Untersuchungen zum Mechanismus der Reblausresistenz der Unterlagsrebsorte `Börner´

Der Resistenzmechanismus der Unterlagsrebsorte `Börner´ Vitis riparia x V. cinerea gegenüber dem Reblausangriff Daktulosphaira vitifoliae (Fitch) wurde histologisch, cytologisch, histochemisch und biochemisch untersucht. Je nach dem Ausmaß der Differenzierung der betroffenen Wurzelgewebe gibt es zwei verschiedene Nekrosetypen. Die Blätter reagieren auf den Reblaus-Einstich, abhängig vom Blattalter bzw. vom Differenzierungsgrad der betroffenen Gewebe, nicht nur mit zwei verschiedenen Nekrosebildungen, sondern auch mit unvollständigen Gallbildungen. Die erhobenen cytologischen, ultrastrukturellen und histochemischen Daten zeigen, dass es sich hierbei um eine Hypersensitivitäts-Reaktion bzw. um Apoptose (PCD) handelt.Nekrosen und Gallen konnten experimentell nicht mechanisch sondern nur chemisch induziert werden. IES spielt eine wichtige Rolle bei den Abwehrreaktion der Unterlagsrebsorte `Börner´ gegen Reblausangriffe.Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß die Unterlagsrebsorte `Börner` auf den Reblausangriff mit verschiedenen bzw. abgestuften Abwehrreaktionen sowohl der Wurzeln als auch der Blätter reagiert. Das deutet darauf hin, daß die Abwehrreaktionen der Unterlagsrebsorte `Börner´ von mehr als einem Gen abhängen bzw. reguliert werden. Es bleibt weiteren Forschungen vorbehalten, diese Gene und Signale zu identifizieren, um dieses Wissen gezielt in der Züchtung einsetzen zu können.

Untersuchungen zur Genexpression in Wurzeln der reblausresistenten Unterlagsrebsorte ’Börner’

Die reblausresistente Unterlagsrebsorte ’Börner’ reagiert auf einen Reblausbefall mit einer Hypersensitivitätsreaktion (HR), die sich in Form von Nekrosen an Blättern und Wurzeln zeigt. Im Rahmen dieser Dissertation wurde der Resistenzmechanismus mittels differenzieller Genexpressionsanalysen untersucht. Unter Anwendung der suppressiven subtraktiven Hybridisierung, der DNA-Microarraytechnik sowie der GeneFishingTM-Methode erfolgte ein Vergleich zwischen der Genexpression in hypersensitivem Wurzelgewebe und Normalgewebe der Unterlagsrebe ’Börner’. Neben der Reblaus induzierten HR wurde insbesondere auf die experimentelle Induktion durch das Pflanzenhormon Indol-3-Essigsäure (IES) zurückgegriffen. Damit sollten Kenntnisse über die Rolle der IES als auslösender Faktor der Resistenzreaktion gewonnen werden. Die Ergebnisse bestätigen die Annahme, dass die IES Pathogenabwehrreaktionen in ’Börner’ induziert. So konnten Hinweise auf die transkriptionelle Aktivierung Resistenz und HR assoziierter Proteine gefunden werden, wie z.B. Phytoalexine und pathogen-related (PR)-Proteine sowie Vertreter aus der hypersensitive-induced response-Familie. Es konnten weiterhin wertvolle Informationen im Hinblick auf die Transduktion des IES-Signals im Zusammenhang mit der Aktivierung von Resistenzreaktionen gewonnen werden. So wurden Hinweise auf die Beteiligung der Signalsubstanzen Ethylen, Salicylsäure, Jasmonsäure, Calcium sowie reaktiver Sauerstoffspezies gefunden. Es konnten zudem Anhaltspunkte für die Aktivierung des Auxin induzierten Ubiquitin/26S-Proteolyseweges und weiterer Signalkomponenten, wie z.B. Kinasen und Transkriptionsfaktoren, ermittelt werden. Auch auf die Beteiligung von Auxinrezeptoren konnte aufgrund der Resultate geschlossen werden. Damit war es im Rahmen der Dissertation möglich, potenzielle Signaltransduktionswege zu erarbeiten, die für weiterführende Untersuchungen des Reblausresistenzmechanismus von entscheidender Bedeutung sind.

