Analysis of the influence of epitope flanking regions on MHC class I restricted antigen presentation

Peptides presented by MHC class I molecules for CTL recognition are derived mainly from cytosolic proteins. For antigen presentation on the cell surface, epitopes require correct processing by cytosolic and ER proteases, efficient TAP transport and MHC class I binding affinity. The efficiency of epitope generation depends not only on the epitope itself, but also on its flanking regions. In this project, the influence of the C-terminal region of the model epitope SIINFEKL (S8L) from chicken ovalbumin (aa 257-264) on antigen processing has been investigated. S8L is a well characterized epitope presented on the murine MHC class I molecule, H-2Kb. The Flp-In 293Kb cell line was transfected with different constructs each enabling the expression of the S8L sequence with different defined C-terminal flanking regions. The constructs differed at the two first C-terminal positions after the S8L epitope, so called P1’ and P2’. At these sites, all 20 amino acids were exchanged consecutively and tested for their influence on H-2Kb/S8L presentation on the cell surface of the Flp-In 293Kb cells. The detection of this complex was performed by immunostaining and flow cytometry. The prevailing assumption is that proteasomal cleavages are exclusively responsible for the generation of the final C-termini of CTL epitopes. Nevertheless, recent publications showed that TPPII (tripeptidyl peptidase II) is required for the generation of the correct C-terminus of the HLA-A3-restricted HIV epitope Nef(73-82). With this background, the dependence of the S8L generation on proteasomal cleavage of the designed constructs was characterized using proteasomal inhibitors. The results obtained indicate that it is crucial for proteasomal cleavage, which amino acid is flanking the C-terminus of an epitope. Furthermore, partially proteasome independent S8L generation from specific S8L-precursor peptides was observed. Hence, the possibility of other existing endo- or carboxy-peptidases in the cytosol that could be involved in the correct trimming of the C-terminus of antigenic peptides for MHC class I presentation was investigated, performing specific knockdowns and using inhibitors against the target peptidases. In parallel, a purification strategy to identify the novel peptidase was established. The purified peaks showing an endopeptidase activity were further analyzed by mass spectrometry and some potential peptidases (like e.g. Lon) were identified, which have to be further characterized.

Charakterisierung redundanter Kerntransportsignale des minoren Kapsidproteins L2 humaner Papillomviren

