Pathogenetische Bedeutung der Glutathionperoxidase-1 in der arteriellen Gefäßwand

Die antioxidative Aktivität des Enzyms Glutathionperoxidase-1 (GPx-1) schützt vor Atherosklerose und ihren Folgeerkrankungen. In einer Vorstudie konnten wir zeigen, dass der Mangel an GPx-1 die Atheroskleroseentwicklung in Apolipoprotein E defizienten (ApoE-/-) Mäusen beschleunigt und modifiziert. Allerdings sind die Verteilung der GPx-1 in atherosklerotischen Läsionen und die Mechanismen für den erhöhten Makrophagengehalt in der Läsion noch nicht geklärt. Deshalb haben wir (1) die in-situ Expression der GPx-Isoformen in atherosklerotischen Läsionen von GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Mäusen und (2) den Einfluss der GPx-1 Defizienz auf die Schaumzellbildung und Proliferation der Peritonealmakrophagen in ApoE-/- Mäusen untersucht. Die GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Weibchen wurden für 6 und 12 Wochen auf einer atherogenen „Western-type“ Diät gehalten. Die in situ-Hybridisierung zeigte, dass die verschiedenen Isoformen der GPx (GPx-1, GPx-3, GPx-4) vorwiegend in Makrophagen, nicht jedoch in glatten Muskelzellen der atherosklerotischen Läsionen von ApoE-/- Mäusen exprimiert wurden. Für die in vitro Untersuchungen wurden 5 Monate alte, GPx-1 defiziente und Wildtyp-Mäuse, gehalten auf Normaldiät, verwendet. Die Öl-Rot-O Färbung zeigte, dass die GPx-1 Defizienz die OxLDL (oxidiertes LDL) - und E-LDL (enzymatisch modifiziertes LDL) - induzierte Schaumzellbildung förderte. Darüber hinaus war die OxLDL-induzierte Cholesterinakkumulation (zellulärer Cholesterinester/ Cholesterin-Gehalt) in GPx-1 defizienten Makrophagen verstärkt, sodass ein Mangel an GPx-1 die Aufnahme von OxLDL durch Monozyten und damit die Umwandlung in Schaumzellen beschleunigt. Hinsichtlich der Proliferation zeigte sich, dass MCSF (Macrophage Colony-Stimulating Facotr) ein stärkerer Stimulus als OxLDL ist. Ein Mangel an GPx-1 fördert die Proliferation zusätzlich. Daran ist die ERK1/2 (extracellular-signal regulated kinase 1/2) - Kaskade beteiligt, denn es wurde eine schnelle Phosphorylierung der ERK1/2-Kaskade durch MCSF und/oder OxLDL nachgewiesen. Entsprechend reduzieren ERK1/2-Inhibitoren die proliferative Aktivität der Makrophagen. Die Hemmung der p38-MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase) führt zur vermehrten Proliferation und bei gleichzeitig verringerter Caspase-3/7 Aktivität der Makrophagen unabhängig von der Expression der GPx-1. Ein Mangel an GPx-1 hat auch keinen Einfluss auf die MCSF-vermittelte Aktivierung der p38-MAPK und JNK (c-Jun N-terminal kinase). Zusammenfassend läßt sich feststellen, dass die GPx-1-Defizienz einen signifikanten Einfluss auf die Schaumzellbildung und Proliferation von Makrophagen hat, was zur Beschleunigung der Atherosklerose und zu vermehrter Zellularität der entstehenden atherosklerotischen Läsionen führt. Die Proliferation wird über den ERK1/2 Signal-transduktionsweg positiv und über den p38-MAPK Weg negativ reguliert, wobei die ERK1/2-Kaskade empfindlich gegenüber oxidativem Stress bei GPx-1-Defizienz ist.

Comparative genomic sequencing analysis of a region in human chromosome 11p15.3, mouse chromosome 7 and analysis of the novel STK33, Stk33 gene

The comparative genomic sequence analysis of a region in human chromosome 11p15.3 and its homologous segment in mouse chromosome 7 between ST5 and LMO1 genes has been performed. 158,201 bases were sequenced in the mouse and compared with the syntenic region in human, partially available in the public databases. The analysed region exhibits the typical eukaryotic genomic structure and compared with the close neighbouring regions, strikingly reflexes the mosaic pattern distribution of (G+C) and repeats content despites its relative short size. Within this region the novel gene STK33 was discovered (Stk33 in the mouse), that codes for a serine/threonine kinase. The finding of this gene constitutes an excellent example of the strength of the comparative sequencing approach. Poor gene-predictions in the mouse genomic sequence were corrected and improved by the comparison with the unordered data from the human genomic sequence publicly available. Phylogenetical analysis suggests that STK33 belongs to the calcium/calmodulin-dependent protein kinases group and seems to be a novelty in the chordate lineage. The gene, as a whole, seems to evolve under purifying selection whereas some regions appear to be under strong positive selection. Both human and mouse versions of serine/threonine kinase 33, consists of seventeen exons highly conserved in the coding regions, particularly in those coding for the core protein kinase domain. Also the exon/intron structure in the coding regions of the gene is conserved between human and mouse. The existence and functionality of the gene is supported by the presence of entries in the EST databases and was in vivo fully confirmed by isolating specific transcripts from human uterus total RNA and from several mouse tissues. Strong evidence for alternative splicing was found, which may result in tissue-specific starting points of transcription and in some extent, different protein N-termini. RT-PCR and hybridisation experiments suggest that STK33/Stk33 is differentially expressed in a few tissues and in relative low levels. STK33 has been shown to be reproducibly down-regulated in tumor tissues, particularly in ovarian tumors. RNA in-situ hybridisation experiments using mouse Stk33-specific probes showed expression in dividing cells from lung and germinal epithelium and possibly also in macrophages from kidney and lungs. Preliminary experimentation with antibodies designed in this work, performed in parallel to the preparation of this manuscript, seems to confirm this expression pattern. The fact that the chromosomal region 11p15 in which STK33 is located may be associated with several human diseases including tumor development, suggest further investigation is necessary to establish the role of STK33 in human health.