Entwicklung molekularbiologischer Methoden zum Nachweis verschiedener Sclerotiniaceae

Botrytis cinerea ist einer der wichtigsten Phytopathogene, der im Bereich der Weinbereitung als Erreger des Edel- bzw. des Grauschimmels von Trauben eine zentrale Stellung einnimmt. Taxonomisch gehört dieser Organismus zur Familie der Sclerotiniaceae, die ausnahmslos Phytopathogene sind und weltweit große Schäden bei verschiedenen Pflanzen verursachen. Die molekularbiologische Identifikation von Vertretern dieser wichtigen Gruppe von Pflanzenpathogenen ist jedoch bis heute ein Problem. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit als Themenschwerpunkt die zweifelsfreie Identifikation einiger Vertreter der Sclerotiniaceae bearbeitet. Hier konnte von neun verschiedenen Organismen die ‚Internal Transcribed Spacer Region’ identifiziert und zusätzlich zur 18S rDNA für eine sichere Identifikation ausgeschlossen werden. Die Unterscheidung der einzelnen Gattungen und verschiedener B. cinerea-Stämme wurde mit Hilfe der neuartigen nSAPD-PCR Technologie erfolgreich überprüft. Hier konnten die drei Gattungen Botrytis, Monilinia sowie Sclerotinia zweifelsfrei differenziert werden. Ferner konnten von Monilinia fructigena, Sclerotinia minor und Sclerotinia sclerotiorum neue Laccase-Gene identifiziert und komplett sequenziert werden, die homolog zur Laccase2 (lcc2) von B. cinerea sind. Auf Basis dieser Sequenzen bzw. Sequenzunterschiede konnte eine Multiplex-PCR zur zweifelsfreien Identifi-kation dieser Spezies etabliert werden. Im Folgenden konnte dieses System auch an Umweltproben aus der Umgebung von Mainz und Wiesbaden, aus Flomborn (Rheinhessen) sowie aus Stollberg (Sachsen) überprüft werden. Anhand dieser Proben konnte gleichzeitig ein konstantes Vorkommen dieses Gens in allen über-prüften Organismen gezeigt werden. Somit ist es zum ersten Mal möglich, ver-schiedene Spezies der Sclerotiniaceae in einer Probe simultan nachzuweisen und zu differenzieren. Anschließend wurde die Laccase-Expression der jeweiligen Sclerotiniaceae überprüft. Für M. fructigena konnte mindestens eine konstitutiv exprimierte Laccase im Kulturüberstand detektiert werden. Im Gegensatz dazu zeigten weder S. minor noch S. sclerotiorum eine derartige Aktivität. Da B. cinerea lcc2 expri-miert, wurde dies auch für M. fructigena angenommen. Die reverse Transkription der codierenden mRNA konnte jedoch nicht erfolgreich durchgeführt werden. Die Analyse des Genoms von B. cinerea und S. sclerotiorum zeigte zudem 13 bzw. 8 mögliche Laccase-Gene. Somit ist es wahrscheinlich, dass M. fructigena mehr als einen codierenden Bereich für ein derartiges Enzym besitzt und somit eine oder mehrere andere Laccasen exprimiert. Auf Basis der codierenden DNA-Sequenzen konnten EDV-gestützte Prote-incharakterisierungen mit allen neu entdeckten Laccase-Sequenzen durchgeführt werden. Die hier ermittelten Eigenschaften legen den Schluss nahe, dass es sich ausnahmslos um Proteine handelt, die extrazellulär lokalisiert sind. So besitzen alle drei eine identisch lange Signalsequenz, die für die Translokation in die extra-zelluläre Matrix nötig ist. Des Weiteren zeigen alle Laccasen eine schwache Hydrophobizität, so dass davon ausgegangen werden kann, dass diese Enzyme keine membranständigen Proteine sind. Auch konnten zahlreiche Glykosylie-rungspositionen ermittelt werden und bei M. fructigena die Glykosylierung der akti-ven Laccase nachgewiesen werden. Des Weiteren konnten alle konservierten Kupferbindepositionen ermittelt werden. Der Vergleich zur mRNA der Lcc2 von B. cinerea offenbarte die lcc2 von M. fructigena drei nicht-codierende Intronse-quenzen, für S. minor und S. sclerotiorum jedoch lediglich die ersten beiden. Somit bleibt für alle neu identifizierten Sequenzen die Frage nach der Expression offen. Es wurden weder Deletionen von Nukleotiden noch frame-shift Mutationen in den einzelnen Genen gefunden. Auch geben die Signalsequenzen bzw. die ent-haltenen Kupferbindepositionen keine Aufschluss über das Ausbleiben der Ex-pression dieser Gene. Da das von B. cinerea synthetisierte ß-1,3-1,6-Glucan in der Kellerwirtschaft große Filtrationsprobleme verursacht, wurde als ein zusätzlicher Themenschwerpunkt die Lyse dieses Polymers mit symbiontischen Mikroorganismen aus Termitendär-men untersucht. Da Termiten auf den Abbau von Polymeren, wie Cellulose und Hemicellulosen spezialisiert sind, lag die Vermutung nahe, dass auch das ß-Glucan von symbiontischen Mikroorganismen hydrolysiert werden kann. In der hier vorliegenden Arbeit konnte zwar das ß-Glucan erfolgreich herge-stellt und in pulverisierter Form 5 verschiedenen Termitenspezies als Futter ange-boten werden, die anschließende Isolierung der Darmflora und die Untersuchung der isolierten Mikroorganismen auf ein mögliche glucanolytische Aktivität erbrach-te jedoch nicht den erhofften Erfolg. Hier wurden acht verschiedene filamentöse Ascomyceten bzw. Zygomyceten isoliert, eine lytische Aktivität konnte jedoch bei keiner dieser Spezies gezeigt werden.