Das minore Kapsidprotein L2 humaner Papillomviren wird im Laufe des HPV-Lebenszyklus zweimal in den Zellkern importiert und akkumuliert dort an den Nukleären Domänen 10 (ND10). Der erste Kernimport erfolgt in der frühen Phase der Infektion zusammen mit der Virus-DNA. Für den Zusammenbau von Virionen wird neu synthetisiertes L2-Protein ein weiteres Mal in den Kern transportiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Domäne von L2 identifiziert werden, die für den Kernimport von HPV16 L2 absolut notwendig ist. Dabei gelang es diesen Bereich auf 25 Aminosäuren einzuengen. Sowohl während der frühen Phase der Infektion als auch während der Morphogenese scheint die zentrale, basische Aminosäureregion 291-315 (mNLS) hauptverantwortlich für die Interaktion mit Kernimportrezeptoren zu sein. Möglicherweise leisten dabei flankierende Sequenzen einen Beitrag zur Stabilisierung der notwendigen Konformation. Des Weiteren gelang die Identifizierung der Aminosäuren, die für die Funktionalität des mNLS essentiell sind. Hierbei handelt es sich um ein zentrales Arginin-Motiv, bestehend aus vier dicht beieinander liegenden Argininen, dessen Mutation den Kernimport von L2 während Infektion und Morphogenese verhindert. Untersuchungen mit HPV16 und HPV18 L2-Proteinen verdeutlichten, dass es möglicherweise ein universelles Motiv zu sein scheint und in verschiedenen HPV-Typen konserviert ist. Flankiert wird dieses Arginin-Motiv von konservierten Serinen und Threoninen. Wie die Analyse von Punktmutationen zeigte, sind diese Aminosäuren für den Kernimport von L2 ohne Bedeutung. Interessanterweise verhinderte aber die Mutation TS295/6A die Kolokalisation von L2 mit ND10 im Zellkern. L2wt rekrutiert den transkriptionellen Regulator Daxx. Auch diese Funktion ging bei der Mutante TS295/6A verloren. Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur die ND10-Lokalisationsdomäne (AS 390-420) in L2 sondern auch weitere Aminosäuren oder Domänen für die Assoziation mit ND10 und die Rekrutierung von Daxx verantwortlich sein könnten. Auf der Suche nach zellulären Faktoren, die eine Rolle im mNLS-vermittelten Kernimport spielen, wurde zunächst die Bedeutung von Hsc70 untersucht. Während der Morphogenese maskiert Hsc70 den C-Terminus von L2 und verhindert damit unerwünschte Interaktionen mit Mikrotubuli im Zytoplasma. Es existieren aber weitere noch unbekannte Hsc70-Bindedomänen in L2, die möglicherweise den Kernimport ebenfalls beeinflussen können. Wie die Untersuchungen deutlich machten, ist der zentrale, basische Bereich von L2 aber nicht mit Hsc70 assoziiert und der mNLS-vermittelte Kernimport findet unabhängig von Hsc70 statt. In einem siRNA-Screen wurde anschließend die Rolle von Karyopherinen während der Infektion untersucht. Sowohl Kapß2-siRNA als auch Kapß3-siRNA waren in der Lage unabhängig voneinander die Infektion von HPV16-Pseudovirionen zu reduzieren. Für beide Karyopherine konnte in der Vergangenheit in vitro die Interaktion mit HPV16 L2 nachgewiesen werden. Das L2-Protein ist das einzige virale Protein, das während der Infektion die Virus-DNA in den Kern begleitet (Day et al., 2004). Demzufolge ist es auch das einzige virale Protein, das mit Importinen während der Infektion interagiert. Möglicherweise sind also beide Karyopherine in der Lage sein L2 während der Infektion in den Kern zu importieren. Abschließend wurden Präzipitationsversuche durchgeführt, die zur Identifizierung möglicher Bindungspartner des mNLS führen sollten. In diesen Versuchen konnte eine erhöhte Bindungsaffiniät zu den beiden Importinen Kapß1 und Kapß2 festgestellt werden. Möglicherweise ist das L2-Protein mit seiner mNLS in der Lage mehrere Importrezeptoren zu binden und für den Kernimport zu nutzen. Eines dieser Importine ist Kapß2. Dieser Importrezeptor scheint sowohl bei der Infektion als auch während der Morphogenese den Kernimport von L2 durch die Bindung an das mNLS zu vermitteln.

Charakterisierung zellulärer Interaktionspartner des großen Hüllproteins des Hepatitis-B-Virus

