Mass spectrometric identification of Varicella-Zoster Virus (VZV) proteins recognized by human T cells

Primary varicella-zoster virus (VZV) infection during childhood leads to varicella commonly known as chickenpox. After primary infection has occurred VZV establishes latency in the host. During subsequent lifetime the virus can cause reactivated infection clinically known as herpes zoster or shingles. In immunodeficient patients’ dissemination of the virus can lead to life-threatening disease. Withdrawal of acyclovir drug prophylaxis puts allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation (HSCT) patients at increased risk for herpes zoster as long as VZV-specific cellular immunity is impaired. Although an efficient live attenuated VZV vaccine for zoster prophylaxis exists, it is not approved in immunocompromised patients due to safety reasons. Knowledge of immunogenic VZV proteins would allow designing a noninfectious nonhazardous subunit vaccine suitable for patients with immunodeficiencies. The objective of this study was to identify T cell defined virus proteins of a VZV-infected Vero cell extract that we have recently described as a reliable antigen format for interferon-gamma (IFN-γ) enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assays (Distler et al. 2008). We first separated the VZV-infected/-uninfected Vero cell extracts by size filtration and reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). The collected fractions were screened for VZV reactivity with peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of VZV-seropositive healthy individuals in the sensitive IFN-γ ELISpot assay. Using this strategy, we successfully identified bioactive fractions that contained immunogenic VZV material. VZV immune reactivity was mediated by CD4+ memory T lymphocytes (T cells) of VZV-seropositive healthy individuals as demonstrated in experiments with HLA blockade antibodies and T cell subpopulations already published by Distler et al. We next analyzed the bioactive fractions with electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) techniques and identified the sequences of three VZV-derived proteins: glycoprotein E (gE); glycoprotein B (gB), and immediate early protein 62 (IE62). Complementary DNA of these identified proteins was used to generate in vitro transcribed RNA for effective expression in PBMCs by electroporation. We thereby established a reliable and convenient IFN-γ ELISPOT approach to screen PBMCs of healthy donors and HSCT patients for T cell reactivity to single full-length VZV proteins. Application in 10 VZV seropositive healthy donors demonstrated much stronger recognition of glycoproteins gE and gB compared to IE62. In addition, monitoring experiments with ex vivo PBMCs of 3 allo-HSCT patients detected strongly increased CD4+ T cell responses to gE and gB for several weeks to months after zoster onset, while IE62 reactivity remained moderate. Overall our results show for the first time that VZV glycoproteins gE and gB are major targets of the post-transplant anti-zoster CD4+ T cell response. The screening approach introduced herein may help to select VZV proteins recognized by memory CD4+ T cells for inclusion in a subunit vaccine, which can be safely used for zoster prophylaxis in immunocompromised HSCT patients.

Functional characterization of modified vaccinia virus Ankara-encoded anti-apoptotic proteins

Candidate vaccines based on the highly attenuated orthopoxvirus strain MVA are tested against various infectious and cancer diseases and, more profound, vaccines based on wildtype and recombinant viruses have been found safe and immunogenic in clinical trials. Compared to conventional vaccine strains, MVA lacks many functional genes for potentially important regulators of virus-host interactions. However, some gene functions responsible for counteraction of cellular antiviral pathways are still conserved in the genome of MVA and the inhibition of apoptosis seems to be one important mechanism, the virus is still able to interact with.rnrnVaccinia viruses encode several proteins which prevent the induction of virus-induced apoptosis. The vaccinia virus anti-apoptotic protein F1 was shown to counteract the activation of the mitochondrial pathway of apoptosis in a highly effective manner. Another vaccinia virus protein, N1, like F1 shows structural and functional similarity to members of the cellular anti-apoptotic bcl-2 family and was also shown to inhibit apoptosis. The vaccinia virus early protein E3 inhibits programmed cell death by binding to and sequestration of dsRNA molecules, normally inducing cellular antiviral pathways also driving the induction of apoptosis. All three anti-apoptotic genes were functionally analyzed during this work.rn