Molecular phylogenetic inferences on the position of the Mollusca within the Lophotrochozoa

Die phylogenetische Position der Mollusken innerhalb der Trochozoa sowie die interne Evolution der Klassen der Mollusca sind weitgehend unbekannt und wurden in meiner Arbeit anhand molekularer Merkmale untersucht. Phylogenomische Analysen zeigten in der Vergangenheit eine gute Auflösung für ursprüngliche Speziationsereignisse. Daher wurden hier drei neue EST Datensätze generiert: für Sipunculus nudus (Sipuncula), Barentsia elongata (Kamptozoa) und Lepidochitona cinerea, (Polyplacophora, Mollusca). Zusätzlich wurden gezielt Gene verschiedener Mollusken mittels RT-PCR amplifiziert. rnSowohl Kamptozoen als auch Sipunculiden wurden aufgrund morphologischer Kriterien bisher als mögliche Schwestergruppe der Mollusken gehandelt, aber die hier erzielten Ergebnisse zur Evolution der Hämerythrine, Gen-Anordnungen der mitochondrialen Genome und phylogenetische Analysen der ribosomalen und der mitochondriellen Proteine stützen diese Hypothese nicht. Die Position der Kamptozoa erwies sich hier generell als unbeständig; phylogenomische Analysen deuten eine Nähe zu den Bryozoen an, aber diese Position wird stark durch die Auswahl der Taxa beeinflusst. Dagegen weisen meine Analysen klar auf eine nähere Beziehung zwischen Annelida und Sipuncula hin. Die ribosomalen Proteine zeigen Sipuncula (und Echiura) sogar als Subtaxa der Anneliden. Wie den Mollusken fehlt den Sipunculiden jegliche Segmentierung und meine Ergebnisse legen hier die Möglichkeit des Verlusts dieses Merkmals innerhalb der Anneliden bei den Sipunculiden nahe. Innerhalb der Mollusken wurden die Solenogastren bereits als Schwestergruppe aller rezenten Mollusken vorgeschlagen. Im Rahmen meiner Arbeit wurden von drei verschiedenen Solenogastren-Arten die ersten zuverlässigen 18S rRNA-Sequenzen ermittelt, und es zeigte sich, dass alle bisher veröffentlichten 18S-Sequenzen dieser Molluskenklasse höchst unvollständig oder fehlerhaft sind. rnRibosomale Proteine sind gute phylogenetische Marker und hier wurden die Auswahl und Anzahl dieser Gene für phylogenetische Analysen optimiert. Über Sonden-basierte Detektion wurde eine sampling-Strategie getestet, die im Vergleich mit standard-phylogenomischen Ansätzen zukünftige molekulare Stammbaumrekonstruktionen mit größerem Taxonsampling ermöglicht.rn