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand das große L-Hüllprotein (L) des Hepatitis B - Virus. L bildet eine ungewöhnliche duale Topologie in der ER-Membran aus, welche auch im reifen Viruspartikel erhalten bleibt. In einem partiellen, posttranslationalen Reifungsprozess wird die sogenannte PräS-Region von der zytosolischen Seite der Membran aus in das ER-Lumen transloziert. Aufgrund seiner dualen Topologie und der damit verbundenen Multifunktionalität übernimmt L eine Schlüsselfunktion im viralen Lebenszyklus. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag deshalb darin, neue zelluläre Interaktionspartner des L-Hüllproteins zu identifizieren. Ihre Analyse sollte helfen, das Zusammenspiel des Virus mit der Wirtszelle besser zu verstehen. Hierfür wurde das Split - Ubiquitin Hefe - Zwei - Hybrid System eingesetzt, das die Interaktionsanalyse von Membranproteinen und Membran-assoziierten Proteinen ermöglicht. Zwei der neu identifizierten Interaktionspartner, der v-SNARE Bet1 und Sec24A, die Cargo-bindende Untereinheit des CoPII-vermittelten vesikulären Transports, wurden weitergehend im humanen Zellkultursystem untersucht. Sowohl für Bet1 als auch für Sec24A konnte die Interaktion mit dem L-Hüllprotein bestätigt und der Bindungsbereich eingegrenzt werden. Die Depletion des endogenen Bet1 reduzierte die Freisetzung L-haltiger, nicht aber S-haltiger subviraler Partikel (SVP) deutlich. Im Gegensatz zu Bet1 interagierte Sec24A auch mit dem mittleren M- und kleinen S-Hüllprotein von HBV. Die Inhibition des CoPII-vermittelten vesikulären Transportweges durch kombinierte Depletion der vier Sec24 Isoformen blockierte die Freisetzung sowohl L- als auch S-haltiger SVP. Dies bedeutet, dass die HBV - Hüllproteine das ER CoPII-vermittelt verlassen, wobei sie aktiv Kontakt zur Cargo-bindenden Untereinheit Sec24A aufnehmen. Der effiziente Export der Hüllproteine aus dem ER ist für die Virusmorphogenese und somit für den HBV - Lebenszyklus essentiell. rnEin weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit basierte auf der Interaktion des L-Hüllproteins mit dem ER-luminalen Chaperon BiP. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob BiP, ähnlich wie das zytosolische Chaperon Hsc70, an der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins beteiligt ist. Hierfür wurde BiP durch die ektopische Expression seiner Ko-Chaperone BAP und ERdj4 in seiner Substrat-bindenen Kapazität manipuliert. ERdj4, ein Mitglied der Hsp40 - Proteinfamilie, stimuliert die ATPase-Aktivität von BiP, was die Substratbindung stabilisiert. Der Nukleotid - Austauschfaktor BAP hingegen vermittelt die Auflösung des BiP - Substrat - Komplexes. Die Auswirkung der veränderten in vivo-Aktivität von BiP auf die posttranslationale PräS-Translokation wurde mit Proteaseschutz - Versuchen untersucht. Die ektopische Expression des positiven als auch des negativen Regulators von BiP resultierte in einer drastischen Reduktion der posttranslationalen PräS-Translokation. Ein vergleichbarer Effekt wurde nach Manipulation des BiP ATPase - Zyklus durch Depletion der zellulären ATP - Konzentration beobachtet. Dies spricht dafür, dass das ER-luminale Chaperon BiP, zusammen mit Hsc70, eine zentrale Rolle in der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins spielt. rnZwei weitere Proteine, Sec62 und Sec63, die sich für die posttranslationale Translokation in der Hefe als essentiell erwiesen haben, wurden in die Analyse der dualen Topologie des L-Hüllproteins einbezogen. Interessanterweise konnte eine rein luminale Ausrichtung der PräS-Region nach kombinierter Depletion des endogenen Sec62 und Sec63 beobachtet werden. Dies deutet an, dass sowohl Sec62 als auch Sec63 an der Ausbildung der dualen Topologie des L-Hüllproteins beteiligt sind. In Analogie zur Posttranslokation der Hefe könnte Sec62 als Translokon-assoziierter Rezeptor für Substrate der Posttranslokation, und damit der PräS-Region, dienen. Sec63 könnte mit seiner J-Domäne BiP zum Translokon rekrutieren und daraufhin dessen Substrat-bindende Aktivität stimulieren. BiP würde dann, einer molekularen Ratsche gleich, die PräS-Region durch wiederholtes Binden und Freisetzen aktiv in das ER-Lumen hereinziehen, bis eine stabile duale Topologie des L-Hüllproteins ausgebildet ist. Die Bedeutung von Sec62 und Sec63 für den HBV - Lebenszyklus wird dadurch untermauert, dass sowohl die ektopische Expression als auch die Depletion des endogenen Sec63 die Freisetzung L-haltiger SVP deutlich reduziert. rn

Isolation and characterization of a manganese oxidizing bacterium from the Mediterranean marine sponge Suberites domuncula

