Designed functional defects in colloidal photonic crystals: switching, biomonitoring and modified photoluminescence

Es werden zwei komplementäre "bottom-up" Methoden präsentiert, die den kontrollierten Einbau von "intelligenten" planaren Defekten in selbstorganisierte kolloidale photonische Kristalle (KPKs) ermöglichen. Die Defektschicht basiert auf einem funktionellen, nanometer-skalierten dünnen Film, der entweder durch schichtweise ("layer-by-layer") Selbstorganisation und Mikrokontakttransferübertragung oder durch Aufschleudern und einer KPK-Opferfüllung hergestellt wird. Die entwickelten Techniken gestatten die Integration von maßgeschneiderten dünnen Defektfilmen bestehend aus einer enorm großen Vielfalt an Materialien; sie sind kostengünstig und können im größeren Maßstab angewendet werden. Optische Untersuchungen zeigen einen engen, durch den Defekt hervorgerufenen Transmissionszustand in der photonischen Bandlücke. Die Defektwellenlänge hängt von der optischen Dicke der Defektschicht ab. Aktives Schalten der Defektwellenlänge wird erreicht, indem Defektschichten aus Makromolekülen hergestellt werden, die über externe Erreger wie Licht, Temperatur, Redoxzyklen und mechanischen Druck adressiert werden können. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind im Einklang mit separat durchgeführten Ellipsometrie-Messungen und theoretischen "scalar wave approximation"-Berechnungen. Darüber hinaus werden KPKs mit funktionellen biomolekularen Defekten vorgestellt. Über Verschiebungen der Defektmode können DNA-Konformationsänderungen, die enantioselektive Einlagerung eines chiralen Antitumormedikaments sowie Enzymaktivitäten optisch beobachtet werden. Die Einlagerung von fluoreszierenden Farbstoffen und Quantenpunkten in Defekt-KPKs führt zu einer eindeutigen, durch die photonische Bandlücke und den Defektzustand hervorgerufenen Modifizierung der Photolumineszenz (PL)-Spektren. Schaltbare PL-Modifizierungen werden detektiert, wenn adressierbare Defekt-KPKs verwendet werden.

Point defects in carbon nanostructures studied by in-situ electron microscopy

In the present work, the formation and migration of point defects induced by electron irradiation in carbon nanostructures, including carbon onions, nanotubes and graphene layers, were investigated by in-situ TEM. The mobility of carbon atoms normal to the layers in graphitic nanoparticles, the mobility of carbon interstitials inside SWCNTs, and the migration of foreign atoms in graphene layers or in layers of carbon nanotubes were studied. The diffusion of carbon atoms in carbon onions was investigated by annealing carbon onions and observing the relaxation of the compressed clusters in the temperature range of 1200 – 2000oC. An activation energy of 5.0±0.3 eV was obtained. This rather high activation energy for atom exchange between the layers not only prevents the exchange of carbon atoms between the layers at lower temperature but also explains the high morphological and mechanical stability of graphite nanostructures. The migration of carbon atoms in SWCNTs was investigated quantitatively by cutting SWCNT bundles repeatedly with a focused electron beam at different temperatures. A migration barrier of about 0.25 eV was obtained for the diffusion of carbon atoms inside SWCNTs. This is an experimental confirmation of the high mobility of interstitial atoms inside carbon nanotubes, which corroborates previously developed theoretical models of interstitial diffusivity. Individual Au and Pt atoms in one- or two-layered graphene planes and MWCNTs were monitored in real time at high temperatures by high-resolution TEM. The direct observation of the behavior of Au and Pt atoms in graphenic structures in a temperature range of 600 – 700°C allows us to determine the sites occupied by the metal atoms in the graphene layer and the diffusivities of the metal atoms. It was found that metal atoms were located in single or multiple carbon vacancies, not in off-plane positions, and diffused by site exchange with carbon atoms. Metal atoms showed a tendency to form clusters those were stable for a few seconds. An activation energy of around 2.5 eV was obtained for the in-plane migration of both Au and Pt atoms in graphene (two-dimensional diffusion). The rather high activation energy indicates covalent bonding between metal and carbon atoms. Metal atoms were also observed to diffuse along the open edge of graphene layers (one-dimensional diffusion) with a slightly lower activation energy of about 2.3 eV. It is also found that the diffusion of metal atoms in curved graphenic layers of MWCNTs is slightly faster than in planar graphene.

