Molekulare Untersuchung des Wolf-Hirschhorn-Syndroms

Das Wolf-Hirschhorn-Syndrom (WHS) ist ein komplexes und variables Fehlbildungs- Retardierungssyndrom, das durch Deletion in der distalen Chromosomenregion 4p16.3 hervorgerufen wird und dessen Ätiologie und Pathogenese bisher weitgehend unverstanden sind. Die Zielsetzung in der vorliegenden Arbeit bestand in der Identifizierung und vorläufigen Charakterisierung neuer Gene, die an der Entstehung des Syndroms beteiligt sein könnten. Die Wolf-Hirschhorn-Syndrom-kritische Region (WHSCR) konnte zu Beginn der vorliegenden Arbeit auf einen ca. 2 Mb großen Bereich zwischen den Markern D4S43 und D4S142 eingegrenzt werden. Für die Identifizierung neuer Gene wurden zunächst drei größere genomische Cosmid-/PAC-Contigs (I-III) im Bereich der Marker D4S114 bis D4S142 erstellt und mittels Exonamplifikation auf transkribierte Bereiche (Exons) untersucht. Es konnten insgesamt 67 putative 'Exons' isoliert werden, von denen einige bereits bekannten Genen (ZNF141, PDEB, MYL5, GAK, DAGK4 und FGFR3) entsprechen. Zwei dieser Gene konnten im Rahmen dieser Arbeit erstmals (DAGK4) bzw. genauer (GAK) in die distale Region 4p16.3 kartiert werden. Die restlichen Exons können aufgrund von Homologievergleichen und/oder EST-cDNA-Homologien vermutlich neuen Genen oder auch Pseudogenen (z. B. YWEE1hu) zugeordnet werden. Durch die im Verlaufe der vorliegenden Arbeit publizierte weitere Eingrenzung der WHSCR auf einen 165 Kb-großen Bereich proximal des FGFR3-Gens konzentrierten sich weitere Untersuchungen auf die detaillierte Analyse der WHSCR zwischen dem Marker D4S43 und FGFR3. Mit Hilfe von Exonamplifikation bzw. computergestützter Auswertung vorliegender Sequenzdaten aus diesem Bereich ('GRAIL', 'GENSCAN' und Homologievergleiche in den EST-Datenbanken des NCBI) konnten mehrere neue Gene identifiziert werden. In distaler-proximaler Reihenfolge handelt es sich dabei um die Gene LETM1, 51, 43, 45, 57 und POL4P. LETM1 kodiert für ein putatives Transmembran-Protein mit einem Leucin-Zipper- und zwei EF-Hand-Motiven und könnte aufgrund seiner möglichen Beteiligung an der Ca2+-Homeostase und/oder der Signal-transduktion zu Merkmalen des WHS (Krampfanfällen, mentale Retardierung und muskuläre Hypotonie) beitragen. Das Gen 51 entspricht einem in etwa zeitgleich durch Stec et al. (1998) und Chesi et al. (1998) als WHSC1 bzw. MMSET bezeichnetem Gen und wurde daher nicht weiter charakterisiert. Es wird genauso wie das Gen 43, das zeitgleich von Wright et al. (1999b) als WHSC2 beschrieben werden konnte und eine mögliche Rolle bei der Transkriptionselongation spielt, ubiquitär exprimiert. Das in der vorliegenden Arbeit identifizierte Gen 45 zeigt demgegenüber ein ausgesprochen spezifisches Expressionsmuster (in Nervenzellen des Gehirns sowie in Spermatiden). Dies stellt zusammen mit der strukturellen Ähnlichkeit des putativen Genprodukts zu Signalmolekülen einen interessanten Zusammenhang zu Merkmalen des WHS (beispielsweise Kryptorchismus, Uterusfehlbildungen oder auch neurologische Defekte) her. Demgegenüber handelt es sich bei dem Gen 57 möglicherweise um ein trunkiertes Pseudogen des eRFS-Gens auf Chromosom 6q24 (Wallrapp et al., 1998). Das POL4P-Gen schließlich stellt allein aufgrund seiner genomischen Lokalisation sowie seiner möglichen Funktion (als DNA-Polymerase-ähnliches Gen) kein gutes Kandidatengen für spezifische Merkmale des Syndroms dar und wurde daher nicht im Detail charakterisiert. Um die Beteiligung der Gene an der Ätiologie und Pathogenese des Syndroms zu verstehen, ist die Entwicklung eines Mausmodells (über das Einfügen gezielter Deletionen in das Mausgenom) geplant. Um dies zu ermöglichen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Charakterisierung der orthologen Region bei der Maus vorgenommen. Zunächst wurden die orthologen Gene der Maus (Letm1, Whsc1, Gen 43 (Whsc2h), Gen 45 und Pol4p) identifiziert. Durch die Erstellung sowie die genaue Kartierung eines murinen genomischen P1/PAC-Klon-Contigs konnte gezeigt werden, daß die murinen Gene Fgfr3, Letm1, Whsc1, Gen 43 (Whsc2h), Gen 45 und Pol4p sowie einige weitere der überprüften EST-cDNA-Klone der Maus in einem durchgehenden Syntänieblock zwischen Mensch (POL4P bis FGFR3) und Maus (Mmu 5.20) enthalten sind, der in seiner genomischen Ausdehnung in etwa den Verhältnissen beim Menschen (zwischen POL4P und FGFR3) entspricht.