In the present study of sponge-bacterial association, the presence of a marine bacterium which has not seen to be associated previously with the Mediterranean sponge Suberites domuncula was investigated. The marine sponge S. domuncula was chosen as the subject of investigation, for the identification of potential symbiotic microorganisms, since it can be kept under controlled laboratory conditions for over five years. By the use of specialized media assisting in the growth of a metal oxidizing bacterium, the manganese oxidizing bacterium was isolated from the surface of the marine sponge. The bacterium so isolated was characterized for its growth characteristics by microbiological and biochemical techniques, a detailed analysis of which showed that the bacterium followed a life cycle where the culture showed the presence of spore forming bacteria. This was correlated to the manganese oxidation activity of the bacteria and it was found that both stages are interdependent.The action of the protein responsible for carrying out the manganese (Mn) oxidation was studied by an in-gel oxidation assay, and the presence of a multi copper oxidase was confirmed by the use of copper chelators in the buffer. In parallel the effect of addition of copper was observed on the manganese oxidation by the bacteria thus supporting the observations. The manganese oxidation reaction by the bacteria was determined in the culture medium and on the surface of the cells, and it could be concluded that the oxidation was facilitated by the presence of the polysaccharides and proteins on the surface of the cells.Thus the presence of a bacterium capable of oxidizing the manganese from the surroundings was confirmed to be symbiotically associated with the marine sponge S. domuncula by monitoring its growth in axenic cultures. The reasons behind this association were studied.This bacterium displays a crucial role in the physiology/metabolism of the sponge by acting as a reversible Mn store in S. domuncula. According to this view, the presence of SubDo-03 bacteria is required as a protection against higher, toxic concentrations of Mn in the environment; manganese (II) after undergoing oxidation to manganese (IV), becomes an insoluble ion. Since only minute levels of manganese exist in the surrounding seawater a substantial accumulation of manganese has to arise, or a release by the bacterial-precipitated manganese (IV) is implicated to maintain the reversible balance. The other possible benefits provided by the bacterial association to the sponge could be in preventing cellular oxygen toxicity, help in nutrient scavenging and detoxification.

Untersuchungen zur Lebensweise und zur Populationskontrolle des Gemeinen Ohrwurms Forficula auricularia L. (Insecta, Dermaptera) in Rebanlagen

