Molecular interaction of the human metalloprotease meprin beta with the amyloid precursor protein, ADAM10, and ADAM17 based on proteomics

Die Zinkendopeptidasen Meprin α und β sind Schlüsselkomponenten in patho(physiologischen) Prozessen wie Entzündung, Kollagenassemblierung und Angiogenese. Nach ihrer Entdeckung in murinen Bürstensaummembranen und humanen Darmepithelien, wurden weitere Expressionsorte identifiziert, z.B. Leukozyten, Krebszellen und die humane Haut. Tiermodelle, Zellkulturen und biochemische Analysen weisen auf Funktionen der Meprine in der Epithelialdifferenzierung, Zellmigration, Matrixmodellierung, Angiogenese, Bindegewebsausbildung und immunologische Prozesse hin. Dennoch sind ihre physiologischen Substrate weitgehend noch unbekannt. Massenspektrometrisch basierte Proteomics-Analysen enthüllten eine einzigartige Spaltspezifität für saure Aminosäurereste in der P1´ Position und identifizierten neue biologische Substratkandidaten. Unter den 269 extrazellulären Proteinen, die in einem Substratscreen identifiziert wurden, stellten sich das amyloid precursor protein (APP) and ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10) als sehr vielversprechende Kandidaten heraus. Mehrere Schnittstellen innerhalb des APP Proteins, hervorgerufen durch verschiedenen Proteasen, haben unterschiedlichen Auswirkungen zur Folge. Die β-Sekretase BACE (β-site APP cleaving enzyme) prozessiert APP an einer Schnittstelle, welche als initialer Schritt in der Entwicklung der Alzheimer Erkrankung gilt. Toxische Aβ (Amyloid β)-Peptide werden in den extrazellulären Raum freigesetzt und aggregieren dort zu senilen Plaques. Membran verankertes Meprin β hat eine β-Sekretase Aktivität, die in einem Zellkultur-basierten System bestätigt werden konnte. Die proteolytische Effizienz von Meprin β wurde in FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-Analysen bestimmt und war um den Faktor 104 höher als die von BACE1. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Meprin β die ersten zwei Aminosäuren prozessiert und somit aminoterminal einen Glutamatrest freisetzt, welcher nachfolgend durch die Glutaminylzyklase in ein Pyroglutamat zykliert werden kann. Trunkierte Aβ-Peptide werden nur in Alzheimer Patienten generiert. Aufgrund einer erhöhten Hydrophobie weisen diese Peptide eine höhere Tendenz zur Aggregation auf und somit eine erhöhte Toxizität. Bis heute wurde keine Protease identifiziert, welche diese Schnittstelle prozessiert. Die Bildung der Meprin vermittelten N-terminalen APP Fragmenten wurde in vitro und in vivo detektiert. Diese N-APP Peptide hatten keine cytotoxischen Auswirkungen auf murine und humane Gehirnzellen, obwohl zuvor N-APP als Ligand für den death receptor (DR) 6 identifiziert wurde, der für axonale Degenerationsprozesse verantwortlich ist. rnIm nicht-amyloidogenen Weg prozessiert ADAM10 APP und entlässt die Ektodomäne von der Zellmembran. Wir konnten das ADAM10 Propeptid als Substrat von Meprin β identifizieren und in FRET Analysen, in vitro und in vivo zeigen, dass die Meprin vermittelte Prozessierung zu einer erhöhten ADAM10 Aktivität führt. Darüber hinaus wurde ADAM10 als Sheddase für Meprin β identifiziert. Shedding konnte durch Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) oder durch das Ionophor A23187 hervorgerufen werden, sowie durch ADAM10 Inhibitoren blockiert werden. rnDiese Arbeit konnte somit ein komplexes proteolytisches Netwerk innerhalb der Neurophysiologie aufdecken, welches für die Entwicklung der Alzheimer Demenz wichtig sein kann.rn

Überexpression und Charakterisierung des extrazellulären Teils der humanen alpha-Sekretase ADAM10