Radiation-induced defects in calcium fluoride and their influence on material properties under 193 nm laser irradiation

Calcium fluoride (CaF2) is one of the key lens materials in deep-ultraviolet microlithography because of its transparency at 193 nm and its nearly perfect optical isotropy. Its physical and chemical properties make it applicable for lens fabrication. The key feature of CaF2 is its extreme laser stability. rnAfter exposing CaF2 to 193 nm laser irradiation at high fluences, a loss in optical performance is observed, which is related to radiation-induced defect structures in the material. The initial rapid damage process is well understood as the formation of radiation-induced point defects, however, after a long irradiation time of up to 2 months, permanent damage of the crystals is observed. Based on experimental results, these permanent radiation-induced defect structures are identified as metallic Ca colloids.rnThe properties of point defects in CaF2 and their stabilization in the crystal bulk are calculated with density functional theory (DFT). Because the stabilization of the point defects and the formation of metallic Ca colloids are diffusion-driven processes, the diffusion coefficients for the vacancy (F center) and the interstitial (H center) in CaF2 are determined with the nudged elastic band method. The optical properties of Ca colloids in CaF2 are obtained from Mie-theory, and their formation energy is determined.rnBased on experimental observations and the theoretical description of radiation-induced point defects and defect structures, a diffusion-based model for laser-induced material damage in CaF2 is proposed, which also includes a mechanism for annealing of laser damage. rn

Variation of stable silicon isotopes: Analytical developments and applications in Precambrian geochemistry

Die vorliegende Dissertation behandelt die Gesamtgesteinsanalyse stabiler Siliziumisotope mit Hilfe einer „Multi Collector-ICP-MS“. Die Analysen fanden in Kooperation mit dem „Royal Museum for Central Africa“ in Belgien statt. Einer der Schwerpunkte des ersten Kapitels ist die erstmalige Analyse des δ30Si –Wertes an einem konventionellen Nu PlasmaTM „Multi-Collector ICP-MS“ Instrument, durch die Eliminierung der den 30Si “peak” überlagernden 14N16O Interferenz. Die Analyse von δ30Si wurde durch technische Modifikationen der Anlage erreicht, welche eine höherer Massenauflösung ermöglichten. Die sorgsame Charakterisierung eines adäquaten Referenzmaterials ist unabdingbar für die Abschätzung der Genauigkeit einer Messung. Die Bestimmung der „U.S. Geological Survey“ Referenzmaterialien bildet den zweiten Schwerpunkt dieses Kapitales. Die Analyse zweier hawaiianischer Standards (BHVO-1 and BHVO-2), belegt die präzise und genaue δ30Si Bestimmung und bietet Vergleichsdaten als Qualitätskontrolle für andere Labore. Das zweite Kapitel befasst sich mit kombinierter Silizium-/Sauerstoffisotope zur Untersuchung der Entstehung der Silizifizierung vulkanischer Gesteine des „Barberton Greenstone Belt“, Südafrika. Im Gegensatz zu heute, war die Silizifizierung der Oberflächennahen Schichten, einschließlich der „Chert“ Bildung, weitverbreitete Prozesse am präkambrischen Ozeanboden. Diese Horizonte sind Zeugen einer extremen Siliziummobilisierung in der Frühzeit der Erde. Dieses Kapitel behandelt die Analyse von Silizium- und Sauerstoffisotopen an drei unterschiedlichen Gesteinsprofilen mit unterschiedlich stark silizifizierten Basalten und überlagernden geschichteten „Cherts“ der 3.54, 3.45 und 3.33 Mill. Jr. alten Theespruit, Kromberg und Hooggenoeg Formationen. Siliziumisotope, Sauerstoffisotope und die SiO2-Gehalte demonstrieren in allen drei Gesteinsprofilen eine positive Korrelation mit dem Silizifizierungsgrad, jedoch mit unterschiedlichen Steigungen der δ30Si-δ18O-Verhältnisse. Meerwasser wird als Quelle des Siliziums für den Silizifizierungsprozess betrachtet. Berechnungen haben gezeigt, dass eine klassische Wasser-Gestein Wechselwirkung die Siliziumisotopenvariation nicht beeinflussen kann, da die Konzentration von Si im Meerwasser zu gering ist (49 ppm). Die Daten stimmen mit einer Zwei-Endglieder-Komponentenmischung überein, mit Basalt und „Chert“ als jeweilige Endglieder. Unsere gegenwärtigen Daten an den „Cherts“ bestätigen einen Anstieg der Isotopenzusammensetzung über der Zeit. Mögliche Faktoren, die für unterschiedliche Steigungen der δ30Si-δ18O Verhältnisse verantwortlich sein könnten sind Veränderungen in der Meerwasserisotopie, der Wassertemperatur oder sekundäre Alterationseffekte. Das letzte Kapitel beinhaltet potentielle Variationen in der Quellregion archaischer Granitoide: die Si-Isotopen Perspektive. Natriumhaltige Tonalit-Trondhjemit-Granodiorit (TTG) Intrusiva repräsentieren große Anteile der archaischen Kruste. Im Gegensatz dazu ist die heutige Kruste kaliumhaltiger (GMS-Gruppe: Granit-Monzonite-Syenite). Prozesse, die zu dem Wechsel von natriumhaltiger zu kaliumhaltiger Kruste führten sind die Thematik diesen Kapitels. Siliziumisotopenmessungen wurden hier kombiniert mit Haupt- und Spurenelementanalysen an unterschiedlichen Generationen der 3.55 bis 3.10 Mill. Yr. alten TTG und GMS Intrusiva aus dem Arbeitsgebiet. Die δ30Si-Werte in den unterschiedlichen Plutonit Generationen zeigen einen leichten Anstieg der Isotopie mit der Zeit, wobei natriumhaltige Intrusiva die niedrigste Si-Isotopenzusammensetzung aufweisen. Der leichte Anstieg in der Siliziumisotopenzusammensetzung über die Zeit könnte auf unterschiedliche Temperaturbedingungen in der Quellregion der Granitoide hinweisen. Die Entstehung von Na-reichen, leichten d30Si Granitoiden würde demnach bei höheren Temperaturen erfolgen. Die Ähnlichkeit der δ30Si-Werte in archaischen K-reichen Plutoniten und phanerozoischen K-reichen Plutoniten wird ebenfalls deutlich.

