 Zellen eine rasche Erhöhung der sAPPα Sekretion, so dass hier von einer Rezeptor-vermittelten Modulation des APP Metabolismus ausgegangen werden kann. Omega-3 Fettsäuren wirken sich positiv auf die Membranfluidität von Zellen aus und es konnte bereits gezeigt werden, dass die Bildung des toxischen Aβ Peptids hierdurch vermindert wird. In Analogie zu Galantamin schützte die Omega-3 Fettsäure Docosahexaensäure (DHA) neuronale Zellen vor dem Stress-induzierten Zelltod, wobei der Schutz in APP-überexprimierenden Zellen besonders effizient war. Diese Daten legen nahe, dass die Aktivierung des antiamyloidogenen Wegs der APP-Prozessierung ein viel versprechender Ansatz für die Entwicklung neuer Therapien gegen Morbus Alzheimer sein könnte.

On the inheritance and mechanism of baculovirus resistance of the codling moth, Cydia pomonella (L.)

Das Cydia pomonella Granulovirus (CpGV, Baculoviridae) wird seit Ende der 1980er Jahre als hoch-selektives und effizientes biologisches Bekämpfungsmittel zur Kontrolle des Apfelwicklers im Obstanbau eingesetzt. Seit 2004 wurden in Europa verschiedene Apfelwicklerpopulationen beobachtet die resistent gegenüber dem hauptsächlich angewendeten Isolat CpGV-M aufweisen. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Untersuchung der Vererbung und des Mechanismus der CpGV Resistenz. Einzelpaarkreuzungen zwischen einem empfindlichen Laborstamm (CpS) und einem homogen resistenten Stamm (CpRR1) zeigten, dass die Resistenz durch ein einziges dominantes Gen, das auf dem Z-Chromosom lokalisiert ist, vererbt wird. Massernkreuzungen zwischen CpS und einer heterogen resistenten Feldpopulation (CpR) deuteten zunächst auf einen unvollständig dominanten autosomalen Erbgang hin. Einzelpaarkreuzungen zwischen CpS und CpR bewiesen jedoch, dass die Resistenz in CpR ebenfalls monogen dominant und geschlechtsgebunden auf dem Z-Chromosom vererbt wird. Diese Arbeit diskutiert zudem die Vor- und Nachteile von Einzelpaarkreuzungen gegenüber Massernkreuzungen bei der Untersuchung von Vererbungsmechanismen. Die Wirksamkeit eines neuen CpGV Isolates aus dem Iran (CpGV-I12) gegenüber CpRR1 Larven, wurde in Bioassays getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass CpGV-I12 die Resistenz in allen Larvenstadien von CpRR1 brechen kann und fast so gut wirkt wie CpGV-M gegenüber CpS Larven. Daher ist CpGV-I12 für die Kontrolle des Apfelwicklers in Anlagen wo die Resistenz aufgetreten ist geeignet. Um den der CpGV Resistenz zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen, wurden vier verschiedene Experimente durchgeführt: 1) die peritrophische Membran degradiert indem ein optischer Aufheller dem virus-enthaltenden Futtermedium beigefügt wurde. Das Entfernen dieser mechanischen Schutzbarriere, die den Mitteldarm auskleidet, führte allerdings nicht zu einer Reduzierung der Resistenz in CpR Larven. Demnach ist die peritrophische Membran nicht am Resistenzmechanismus beteiligt. 2) Die Injektion von Budded Virus in das Hämocoel führte nicht zur Brechung der Resistenz. Folglich die die Resistenz nicht auf den Mitteldarm beschränkt, sondern auch in der Sekundärinfektion wirksam. 3) Die Replikation von CpGV in verschiedenen Geweben (Mitteldarm, Hämolymphe und Fettkörper) von CpS und CpRR1 wurde mittels quantitativer PCR verfolgt. In CpS Larven konnte in allen drei Gewebetypen sowohl nach oraler als auch nach intra-hämocoelarer Infektion eine Zunahme der CpGV Genome in Abhängigkeit der Zeit festgestellt werden. Dagegen konnte in den Geweben aus CpRR1 nach oraler sowie intra-hämocoelarer Infektion keine Virusreplikation detektiert werden. Dies deutet darauf hin, dass die CpGV Resistenz in allen Zelltypen präsent ist. 4) Um zu untersuchen ob ein humoraler Faktor in der Hämolymphe ursächlich an der Resistenz beteiligt ist, wurde Hämolymphe aus CpRR1 Larven in CpS Larven injiziert und diese anschließend oral mit CpGV infiziert. Es konnte jedoch keine Immunreaktion beobachtet und kein Faktor in der Hämolymphe identifiziert werden, der Resistenz induzieren könnte. Auf Grundlage dieser Ergebnisse kann festgestellt werden, dass in resistenten Apfelwicklerlarven die virale Replikation in allen Zelltypen verhindert wird, was auf eine Virus-Zell Inkompatibilität hinweist. Da in CpRR1 keine DNA Replikation beobachtet wurde, wird die CpGV Resistenz wahrscheinlich durch eine frühe Unterbindung der Virusreplikation verursacht.Das früh exprimierte Gen pe38 codiert für ein Protein, das wahrscheinlich für die Resistenzbrechung durch CpGV-I12 verantwortlich ist. Interaktionen zwischen dem Protein PE38 und Proteinen in CpRR1 wurden mit Hilfe des Yeast Two-Hybrid (Y2H) Systems untersucht. Die detektierten Interaktionen sind noch nicht durch andere Methoden bestätigt, jedoch wurden zwei mögliche Gene auf dem Z-Chromosom und eines auf Chromosom 15 gefunden, wie möglicherweise an der CpGV Resistenz beteiligt sind.

