Identifizierung und Charakterisierung neuer Proteine des Abwehrsystems der Porifera - ein Apoptoseregulator und ein antimikrobielles Protein aus dem Schwamm Suberites domuncula

Aufgrund ihrer Lebensweise und -umgebung sind effiziente Strategien zur Abwehr bedrohender Einflüsse essentiell für die Porifera. Eine dieser Strategien stellen die Apoptose in höheren Metazoen, sowie ein effizientes Immunsystem dar. Diese sichern sowohl das Überleben des Organismus als auch die Entfernung beschädigter, infizierter oder redundanter Zellen. Bei Untersuchungen der Porifera auf Moleküle, die an diesen Prozessen beteiligt sind, konnten in den letzten Jahren beachtliche Erfolge erzielt werden. So konnten das in der Apoptose involvierte Protein GCDD2 (proapoptotisch), die antiapoptotischen GCBHP1 und GCBHP2 Proteine (Wiens et al., 2001), sowie ein LPS induzierbarer TNF (Wiens et al., 2007) und zwei Caspasen (Wiens et al., 2003) in Schwämmen identifiziert werden. Um diese essentiellen Mechanismen besser verstehen zu können, sollte ein möglicher Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor identifiziert werden. Hierzu wurde die SpongeBase Datenbank nach Proteinen mit Todesdomänen durchsucht und diese unter Anwendung von PCR- und Screening-Techniken in einer cDNA-Bank des marinen Schwammes S. domuncula komplettiert. Im Anschluss an ihre Sequenzierung wurde ein Klon ausgewählt, dessen Todesdomäne größte Homologie zu einem TNFR zeigte. Dieser Klon SD_TNFR-like (Suberites domuncula TNFR-homologes Protein) wurde anschließend diversen Sequenz- und Strukturanalysen unterzogen. Diese offenbarten die Existenz zweier funktional bedeutsamer Domänen (Ubiquitin-like und Todesdomäne). Vor allem die Todesdomäne impliziert eine Beteiligung des Proteins an apoptotischen Prozessen. Über einen „Yeast Two Hybrid Screen“ sollten Proteine identifiziert werden, welche mit dem Ausgangsprotein interagieren. Hierbei wurde ein Protein identifiziert, das Ähnlichkeit mit einem antimikrobiellen Peptid aufweist. Dieses Protein kann analog zu einer Gruppe von antimikrobiellen Peptiden, den α-helikalen kationischen Peptiden, in drei Teile gespalten werden. Das Signalpeptid sowie ein anionisches Propeptid werden abgespalten und es entsteht ein kationisches, antimykotisch wirksames Peptid. Beide Proteine sollten, sofern sie in die Abwehrreaktionen involviert sind, durch Inkubation mit mikrobiellen Strukturen vermehrt exprimiert werden. Eine Überprüfung der Transkription mittels Northern Blot Analysen bestätigte dies für das SD_TNFR-like nach Inkubation mit LPS und TNF- α sowie für SD_Brevinin-like nach Inkubation mit LPS, PAM und Hefe. Mit der Herstellung eines rekombinanten SD_TNFR-like-Proteins wurde die Immunisierung von Kaninchen und die folgende Gewinnung eines polyklonalen SD_TNFR-like-Antikörpers ermöglicht. Dieser gestattete den Nachweis der SD_TNFR-like -Expression mittels Western Blot-Analysen sowie die stressinduzierte erhöhte Expression mittels Dot Blot-Analysen auch auf Proteinebene. Um die Funktion des SD_TNFR-like Proteins zu charakterisierten, wurde ein Test mit RAW-Blue™-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse implizieren, dass das Protein Teil der Immunreaktion analog der der TLR- bzw. NLR- Reaktion ist. Auch die Interaktion mit einem antimikrobiellen Protein, welches für das Überleben des Organismus und die Bekämpfung der Mikroorganismen sorgt, deutet auf eine solche Beteiligung hin. Zusätzlich wird diese These durch ein Ergebnis der Strukturanalysen unterstützt, nämlich die Identifizierung einer TRAF2 Bindestelle. TRAF2 ist ein Adapterprotein der TNFR und aktiviert Überlebensfaktoren über den NF - B-Weg. Immunohistochemische Analysen zeigten, dass das SD_TNFR-like Protein im Organismus vor allem um die Bakteriozysten, um verschiedene Mikroorganismen und am Rand des Schwammes exprimiert wird, was ebenfalls für eine immunologische Funktionsweise spricht. Auch im restlichen Gewebe wird es kontinuierlich, auch ohne vorherige LPS Inkubation exprimiert. Diese Akkumulation zeigt deutlich, dass das Protein in einen Schutzmechanismus gegen äußere Bedrohungen involviert ist. Es scheint dabei direkt an den eindringenden Mikroorganismen zu wirken. Das SD_TNFR-like ist demnach ein potentieller Bestandteil der Immunantwort des Schwammes, welches Apoptose verhindern und Überlebensmechanismen aktivieren kann. Das SD_Brevinin-like Protein besitzt antimykotische Aktivität, wie in einem antimikrobiellen Test gezeigt werden konnte. Weiterhin scheint es für das SD_TNFR-like Protein als positiver bzw. negativer Regulator von Bedeutung zu sein, der eine Reaktion entweder beendet oder die Expression von Überlebensfaktoren verstärkt. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse und Schlussfolgerungen demonstrieren somit die Identifizierung eines neuen Schwammproteins, welches eine Rolle in der Immunantwort spielt, sowie eines neuen antimikrobiellen Peptids, welches die Wirkung des TNFR-like moduliert. Es müssen jedoch noch weitere Funktionsanalysen folgen, um den Mechanismus des SD_TNFR-like Proteins und seine Regulation genauer charakterisieren zu können