Transkriptom des Meristemgewebes des Kolumnarapfels

Kolumnare Apfelbäume (Malus x domestica) stellen aufgrund ihres auffälligen Phänotyps eine ökonomisch interessante Wuchsform dar. Diese extreme Form des Kurztriebwuchses zeichnet sich durch einen insgesamt sehr schlanken, säulenförmigen Habitus aus, welcher eine dichte Pflanzung und damit einhergehend Ertragssteigerungen im Vergleich zu normalwüchsigen Bäumen ermöglicht. Verursacht wird der Phänotyp durch die Anwesenheit eines einzelnen, dominanten Allels des Columnar (Co)-Gens. Bis auf die approximative Lokalisation des Gens auf Chromosom 10 ist über mögliche Identität und Funktion bislang nichts bekannt.rnIn der vorliegenden Arbeit wurde ein erster Versuch unternommen, mit Hilfe von Next Generation Sequencing (NGS) Technologien und RNA-Seq Einblicke in das Transkriptom des Sprossapikalmeristems (SAM) kolumnarer Apfelbäume zu gewinnen. So konnte gezeigt werden, dass unabhängig vom Zeitpunkt der Entnahme des Materials mehrere hundert Gene differentiell reguliert werden. Diese lassen sich funktional in mehrere überrepräsentierte Kategorien gruppieren, von denen sich einige wiederum mit dem kolumnaren Phänotyp assoziieren lassen. Durch den Einsatz weiterer Expressionsstudien (Microarrays, qRT-PCR) konnten frühere Ergebnisse bezüglich des Hormonhaushalts auf Genebene bestätigt und neue Erkenntnisse gewonnen werden, die eine mögliche Erklärung für den Phänotyp darstellen. Weiterhin ergab der Vergleich aller durchgeführten Expressionsstudien eine Anreicherung signifikant differentiell regulierter Gene auf Chromosom 10, was auf einen „selective sweep“ hindeutet. Eine potentielle epigenetische Regulation dieser Gene durch das Genprodukt von Co könnte daher möglich sein. Mehr als die Hälfte dieser Gene lassen sich darüber hinaus aufgrund ihrer Funktion direkt mit dem kolumnaren Phänotyp assoziieren.rnDiese Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit des Co-Allels massive Veränderungen in der Genregulation des SAMs mit sich bringt, wobei einige dieser differentiell regulierten Gene mit großer Wahrscheinlichkeit an der Etablierung des kolumnaren Phänotyps beteiligt sind. Auch wenn die Funktion des Co-Genproduktes nicht abschließend geklärt werden konnte, sind doch anhand der Resultate schlüssige Hypothesen diesbezüglich möglich.rn

Vergleich der Elastographie-gesteuerten Biopsie mit der Systembiopsie bei der Detektion von Prostatakarzinomen