Novel isolates of Cydia pomonella granulovirus (CpGV): deciphering the molecular mechanism for overcoming CpGV resistance in codling moth (Cydia pomonella)

During the last twenty years, Cydia pomonolla granulovirus (CpGV, Baculoviridae) has become the most important biological control agent for the codling moth (CM) in organic and integrated apple production. All registered products in Europe are based on the isolate CpGV-M, which was discovered 1964 in Mexico. A serious threat to future application of CpGV is the occurrence of CM field populations resistant to CpGV. Since 2003, populations with up to 10,000-fold reduced susceptibility were reported from orchards in Germany, France, Italy, Switzerland, Austria and the Netherlands. A putative alternative to CpGV-M are novel CpGV isolates which are able to overcome CM resistance. This thesis focuses on the identification and characterisation of resistance overcoming CpGV isolates and the analysis of their molecular difference to CpGV-M.rnSixteen CpGV isolates were tested against CM lab strains in bioassays. Hereby, five isolates were identified which were able to completely overcome resistance. The genomes of these isolates were compared to CpGV-M by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. To identify the molecular factor responsible for improved virulence of some CpGV isolates, major genomic differences were sequenced and analysed. A 0.7 kb insertion was found in CpGV-I01, -I12 and -E2, but not in other resistance overcoming isolates. Analysis of the insertions sequence revealed that it might be due to a transposition event, but not involved in overcoming resistance. rnFor unequivocal identification of CpGV isolates, a new method based on molecular analysis was established. Partial sequencing of the conserved polyhedrin/granulin (polh/gran), late expression factor-8 (lef-8) and late expression factor-9 (lef-9) genes revealed single nucleotide polymorphisms (SNPs). SNP analysis correlated with the grouping obtained by RFLP analysis. A phylogenetic classification due to different genome types A-E is proposed. Phylogenetic analysis suggested that CpGV-M was the phylogenetically youngest of the tested CpGV isolates.rnWhole genome sequencing of two resistance overcoming isolates CpGV-I12 (type D genome) and -S (type E genome) and CpGV-M (type A genome) was performed. Comparison of the three genomes revealed a high sequence identity. Several insertions and deletions ranging from 1-700 nucleotides (nt) were found. Comparison on open reading frame (ORF) level revealed that CpGV-I12 and -S shared only one protein alteration when compared to CpGV-M: a stretch of 24 nt present in ORF cp24 was not found in any of the resistance overcoming isolates. Cp24 codes for the early gene pe38. Combined with the results of phylogenetic analysis, it is proposed that these 24 nt are a recent insertion into the CpGV-M genome. The role of pe38 in overcoming resistance was investigated by knocking out pe38 of a CpGV-M based bacmid and swapping of CpGV-I12 pe38 of into the k.o. bacmid. When pe38 of CpGV-I12 was inserted into the k.o. bacmid, the infectivity could not be rescued, suggesting that the genomic portion of pe38 might play a role in its function.rnIt can be concluded that the recently observed CpGV resistance in CM is only related to type A genomes. RFLP and SNP analysis provide tools for identifying and characterising different CpGV isolates reliably, a pre-condition for a future registration of CpGV products based on novel CpGV isolates.rnrnrn

Volatile anesthetics influence blood-brain barrier integrity by modulation of tight junction protein expression in traumatic brain injury

Disruption of the blood-brain barrier (BBB) results in cerebral edema formation, which is a major cause for high mortalityrnafter traumatic brain injury (TBI). As anesthetic care is mandatory in patients suffering from severe TBI it may be importantrnto elucidate the effect of different anesthetics on cerebral edema formation. Tight junction proteins (TJ) such as zonularnoccludens-1 (ZO-1) and claudin-5 (cl5) play a central role for BBB stability. First, the influence of the volatile anestheticsrnsevoflurane and isoflurane on in-vitro BBB integrity was investigated by quantification of the electrical resistance (TEER) inrnmurine brain endothelial monolayers and neurovascular co-cultures of the BBB. Secondly brain edema and TJ expression ofrnZO-1 and cl5 were measured in-vivo after exposure towards volatile anesthetics in native mice and after controlled corticalrnimpact (CCI). In in-vitro endothelial monocultures, both anesthetics significantly reduced TEER within 24 hours afterrnexposure. In BBB co-cultures mimicking the neurovascular unit (NVU) volatile anesthetics had no impact on TEER. In healthyrnmice, anesthesia did not influence brain water content and TJ expression, while 24 hours after CCI brain water contentrnincreased significantly stronger with isoflurane compared to sevoflurane. In line with the brain edema data, ZO-1 expressionrnwas significantly higher in sevoflurane compared to isoflurane exposed CCI animals. Immunohistochemical analysesrnrevealed disruption of ZO-1 at the cerebrovascular level, while cl5 was less affected in the pericontusional area. The studyrndemonstrates that anesthetics influence brain edema formation after experimental TBI. This effect may be attributed tornmodulation of BBB permeability by differential TJ protein expression. Therefore, selection of anesthetics may influence thernbarrier function and introduce a strong bias in experimental research on pathophysiology of BBB dysfunction. Futurernresearch is required to investigate adverse or beneficial effects of volatile anesthetics on patients at risk for cerebral edema.