Der Gemeine Ohrwurm (Forficula auricularia LINNAEUS 1758) wurde bisher im Weinbau als natürlicher Gegenspieler verschiedener Rebschädlinge zu den Nützlingen gezählt. Etwa seit 2005 verursacht er aufgrund stark ansteigender Populationsdichten Schäden in pfälzischen Rebanlagen. Ohrwürmer halten sich massenhaft in den Trauben auf. Zusammen mit ihren Exkrementen geraten sie bei der Lese in großer Zahl ins Erntegut. Die Tiere werden von der weinbaulichen Praxis als sehr störend und qualitätsmindernd empfunden und ihre Einstufung als Nützling kritisch gesehen. Aufgrund dieser Problematik wurde im Mai 2007 ein durch den Forschungsring des Deutschen Weinbaus (FDW) finanziertes Forschungsprojekt am Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum Rheinpfalz in Neustadt an der Weinstraße begonnen. Bis 2010 wurden offene Fragen zur Erfassung und Populationsbiologie des Gemeinen Ohrwurms in Rebanlagen bearbeitet, die von ihm verursachten Schäden beschrieben und Strategien zu seiner Befallsregulation entwickelt. Am Boden aktive Ohrwürmer wurden mit Bodenfallen nach BARBER (1931) aufgenommen. In der Laubwand des Rebstockes wurden die Ohrwürmer mit eigens konzipierten Bambusfallen erfasst. F. auricularia ist in pfälzischen Rebanlagen die dominierende Ohrwurm-Art. Im Projektverlauf wurde der univoltine Entwicklungszyklus des Gemeinen Ohrwurms in pfälzischen Rebanlagen vollständig aufgeklärt. In der Vegetationsperiode beeinflussten die Intensität der Bodenbewirtschaftung mit der resultierenden Flächenbegrünung, die Bodenart, die Lufttemperatur, die Luftfeuchtigkeit und die Niederschlagsmenge die Befallsdichten am Rebstock signifikant. Der Ohrwurm-Befall in den Trauben war signifikant von der Kompaktheit und vom Gewicht der Trauben sowie dem Fäulnisanteil pro Traube und von eingewachsenen Rebblättern in den Trauben abhängig. Das Überwinterungs- und Brutverhalten wurde durch die Art und Weise der Bodenbewirtschaftung beeinflusst beziehungsweise gestört.rnLabor- und Freilandversuche haben gezeigt, dass F. auricularia Pilzpathogene wie die Graufäule (Botrytis cinerea PERSOON 1794) und den Pinselschimmel (Penicillium crustosum THOM 1930) auf gesunde Trauben überträgt. Ferner haben Fraßversuche ergeben, dass der Ohrwurm nur faule und vorgeschädigte Beeren anfressen kann und keine intakten Beeren verletzt. Durch analytische und sensorische Untersuchungen wurde festgestellt, dass Ohrwurm-Kot sensorische Fehltöne im Wein verursachen kann. Diese werden durch das im Kot enthaltene 2-Methyl-1,4-benzochinon hervorgerufen, das eine Komponente des arteigenen Abwehrsekrets ist. Da sich der Ohrwurm jahreszeitlich bedingt entweder im Boden oder am Rebstock aufhält, wurden befallsregulierende Maßnahmen im Boden- und Laubwandbereich der Rebanlage durchgeführt. Durch Tiefengrubbern mit Umbruch der Begrünung im Herbst und Frühjahr wurden die überwinternden Imagines und die Gelege geschädigt, so dass in der darauf folgenden Vegetationsperiode die Befallsdichten in der Laubwand geringfügig aber nicht signifikant abnahmen. Die während der Aufwanderungsphase der Ohrwürmer Ende Juni durchgeführte mechanische Störung der Begrünung reduzierte den Ohrwurm-Befall am Rebstock bis zu drei Wochen nach der Maßnahme signifikant. In der Laubwand der Rebstöcke wurden die Befallsdichten durch die Insektizide SpinTor (Wirkstoff Spinosad: 0,01%) und Steward® (Wirkstoff Indoxacarb: 0,0125 %) sowie sekundär durch partielles Entblättern der Laubwand dauerhaft bis zur Traubenlese reduziert. rn

Automatische objektive Identifikation und Berechnung der Eigenschaften von Rossbywellenzügen