Hintergrund: Die Systembiopsie gilt als Goldstandard zum Nachweis eines Prostatakarzinoms, obwohl ein relevanter Anteil an Prostatakarzinomen nicht diagnostiziert wird. Wir wollten mit unserer Arbeit die Frage beantworten, ob mittels elastographisch gezielter Biopsien die Prostatakarzinom-Detektion im Vergleich zur Goldstandard-Systembiopsie verbessert werden kann. Material und Methode: 152 Patienten wurden in einer prospektiven Studie einer 12-fachen Prostata-Systembiopsie unterzogen. In Linksseitenlagerung wurde dabei aus jedem der vordefinierten 6 Prostatasegmente je 1 laterale und 1 mediale Stanze entnommen. Elastographisch suspekte Areale wurden zusätzlich gezielt biopsiert. Als statistisch signifikant wurde p<0,05 angenommen. Ergebnisse: Bei 62 der 152 Patienten (40,8%) wurde ein Prostatakarzinom diagnostiziert. Die Detektionsrate der Systembiopsie betrug 39,5% (60/152), die Detektionsrate der Elastographie 29,6% (45/152). Somit war die Systembiopsie der elastographisch gezielten Biopsie signifikant überlegen (p=0,039).Jedoch war die Wahrscheinlichkeit mit einer Prostatastanze ein Karzinomherd zu entdecken, für die elastographischen Biopsien 3,7-fach höher als für die Systembiopsien. Die Sensitivität der Elastographie betrug 72,6% und die Spezifität 66,6%. Der positive Vorhersagewert für die Elastographie war 60%, der negative Vorhersagewert 78%. Die Kombination von Systembiopsie und elastographisch gezielten Biopsien bot die höchste Detektionsrate. In der rechten Prostatahälfte (48%) verzeichneten wir doppelt so viele elastographisch falsch-positive Befunde wie in der linken Prostatahälfte (25%). Desweiteren fanden sich am häufigsten falsch-positive Befunde im Prostata-Apex (46%) und am seltensten in der Prostata-Basis (29%). Schlussfolgerung: In unserer Studie war die elastographisch gezielte Biopsie der Systembiopsie signifikant unterlegen (p=0,039). Die Kombination von Systembiopsie mit elastographisch gezielten Biopsien bot die höchste Detektionsrate und kann daher empfohlen werden. Die Auffälligkeiten in der Segment-bezogenen Auswertung und ein möglicher Einfluss der Patienten-Lagerung müssen durch weitere Studien überprüft werden.rn

Test der Speziellen Relativitätstheorie mittels Laserspektroskopie an relativistischen 7 Li +-Ionen am ESR

Die Invarianz physikalischer Gesetze unter Lorentztransformationen ist eines der fundamentalen Postulate der modernen Physik und alle Theorien der grundlegenden Wechselwirkungen sind in kovarianter Form formuliert. Obwohl die Spezielle Relativitätstheorie (SRT) in einer Vielzahl von Experimenten mit hoher Genauigkeit überprüft und bestätigt wurde, sind aufgrund der weitreichenden Bedeutung dieses Postulats weitere verbesserte Tests von grundsätzlichem Interesse. Darüber hinaus weisen moderne Ansätze zur Vereinheitlichung der Gravitation mit den anderen Wechselwirkungen auf eine mögliche Verletzung der Lorentzinvarianz hin. In diesem Zusammenhang spielen Ives-Stilwell Experimente zum Test der Zeitdilatation in der SRT eine bedeutende Rolle. Dabei wird die hochauflösende Laserspektroskopie eingesetzt, um die Gültigkeit der relativistischen Dopplerformel – und damit des Zeitdilatationsfaktors γ – an relativistischen Teilchenstrahlen zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Ives-Stilwell Experiment an 7Li+-Ionen, die bei einer Geschwindigkeit von 34 % der Lichtgeschwindigkeit im Experimentierspeicherring (ESR) des GSI Helmholtzzentrums für Schwerionenforschung gespeichert waren, durchgeführt. Unter Verwendung des 1s2s3S1→ 1s2p3P2-Übergangs wurde sowohl Λ-Spektroskopie als auch Sättigungsspektroskopie betrieben. Durch die computergestützte Analyse des Fluoreszenznachweises und unter Verwendung optimierter Kantenfilter für den Nachweis konnte das Signal zu Rauschverhältnis entscheidend verbessert und unter Einsatz eines zusätzlichen Pumplasers erstmals ein Sättigungssignal beobachtet werden. Die Frequenzstabilität der beiden verwendeten Lasersysteme wurde mit Hilfe eines Frequenzkamms spezifiziert, um eine möglichst hohe Genauigkeit zu erreichen. Die aus den Strahlzeiten gewonnen Daten wurden im Rahmen der Robertson-Mansouri-Sexl-Testtheorie (RMS) und der Standard Model Extension (SME) interpretiert und entsprechende Obergrenzen für die relevanten Testparameter der jeweiligen Theorie bestimmt. Die Obergrenze für den Testparameter α der RMS-Theorie konnte gegenüber den früheren Messungen bei 6,4 % der Lichtgeschwindigkeit am Testspeicherring (TSR) des Max-Planck-Instituts für Kernphysik in Heidelberg um einen Faktor 4 verbessert werden.