„ÜBEREXPRESSION UND CHARAKTERISIERUNG DES EXTRAZELLULÄREN TEILS DER HUMANEN alpha-SEKRETASE ADAM10“ ALEXANDRA LEPTICH Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei enzymatisch aktive lösliche Proteinvarianten der humanen alpha-Sekretase ADAM10 in Insektenzellen exprimiert, gereinigt und charakterisiert. Dabei entsprach eine der löslichen ADAM10-Varianten dem extrazellulären Bereich des Typ-I-Membranproteins, d.h. ihr fehlte die Transmembran- und cytoplasmatische Domäne. Die zweite Variante stimmt mit einer im menschlichen Gehirn auf mRNA-Ebene nachgewiesenen Splicevariante überein, die zusätzlich noch durch das Fehlen der Cystein-reichen Domäne gekennzeichnet ist. Die alpha-Sekretase ADAM10 spielt eine wichtige Rolle bei der nicht-amyloidogenen Prozessierung des Amyloid-Vorläufer-Proteins (APP). Dabei erfolgt dessen Spaltung innerhalb der beta-Amyloidsequenz, so dass die Produktion von Abeta-Peptiden und damit die Bildung von Amyloid-Plaques während der Alzheimer’schen Erkrankung verhindert wird. Nach der Expression der beiden löslichen ADAM10-Proteine in Insektenzellen erfolgte die Reinigung der prozessierten und damit reifen Enzymform der jeweiligen ADAM10-Proteinvariante mittels Lektin-Affinitätschromatographie. Die anschließende Charakterisierung der beiden löslichen ADAM10-Proteine erfolgte durch einen auf HPLC-Analyse basierenden Enzymtest. Dabei wurden verschiedene sich von der beta-Amyloid-Sequenz ableitenden Peptidsubstrate in vitro eingesetzt, die zum einen den Aminosäuren 11-28 der Abeta-Sequenz, zum anderen dem kompletten Abeta40-Peptid entsprachen und damit die charakteristische alpha-Sekretasespaltstelle des Amyloid-Vorläufer-Proteins enthielten. Des Weiteren kamen jeweils entsprechende Peptidsubstrate zum Einsatz, die an den Positionen 21 und 22 der Abeta- Peptidsequenz vorkommenden Mutationen trugen. Die gewählten Abeta-Substrate konnten durch die löslichen Varianten der alpha-Sekretase ADAM10 an der alpha-Sekretasestelle gespalten werden. Dabei konnte bei den Abeta11-28-Peptiden deutlich die in der Literatur beschriebene Abhängigkeit der Spaltung von der a-helicalen Struktur des Substrats beobachtet werden, während bei den längeren Abeta40-Peptide diesbezüglich kein Zusammenhang hergestellt werden konnte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ADAM10 hauptsächlich als alpha-Sekretase wirkt, weniger als ein Abeta-degradierendes Enzym. Ferner konnte unter Verwendung entsprechender muriner und humaner Abeta-Peptide eine verstärkte Spaltung der murinen Substrate Abeta1-28 und Abeta1-40 durch den extrazellulären Teil von ADAM10 in vitro gezeigt werden. Dieser Versuch bestätigt die Annahme, dass es bei Nagetieren durch die Bevorzugung der nichtamyloidogenen Prozessierung von APP durch die alpha-Sekretase ADAM10 zu keiner Bildung von Amyloid-Plaques kommt. Ein Einfluss auf die Spaltung von membrangebundenem APP und damit der Bildung von neuroprotektivem sAPPalpha durch die löslichen ADAM10-Proteine konnte im Zellsystem nicht beobachtet werden. Vielmehr scheint hier die Membranverankerung von Enzym und Substrat eine wichtige Voraussetzung zu bilden. Des Weiteren konnten die löslichen ADAM10-Proteine durch ein für die Inhibierung von ADAM10 spezifische Hydroxamat-Derivat in ihrer enzymatischen Aktivität gehemmt werden. Die exprimierten ADAM10-Proteine weisen die charakteristischen Eigenschaften der alpha-Sekretase ADAM10 auf, wobei deutlich wurde, dass das Fehlen der Cystein-reichen Domäne keinen Einfluss auf die Fähigkeit der katalytischen Domäne zur Substrat- und Inhibitorbindung hatte. Auch die Stabilität des Enzyms wurde durch das Fehlen der Domäne nicht negativ beeinträchtigt. Eine wichtige Aufgabe stellt nun der Nachweis der löslichen ADAM10-Proteine sowie die Identifizierung ihrer potentiellen Substrate und deren Lokalisation in vivo dar.

LPS-induced modifications in spontaneous network activity causes neuronal apoptosis in neonatal cerebral cortex

During the perinatal period the developing brain is most vulnerable to inflammation. Prenatal infection or exposure to inflammatory factors can have a profound impact on fetal neurodevelopment with long-term neurological deficits, such as cognitive impairment, learning deficits, perinatal brain damage and cerebral palsy. Inflammation in the brain is characterized by activation of resident immune cells, especially microglia and astrocytes whose activation is associated with a variety of neurodegenerative disorders like Alzheimer´s disease and Multiple sclerosis. These cell types express, release and respond to pro-inflammatory mediators such as cytokines, which are critically involved in the immune response to infection. It has been demonstrated recently that cytokines also directly influence neuronal function. Glial cells are capable of releaseing the pro-inflammatory cytokines MIP-2, which is involved in cell death, and tumor necrosis factor alpha (TNFalpha), which enhances excitatory synaptic function by increasing the surface expression of AMPA receptors. Thus constitutively released TNFalpha homeostatically regulates the balance between neuronal excitation and inhibition in an activity-dependent manner. Since TNFalpha is also involved in neuronal cell death, the interplay between neuronal activity MIP-2 and TNFalpha may control the process of cell death and cell survival in developing neuronal networks. An increasing body of evidence suggests that neuronal activity is important in the regulation of neuronal survival during early development, e.g. programmed cell death (apoptosis) is augmented when neuronal activity is blocked. In our study we were interested on the impact of inflammation on neuronal activity and cell survival during early cortical development. To address this question, we investigated the impact of inflammation on neuronal activity and cell survival during early cortical development in vivo and in vitro. Inflammation was experimentally induced by application of the endotoxin lipopolysaccharide (LPS), which initiates a rapid and well-characterized immune response. I studied the consequences of inflammation on spontaneous neuronal network activity and cell death by combining electrophysiological recordings with multi-electrode arrays and quantitative analyses of apoptosis. In addition, I used a cytokine array and antibodies directed against specific cytokines allowing the identification of the pro-inflammatory factors, which are critically involved in these processes. In this study I demonstrated a direct link between inflammation-induced modifications in neuronal network activity and the control of cell survival in a developing neuronal network for the first time. Our in vivo and in vitro recordings showed a fast LPS-induced reduction in occurrence of spontaneous oscillatory activity. It is indicated that LPS-induced inflammation causes fast release of proinflammatory factors which modify neuronal network activity. My experiments with specific antibodies demonstrate that TNFalpha and to a lesser extent MIP-2 seem to be the key mediators causing activity-dependent neuronal cell death in developing brain. These data may be of important clinical relevance, since spontaneous synchronized activity is also a hallmark of the developing human brain and inflammation-induced alterations in this early network activity may have a critical impact on the survival of immature neurons.