New sensing platforms based on nanoscopic devices for probing protein-membrane interactions

A novel nanosized and addressable sensing platform based on membrane coated plasmonic particles for detection of protein adsorption using dark field scattering spectroscopy of single particles has been established. To this end, a detailed analysis of the deposition of gold nanorods on differently functionalized substrates is performed in relation to various factors (such as the pH, ionic strength, concentration of colloidal suspension, incubation time) in order to find the optimal conditions for obtaining a homogenous distribution of particles at the desired surface number density. The possibility of successfully draping lipid bilayers over the gold particles immobilized on glass substrates depends on the careful adjustment of parameters such as membrane curvature and adhesion properties and is demonstrated with complementary techniques such as phase imaging AFM, fluorescence microscopy (including FRAP) and single particle spectroscopy. The functionality and sensitivity of the proposed sensing platform is unequivocally certified by the resonance shifts of the plasmonic particles that were individually interrogated with single particle spectroscopy upon the adsorption of streptavidin to biotinylated lipid membranes. This new detection approach that employs particles as nanoscopic reporters for biomolecular interactions insures a highly localized sensitivity that offers the possibility to screen lateral inhomogeneities of native membranes. As an alternative to the 2D array of gold nanorods, short range ordered arrays of nanoholes in optically transparent gold films or regular arrays of truncated tetrahedron shaped particles are built by means of colloidal nanolithography on transparent substrates. Technical issues mainly related to the optimization of the mask deposition conditions are successfully addressed such that extended areas of homogenously nanostructured gold surfaces are achieved. Adsorption of the proteins annexin A1 and prothrombin on multicomponent lipid membranes as well as the hydrolytic activity of the phospholipase PLA2 were investigated with classical techniques such as AFM, ellipsometry and fluorescence microscopy. At first, the issues of lateral phase separation in membranes of various lipid compositions and the dependency of the domains configuration (sizes and shapes) on the membrane content are addressed. It is shown that the tendency for phase segregation of gel and fluid phase lipid mixtures is accentuated in the presence of divalent calcium ions for membranes containing anionic lipids as compared to neutral bilayers. Annexin A1 adsorbs preferentially and irreversibly on preformed phosphatidylserine (PS) enriched lipid domains but, dependent on the PS content of the bilayer, the protein itself may induce clustering of the anionic lipids into areas with high binding affinity. Corroborated evidence from AFM and fluorescence experiments confirm the hypothesis of a specifically increased hydrolytic activity of PLA2 on the highly curved regions of membranes due to a facilitated access of lipase to the cleavage sites of the lipids. The influence of the nanoscale gold surface topography on the adhesion of lipid vesicles is unambiguously demonstrated and this reveals, at least in part, an answer for the controversial question existent in the literature about the behavior of lipid vesicles interacting with bare gold substrates. The possibility of formation monolayers of lipid vesicles on chemically untreated gold substrates decorated with gold nanorods opens new perspectives for biosensing applications that involve the radiative decay engineering of the plasmonic particles.

Entwicklung und Optimierung eines Mikroarray zur Erfassung der genetischen Prädisposition von Atherosklerose

Die Entstehung der Atherosklerose ist ein komplexer Vorgang, der sich durch Ablagerung von Lipiden an der Gefäßwand sowie durch immunologische und inflammatorische Prozesse auszeichnet. Neben konventionellen Risikofaktoren wie Alter, Geschlecht, Rauchen, HDL-Cholesterin, Diabetes mellitus und einer positiven Familienanamnese werden zur Bestimmung des atherosklerotischen Risikos neue Biomarker der inflammatorischen Reaktion untersucht. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Methode zur Diagnostik des Atheroskleroserisikos. Es wurde eine neuartige Chip-Technologie eingesetzt, um das Risiko für eine potentiell drohende atherosklerotische Erkrankung abzuschätzen. Dabei wurde ausgenutzt, dass molekulare Veränderungen in Genen bestimmte Krankheitsbilder auslösen können. rnEs wurde ein molekularbiologischer Test entwickelt, welcher die Untersuchung von genetischen Variationen aus genomischer DNA ermöglicht. Dafür fand die Entwicklung einer Multiplex-PCR statt, deren Produkt mit der Chip-Technologie untersucht werden kann. Dazu wurden auf einem Mikroarray Sonden immobilisiert, mit deren Hilfe genspezifische Mutationen nachgewiesen werden können. So wurden mehrere Gene mit einem geringen Aufwand gleichzeitig getestet. rnDie Auswahl der entsprechenden Marker erfolgte anhand einer Literaturrecherche von randomisierten und kontrollierten klinischen Studien. Der Mikroarray konnte für zwölf Variationen in den acht Genen Prostaglandinsynthase-1 (PTGS1), Endotheliale NO-Synthase (eNOS), Faktor V (F5), 5,10-Methylentetrahydrofolsäure-Reduktase (MTHFR), Cholesterinester-Transferprotein (CETP), Apolipoprotein E (ApoE), Prothrombin (F2) und Lipoproteinlipase (LPL) erfolgreich etabliert werden. Die Präzision des Biochips wurde anhand der Echtzeit-PCR und der Sequenzierung nachgewiesen. rnDer innovative Mikroarray ermöglicht eine einfache, schnelle und kosteneffektive Genotypisierung von wichtigen Allelen. Viele klinisch relevante Variationen für Atherosklerose können nun in nur einem Test überprüft werden. Zukünftige Studien müssen zeigen, ob die Methode eine Vorhersage über den Ausbruch der Erkrankung und eine gezielte Therapie ermöglicht. Dies wäre ein erster Schritt in Richtung präventive und personalisierter Medizin für Atherosklerose.rn