In dieser Arbeit wird eine Methode entwickelt, die Rossbywellenzüge automatisch identifiziert und und deren Eigenschaften quantifiziert. Mit dieser Methode wird der Wellenzug als eine Einheit in Raum und Zeit interpretiert. Einheit im Raum heißt, dass nicht die einzelnen Tröge und Rücken eines Wellenzugs betrachtet werden, sondern deren Einhüllende. Einheit in der Zeit bedeutet, dass der Wellenzug nicht nur zu einem Zeitpunkt betrachtet wird, sondern über seine gesamte Lebensdauer hinweg. Um den Wellenzug als räumliche und zeitliche Einheit zu erhalten, werden die Einhüllenden der Wellenzüge in Längengrad-Zeit Diagrammen, sogenannten Hovmöllerdiagrammen, betrachtet. Dort werden zusammenhängende Regionen als Objekte, die jeweils einen Wellenzug repräsentieren, identifiziert. Deren Eigenschaften werden dann automatisch berechnet. Diese Eigenschaften können nun direkt dem zugrunde liegenden Rossbywellenzug zugeordnet werden.rnDie neue Methode wird in zwei verschiedenen Szenarien angewendet: erstens zur Beurteilung der Vorhersagequalität eines einzelnen Rossbywellenzugs und zweitens für die klimatologische Betrachtung von Rossbywellenzügen im ERA-40 Reanalysedatensatz. Sie wurde weiterhin mit bisher verwendeten Methoden zur Identifikation und Quantifizierung von Rossbywellenzügen verglichen.rnDie Untersuchung der Vorhersagequalität ergab, dass in dem betrachteten Fall die Übereinstimmung der Vorhersage mit der Analyse des Wellenzugs gering war, sofern das Modell initialisiert wurde, bevor der Rossbywellenzug eingesetzt hatte. Im Gegensatz dazu nahm die Vorhersagequalität deutlich zu, wenn der Wellenzug bereits in den Vorhersagedaten enthalten war. Dies deutet darauf hin, dass es in dem vorliegenden Fall problematisch ist, mit dem Modell den Auslösemechanismus korrekt voherzusagen. Für die weitere Untersuchung der Vorhersagequalität wurde eine spezielle Art der Darstellung der Daten verwendet, mit deren Hilfe deutlich wurde, dass das verwendete Modell in der Lage ist, diesen Wellenzug ungefähr sechs Tage im Voraus vorherzusagen. Diese Zeitspanne ist deutlich kürzer als die Lebensdauer des Wellenzugs, die etwa 10 Tage beträgt.rnIm Rahmen der klimatologischen Studie ergab sich eine positive Korrelation zwischen der Lebensdauer eines Rossbywellenzugs und des Bereichs den dieser Wellenzug während seiner gesamten Existenz in zonaler Richtung überstreicht. Für Wellenzüge mit einer kurzen Lebensdauer ergab sich eine ebenfalls positive Korrelation zwischen der mittleren Amplitude und der Dauer des Wellenzugs. Für eine längere Lebensdauer geht diese Korrelation aber in eine Sättigung über und die mittlere Amplitude steigt nicht mehr weiter an. Als eine mögliche Erklärung für dieses Verhalten wird angeführt, dass eine gewisse Stärke der Amplitude benötigt wird um stromabwärtige Entwicklung zu erhalten aber zu große Amplituden im Allgemeinen zum Brechen der Welle führen. Das Brechen leitet den letzten Abschnitt im Lebenszyklus eines Rossbywellenzuges ein, welcher im Anschluss meist zerfällt. Ein weiteres Ergebnis der klimatologischen Untersuchung ist das Auffinden bevorzugter Regionen der Entstehung und des Abklingens von Rossbywellenzügen. Diese Regionen unterscheiden sich erheblich für Rossbywellenzüge unterschiedlicher minimaler Lebensdauer. Langlebige Rossbywellenzüge entstehen demnach hauptsächlich über Ostasien und dem Westpazifik und vergehen dann über Europa.rnSchließlich wurde die entwickelte Methode in einen systematischen Vergleich anderer Methoden zur Identifikation und Quantifizierung von Rossbywellenzügen eingereiht. Die betrachteten Methoden beinhalten verschiedene Trog-und-Rücken Hovmöllerdiagramme des Meridionalwindes, Methoden die Rossbywellenzüge als eine Einheit identifizieren und Methoden die den Beitrag verschiedener physikalischer Aspekte zu der Entwicklung von Rossbywellenenzügen quantifizieren. Der Vergleich macht deutlich, dass jede Methode ihre individuellen Stärken und Schwächen hat. Dies bedeutet insbesondere, dass die Eignung der Methode von dem Stadium des Lebenszyklus, in dem sich der Rossbywellenzug befindet und dem Fokus, den man bei der Betrachtung hat, abhängt. Ideal ist eine Kombination mehrerer Methoden, da dies ein vollständigeres Bild eines Rossbywellenzuges ergibt als einzelne Methoden es zu liefern vermögen. Obwohl alle Methoden für die Anwendungen, für die sie jeweils konzipiert wurden, geeignet sind, ergeben sich bei der Diagnose der Rossbywellenzüge beträchtliche Unterschiede. Letztendlich stellt sich heraus, dass sogar die Defintion eines Rossbywellenzugs bis zu einem gewissen Grad von der zu seiner Identifizierung verwendeten Methode abhängt.