Entwicklung eines immunologischen Testsystems zur Detektion des marinen Biotoxins Domoinsäure

Domoinsäure ist ein von mehreren Arten mariner Kieselalgen der Gattung Pseudonitzschia produziertes Toxin, welches während einer Algenblüte in Molluscen wie z.B. der Miesmuschel Mytilus sp. akkumuliert werden kann. Beim Verzehr solch kontaminierter Muscheln können sowohl beim Menschen als auch bei Tieren erhebliche Vergiftungserscheinungen auftreten, die von Übelkeit, Kopfschmerzen und Orientierungsstörungen bis hin zum Verlust des Kurzzeitgedächtnisses (daher auch als amnesic shellfish poisoning bekannt) reichen und in einigen Fällen tödlich enden. rnDie heute gängigen Methoden zur Detektion von Domoinsäure in Muschelgewebe wie Flüssigkeitschromatographie und Maus-Bioassay sind zeit- und kostenintensiv bzw. in Anbetracht einer Verbesserung des Tierschutzes aus ethischer Sicht nicht zu vertreten. Immunologische Testsysteme stellen eine erstrebenswerte Alternative dar, da sie sich durch eine vergleichsweise einfache Handhabung, hohe Selektivität und Reproduzierbarkeit auszeichnen.rnDas Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein solches immunologisches Testsystem zur Detektion von Domoinsäure zu entwickeln. Hierfür wurden zunächst Antikörper gegen Domoinsäure gewonnen, wofür das Toxin wiederum als erstes über die Carbodiimid-Methode an das Trägerprotein keyhole limpet hemocyanin (KLH) gekoppelt wurde, um eine Immunantwort auslösen zu können. Kaninchen und Mäuse wurden mit KLH-DO-Konjugaten nach vorgegebenen Immunisierungsschemata immunisiert. Nach vier Blutabnahmen zeigte das polyklonale Kaninchenantiserum eine ausreichend hohe Sensitivität zum Antigen; das nachfolgende Detektionssystem wurde mit Hilfe dieses polyklonalen Antikörpers aufgebaut. Zwar ist es gegen Ende der Arbeit auch gelungen, einen spezifischen monoklonalen Antikörper aus der Maus zu gewinnen, jedoch konnte dieser aus zeitlichen Gründen nicht mehr im Detektionssystem etabliert werden, was durchaus wünschenswert gewesen wäre. rnWeiterhin wurde Domoinsäure im Zuge der Entwicklung eines neuartigen Testsystems an die Trägerproteine Ovalbumin, Trypsininhibitor und Casein sowie an Biotin konjugiert. Die Kopplungserfolge wurden im ELISA, Western Blot bzw. Dot Blot nachgewiesen. Die Ovalbumin-gekoppelte sowie die biotinylierte Domoinsäure dienten im Folgenden als die zu messenden Größen in den Detektionsassays- die in einer zu untersuchenden Probe vorhandende, kompetitierende Domoinsäure wurde somit indirekt nachgewiesen. rnDer zulässige Höchstwert für Domoinsäure liegt bei 20 µg/g Muschelgewebe. Sowohl mit Biotin-DO als auch mit OVA-DO als den zu messenden Größen waren Domoinsäurekonzentrationen unterhalb dieses Grenzwertes nachweisbar; allerdings erwies sich der Aufbau mit Biotin-DO um das ca. 20-fache empfindlicher als jener mit OVA-DO. rnDie in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse könnten als Grundlage zur Etablierung eines kommerzialisierbaren immunologischen Testsystems zur Detektion von Domoinsäure und anderen Biotoxinen dienen. Nach erfolgreicher Validierung wäre ein solches Testsystem in seiner Handhabung einfacher als die gängige Flüssigkeitschromatographie und besser reproduzierbar als der Maus-Bioassay.rn