Expressionsunterschiede verschiedener miRNAs bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen

Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen konfrontieren unsere heutige Gesellschaft mit hohen Inzidenzraten in der westlichen Welt und zunehmend steigenden Inzidenzraten im asiatischen Raum. Die Folgen für die Patienten sind eine starke Beeinträchtigung der Lebensqualität, mit sozialen und wirtschaftlichen Folgen sowie ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung kolorektaler Karzinome. Durch die Entdeckung von 22 nt langen, regulierenden RNAs, auch genannt miRNAs, wurde ein neuer Baustein im Verständnis zellulärer Regelprozesse und der Differenzierung und Aktivierung von Antworten etwa des Immunsystems entdeckt. Somit stellt sich die Frage nach der Bedeutung von miRNAs im Rahmen von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen. Hierzu wurden in dieser Arbeit über ein miRNA-Array System 12 miRNAs als potentiell relevante Ziele identifiziert und an einem Kollektiv aus insgesamt 131 Patienten und 163 Biopsien aus dem Bereich des Darmes überprüft. Es zeigte sich hierbei, dass im Rahmen eines Morbus Crohn mit Befall des Dickdarms die miRNAs let-7d und miR-22 in gesteigerter Expression vorlagen. Da im terminalen Ileum eine gesonderte Immunsituation vorliegt, wurde dieser Bereich zusätzlich bei der Erkrankung Morbus Crohn untersucht. Es zeigten sich Expressionsveränderungen für die miRNAs miR-30e, miR-185, miR-374b und miR-424. Bei Patienten mit einer Colitis ulcerosa waren die miRNAs let-7d, miR-185 und miR-424 in ihrem Expressionsverhalten verändert. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass in Abhängigkeit vom Entzündungsgrad bei bestehender Colitis ulcerosa eine zunehmenden Überexpression der miRNAs let-7d, miR-185 und miR-424 erfolgte. Die miRNAs miR-18a und miR-185 wiesen unter Remissionsbedingungen Expressionsveränderungen auf und lassen somit den Verdacht eines protektiven Effektes aufkommen. Mit Hilfe von computerbasierten Datenbankanalysen konnten gemeinsam regulierenden miRNAs Proteine und Pathways zugeordnet werden, welche einen Zusammenhang mit bereits pathogenetisch bestätigten Signalwegen wie etwa dem nF-ĸB und MAPK-Signalweg nahelegen. Auch konnte herausgearbeitet werden, dass einige, der von diesen miRNAs regulierten Proteine, bereits in veröffentlichten Arbeiten als fehlreguliert festgestellt wurden, jedoch blieb die Ursache dieser Fehlregulation gänzlich unbekannt. Mit den in dieser Arbeit erhobenen Daten konnte gezeigt werden, dass eine Kongruenz der Befunde vorliegt, welche einen Zusammenhang der miRNA-Expression mit der Fehlregulation bestimmter Proteine nicht nur nahelegt, sondern darüber hinaus auch noch einige weitere potentielle Proteinziele für weitere Untersuchungen aufführt. Dazu ist es jedoch notwendig, die Relevanz der hier entdeckten, computerbasierten Proteine in zukünftigen Untersuchungen einer genauen Prüfung zu unterziehen.