Optimierung einer partikulären Cytomegalovirus-Vakzine

Pränatale Infektionen mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) sind die häufigste Ursache frühkindlicher Schädigung, noch vor dem Down-Syndrom oder dem fetalen Alkoholsyndrom. Reaktivierung dieses Herpesvirus ist darüber hinaus als lebensbedrohliche Komplikation in der Transplantationsmedizin gefürchtet. Von Experten wurde daher die Entwicklung einer Vakzine vielfach angemahnt. Trotz unterschiedlicher Ansätze zu ihrer Entwicklung ist bisher jedoch kein Impfstoff verfügbar. Die Verwendung von subviralen Dense Bodies (DB) des Virus als Vakzinegrundlage stellt eine vielversprechende Strategie zur HCMV-Impfstoffentwicklung dar. DB enthalten bereits in ihrer natürlichen Form wichtige Zielantigene der humoralen und zellulären Immunantwort gegen HCMV. Durch gezielte Mutation des 230.000 Basenpaare umfassenden Genoms des HCMV konnte in Vorarbeiten der Beweis erbracht werden, dass DB hinsichtlich ihres antigenen Repertoires optimierbar sind. Allerdings waren Immunogenität und erzielte Ausbeuten noch unbefriedigend. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Ansatz der Verwendung modifizierter DB als Impfstoff-Grundlage weiter zu entwickeln und Erkenntnisse über die für die Partikelbildung entscheidenden molekularen Mechanismen zu erarbeiten. In einem ersten Abschnitt wurde der Ansatz der Modifikation von DB durch Insertion heterologer Peptidantigene in das virale Tegumentprotein pp65 verfeinert. Das pp65 ist die mengenmäßig dominante Komponente von DB. Durch Herstellung und Austestung definierter HCMV Mutanten konnte die Position 175 des pp65 als geeignete Insertionsstelle für virale wie für nicht-virale Antigene identifiziert werden. In einem zweiten Schritt der Arbeit wurde die Rolle des pp65 im Verlauf der viralen Vermehrung und Morphogenese näher untersucht. Grundlage für diese Analysen war eine Virusmutante, die eine dominant-negative Variante des pp65 exprimierte. Vergleichende massenspektrometrische Untersuchungen unter Einbeziehung von pp65-kompetenten und pp65-negativen Virusmutanten zeigten, dass pp65 in der spät-infizierten Zelle mit dem viralen RNA-Exportfaktor pUL69 und der virale Kinase pUL97 komplexiert vorkommt. Das pp65 wurde als Substrat von pUL97 identifiziert. Daneben wurden essentielle Proteine des viralen Replikationsapparates, sowie zelluläre Proteine des RNA-Metabolismus und Transports und virale DNA in diesen Komplexen gefunden. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass pp65 zu späten Zeitpunkten der viralen Infektion zu Stellen viraler DNA rekrutiert wird und dort regulatorisch in posttranskriptionelle Vorgänge von RNA Prozessierung oder RNA Transport eingreift. Die Hypothese, dass pp65 einen regulatorischen Einfluss auf die RNA-Exportfunktion von pUL69 nimmt, liegt nahe und ist nun in weiteren Analysen prüfbar.

Das Interleukin-1Beta-Rezeptor-Homolog im Modifizierten Vakziniavirus Ankara (MVA) - Charakterisierung und möglicher Einfluss auf MVA-basierte Impfvektoren

MVA ist ein attenuiertes Vakziniavirus, das durch wiederholte Passagierung von Chorioallantoisvirus Ankara auf Hühnerembryofibroblasten gewonnen wurde. Es ist bis auf wenige Ausnahmen nicht mehr in der Lage, in Säugerzellen zu replizieren, zeigt aber dennoch eine vollständige virale Proteinexpression und induziert nach Immunisierung eine zu VACV vergleichbare Immunantwort. Aus diesem Grund wurde es bereits als Impfstoff gegen die menschliche Pockenerkrankung eingesetzt, ohne hierbei die bei den klassischen Impfviren beobachtbaren Nebenwirkungen hervorzurufen. Das Genom von MVA enthält jedoch noch Immunmodulatoren, deren Deletion Ansatzpunkt für die weitere Verbesserung des Impfstoffes sein kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Deletionsmutante untersucht, bei der das Gen für den Interleukin-1β Rezeptor (IL-1βR) deletiert ist (MVA ΔIL-1βR). Es konnte nachgewiesen werden, dass der IL-1βR in murinen als auch in humanen Zellen exprimiertes IL-1β bindet und somit inaktiviert. Des Weiteren wurde gefunden, dass MVA in der Lage ist, IL-1β in antigenpräsentierenden Zellen zu induzieren, welches aber durch die Neutralisierung aufgrund des IL-1βR nur transient nachzuweisen war. Im Gegensatz dazu induzierte MVA ΔIL-1βR eine anhaltende und um ein Vielfaches erhöhte Sekretion an IL-1β. Untersuchungen in antigenpräsentierenden Zellen aus knock-out Mäusen, die verschiedene Defizienzen in den Signalwegen zur IL-1β-Induktion trugen, zeigten, dass die Sekretion von IL-1β von Caspase-1 abhängig war, welches wahrscheinlich aus der vorgeschalteten Aktivierung der NLRP3- und/oder AIM2-Inflammasomen resultierte. Interessanterweise wurden auch Caspase-1 unabhängige Mechanismen beobachtet, die auf eine Inflammasom-unabhängige IL-1β-Induktion hinweisen könnten. In Bezug auf die Immunaktivierung führte die vermehrte Sekretion von IL-1β durch MVA ΔIL-1βR vermutlich zu einer verbesserten Antigenpräsentation, die die nachfolgende T-Zellantwort beeinflusste. In Übereinstimmung mit bereits veröffentlichten Daten wurde nach Immunisierung mit MVA ΔIL-1βR eine effektivere Gedächtnis-T-Zellantwort festgestellt, deren Charakteristika und zu Grunde liegenden Mechanismen hier untersucht wurden. Jedoch konnten weder Unterschiede in weiteren pro-inflammatorischen Zytokinmustern noch im Verlauf insbesondere der CD8+ T-Zell-Aktivierung und -erhaltung zwischen MVA und MVA ΔIL-1βR beobachtet werden. Als mögliche weitere Ursache für die veränderte Gedächtnis-T-Zellantwort könnte daher eine vermehrte Stimulation durch antigenpräsentierende Zellen und eine IL-21-vermittelte bessere Unterstützungsfunktion der CD8+ Gedächtnis-T-Zellen durch CD4+ T-Zellen in Frage kommen. Zusammenfassend konnten hier neue molekulare Mechanismen, die zur Induktion von IL-1β nach einer MVA-Infektion führen, aufgedeckt werden. Darüber hinaus existieren bereits erste Hinweise auf einen Vorteil der Deletion des IL-1βR für MVA-basierte Vektorimpfstoffe. Die vorliegende Arbeit hat weitere Daten erhoben, die das Erzielen verbesserter Immunantworten nach Immunisierung mit MVA ΔIL-1βR unterstützen, woraus sich neue Ansätze für die Entwicklung MVA-basierter Impfstoffe ergeben könnten.