Untersuchungen zur Lebensweise und zur Populationskontrolle des Gemeinen Ohrwurms Forficula auricularia L. (Insecta, Dermaptera) in Rebanlagen

Der Gemeine Ohrwurm (Forficula auricularia LINNAEUS 1758) wurde bisher im Weinbau als natürlicher Gegenspieler verschiedener Rebschädlinge zu den Nützlingen gezählt. Etwa seit 2005 verursacht er aufgrund stark ansteigender Populationsdichten Schäden in pfälzischen Rebanlagen. Ohrwürmer halten sich massenhaft in den Trauben auf. Zusammen mit ihren Exkrementen geraten sie bei der Lese in großer Zahl ins Erntegut. Die Tiere werden von der weinbaulichen Praxis als sehr störend und qualitätsmindernd empfunden und ihre Einstufung als Nützling kritisch gesehen. Aufgrund dieser Problematik wurde im Mai 2007 ein durch den Forschungsring des Deutschen Weinbaus (FDW) finanziertes Forschungsprojekt am Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum Rheinpfalz in Neustadt an der Weinstraße begonnen. Bis 2010 wurden offene Fragen zur Erfassung und Populationsbiologie des Gemeinen Ohrwurms in Rebanlagen bearbeitet, die von ihm verursachten Schäden beschrieben und Strategien zu seiner Befallsregulation entwickelt. Am Boden aktive Ohrwürmer wurden mit Bodenfallen nach BARBER (1931) aufgenommen. In der Laubwand des Rebstockes wurden die Ohrwürmer mit eigens konzipierten Bambusfallen erfasst. F. auricularia ist in pfälzischen Rebanlagen die dominierende Ohrwurm-Art. Im Projektverlauf wurde der univoltine Entwicklungszyklus des Gemeinen Ohrwurms in pfälzischen Rebanlagen vollständig aufgeklärt. In der Vegetationsperiode beeinflussten die Intensität der Bodenbewirtschaftung mit der resultierenden Flächenbegrünung, die Bodenart, die Lufttemperatur, die Luftfeuchtigkeit und die Niederschlagsmenge die Befallsdichten am Rebstock signifikant. Der Ohrwurm-Befall in den Trauben war signifikant von der Kompaktheit und vom Gewicht der Trauben sowie dem Fäulnisanteil pro Traube und von eingewachsenen Rebblättern in den Trauben abhängig. Das Überwinterungs- und Brutverhalten wurde durch die Art und Weise der Bodenbewirtschaftung beeinflusst beziehungsweise gestört.rnLabor- und Freilandversuche haben gezeigt, dass F. auricularia Pilzpathogene wie die Graufäule (Botrytis cinerea PERSOON 1794) und den Pinselschimmel (Penicillium crustosum THOM 1930) auf gesunde Trauben überträgt. Ferner haben Fraßversuche ergeben, dass der Ohrwurm nur faule und vorgeschädigte Beeren anfressen kann und keine intakten Beeren verletzt. Durch analytische und sensorische Untersuchungen wurde festgestellt, dass Ohrwurm-Kot sensorische Fehltöne im Wein verursachen kann. Diese werden durch das im Kot enthaltene 2-Methyl-1,4-benzochinon hervorgerufen, das eine Komponente des arteigenen Abwehrsekrets ist. Da sich der Ohrwurm jahreszeitlich bedingt entweder im Boden oder am Rebstock aufhält, wurden befallsregulierende Maßnahmen im Boden- und Laubwandbereich der Rebanlage durchgeführt. Durch Tiefengrubbern mit Umbruch der Begrünung im Herbst und Frühjahr wurden die überwinternden Imagines und die Gelege geschädigt, so dass in der darauf folgenden Vegetationsperiode die Befallsdichten in der Laubwand geringfügig aber nicht signifikant abnahmen. Die während der Aufwanderungsphase der Ohrwürmer Ende Juni durchgeführte mechanische Störung der Begrünung reduzierte den Ohrwurm-Befall am Rebstock bis zu drei Wochen nach der Maßnahme signifikant. In der Laubwand der Rebstöcke wurden die Befallsdichten durch die Insektizide SpinTor (Wirkstoff Spinosad: 0,01%) und Steward® (Wirkstoff Indoxacarb: 0,0125 %) sowie sekundär durch partielles Entblättern der Laubwand dauerhaft bis zur Traubenlese reduziert. rn