Funktionelle Analyse von Dystroglycan in der sich entwickelnden Hühnerretina durch in-ovo-Elektroporation

Alpha- und Beta-Dystroglycan, die zentralen Komponenten eines multimeren Dystrophin-assoziierten Proteinkomplexes wurden bislang im Wesentlichen in der Skelettmuskulatur charakterisiert. Dort stellt der DAG eine molekulare Verbindung zwischen dem Aktin-Zytoskelett der Muskelfaser und einer Basalmembran her, die die einzelne Muskelfaser umhüllt. Dystroglycan vermittelt auf diese Weise die mechanische Festigkeit der Muskelfasern während der Kontraktion. Außerdem dient der DAG als Gerüst für die Anlagerung von Proteinen. Mutationen in den strukturgebenden oder signaltransduzierenden Proteinen des DAG verursachen Muskeldystrophie. Besonders schwere Muskeldystrophien werden durch Mutationen hervorgerufen, die eine veränderte Glykosylierung von Dystroglycan und damit eine verminderte Bindung von alpha-Dystroglycan an Matrixproteine verursachen. Dies führt zu einer Beeinträchtigung der Basalmembranbiosynthese sowie sich daraus ergebende Störungen in der Migration, Schichtung und Differenzierung von Nervenzellen im ZNS. Welche Rolle Dystroglycan im sich entwickelnden ZNS spielt, sollte in dieser Arbeit an der Hühnerretina untersucht werden. Durch Anwendung der in ovo Elektroporation wurden zwei modifizierte Dystroglycankonstrukte in Neuroepithelzellen transfiziert. Die Überexpression eines verkürtzten Dystroglycanproteins, verursachte eine Abrundung der Neuroepithelzellen. Dies führte zur Hyperproliferation der Zellen deren Folge die Bildung von Verdickungen in der Retina war sowie eine verstärkte Bildung postmitotischer Neurone. Die Elektroporation eines nicht-spaltbaren Dystroglycans, führte im Gegensatz dazu zu einer Abnahme der Anzahl proliferierender und differenzierender Nervenzellen. Als Konsequenz veränderte sich die Orientierung der Axone von retinalen Ganglienzellen. Nach der Überexpression des verkürzten Dystroglycans verloren die Axone ihre zentripetale Orientierung auf den optischen Nerv, während die Elektroporation von Wt-Dystroglycan und nicht-spaltbarem Dystroglycan nur einen gelegentlichen Richtungswechsel der Axone verursachte. Die Daten zeigen, dass Dystroglycan einen entscheidenden Einfluss auf die Proliferation, Differenzierung und Polarität der Neuroepithelzellen ausübt. Dies geschieht vermutlich durch die Vermittlung der Adhäsion des Endfußes von Neuroepithelzellen an die Basalmembran. Die Veränderungen nach der Überexpression der modifizierten Dystroglycankonstrukte liefern möglicherweise eine Erklärung für den ZNS-Phänotyp der sich bei verschiedenen Formen von Muskeldystrophie zeigt.