Quantum dot-dye hybrid systems for energy transfer applications

In this thesis, we focus on the preparation of energy transfer-based quantum dot (QD)-dye hybrid systems. Two kinds of QD-dye hybrid systems have been successfully synthesized: QD-silica-dye and QD-dye hybrid systems.rn rnIn the QD-silica-dye hybrid system, multishell CdSe/CdS/ZnS QDs were adsorbed onto monodisperse Stöber silica particles with an outer silica shell of thickness 2 - 24 nm containing organic dye molecules (Texas Red). The thickness of this dye layer has a strong effect on the total sensitized acceptor emission, which is explained by the increase in the number of dye molecules homogeneously distributed within the silica shell, in combination with an enhanced surface adsorption of QDs with increasing dye amount. Our conclusions were underlined by comparison of the experimental results with Monte-Carlo simulations, and by control experiments confirming attractive interactions between QDs and Texas Red freely dissolved in solution. rnrnNew QD-dye hybrid system consisting of multishell QDs and organic perylene dyes have been synthesized. We developed a versatile approach to assemble extraordinarily stable QD-dye hybrids, which uses dicarboxylate anchors to bind rylene dyes to QD. This system yields a good basis to study the energy transfer between QD and dye because of its simple and compact design: there is no third kind of molecule linking QD and dye; no spacer; and the affinity of the functional group to the QD surface is strong. The FRET signal was measured for these complexes as a function of both dye to QD ratio and center-to-center distance between QD and dye by controlling number of covered ZnS layers. Data showed that fluorescence resonance energy transfer (FRET) was the dominant mechanism of the energy transfer in our QD-dye hybrid system. FRET efficiency can be controlled by not only adjusting the number of dyes on the QD surface or the QD to dye distance, but also properly choosing different dye and QD components. Due to the strong stability, our QD-dye complexes can also be easily transferred into water. Our approach can apply to not only dye molecules but also other organic molecules. As an example, the QDs have been complexed with calixarene molecules and the QD-calixarene complexes also have potential for QD-based energy transfer study. rn