Analyse der konditionell-induzierten Überexpression von Smad7 in epithelialen Geweben der adulten Maus

Smad7 ist eine inhibitorische Komponente der TGF-β- bzw. Activin-Signalweiterleitung und erfüllt eine wichtige Aufgabe bei deren Regulation. So führt eine konstitutive Überexpression von Smad7 in epithelialen Geweben zum Auftreten verschiedener Phänotypen, wie embryonaler bzw. perinataler Letalität, Hyperproliferation der Epidermis und Thymusatrophie. Auch die Entwicklung der T-Zellen im Thymus und epithelialer Anhangsgebilde wie z.B. von Haaren und Zähnen wird dadurch beeinträchtigt. In dieser Arbeit sollte nun in der adulten Maus der Effekt einer Überexpression von Smad7 in epithelialen Geweben untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein, auf dem Cre/loxP-Prinzip beruhendes Transgensystem verwendet (K5-Smad7-tg und K14-creERT2), welches eine konditionell-induzierte Überexpression von Smad7 in epithelialen Zellen der adulten Maus erlaubte. Die so gezüchteten doppeltransgenen Tiere wiesen keine signifikanten Veränderungen gegenüber ihren wildtyp bzw. einfachtransgenen Geschwistertieren auf. Die Überexpression von Smad7 in epithelialen Geweben der adulten Maus zu einem Auftreten verschiedenster veränderter Phänotypen der Haut und deren Anhänge, sowie der Schneidezähne. Bei diesen Tieren konnte auch ein signifikanter Körpergewichtsverlust und eine Erhöhung der Mortalitätsrate beobachtet werden, welche sich im Verlauf nach erfolgter Rekombination einstellte. Weitere Analysen zeigten signifikante Veränderungen in der Haut und im Thymus. So konnte in der Haut eine Erhöhung der Proliferationsrate epidermaler Zellen, eine reduzierte Expression von Smad3 und im Thymus Veränderungen in der Gesamtzahl der lebenden T-Zellen und deren Differenzierung beobachtete werden. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Hemmung der Signalweiterleitung der TGF-β-Superfamilie, speziell von TGF-β und Activin, zu verschiedenen morphogenetischen Defekten der Haut und deren Anhänge, der Zähne und der T-Zellentwicklung im Thymus führt.

Identifizierung und Charakterisierung von Intermediärfilament-Organisatoren in Caenorhabditis elegans

Intermediärfilamente (IFs) sind neben Mikrotubuli und Aktinfilamenten die dritte filamentäre Komponente des Zytoskeletts. Sie wirken als mechanische Stabilisatoren, sind außerdem an Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose beteiligt und tragen zu Zellpolarität bei. IFs sind dynamische Strukturen, die zelltypspezifisch in unterschiedlichen Anordnungen und Abundanzen vorkommen und von Signalkaskaden beeinflusst werden. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser fein abgestimmten Prozesse sind weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit sollte deswegen ein Tiermodell entwickelt werden, um Regulatoren der IF-(Netzwerk)-Organisation in vivo zu untersuchen und zu identifizieren. Dazu wurde C. elegans ausgewählt, da es sich hierbei um einen genetisch gut charakterisierten und leicht manipulierbaren Organismus handelt, in dessen Genom elf Gene für zytoplasmatische IFs kodieren. Zunächst wurden stabil transgene C. elegans-Linien generiert, die fluoreszierende IFs exprimieren. Es konnte gezeigt werden, dass das darmspezifische IFB-2::CFP im Bereich des apikalen Junktionskomplex verankert ist und nahezu vollständig im subapikalen Terminalgeflecht der Enterozyten lokalisiert, das als Teil der endotube besonders stabil und widerstandsfähig ist. Wenn diese Tiere mit dsRNA gegen das ebenfalls im Terminalgeflecht exprimierte IF ifc-2 behandelt wurden, entwickelten sich blasenförmige Ausstülpungen des Darmlumens, die auf eine Schwächung der rigiden und formgebenden endotube hinwiesen und damit einen direkten in vivo-Beweis für die stressprotektive Funktion des intestinalen IF-Netzwerks lieferten. Die leichte Detektierbarkeit des IFB-2::CFP-Musters wurde in einem optischen Screen ausgenutzt, bei dem nach chemischer Mutagenese nach Veränderungen im IF-Muster gefahndet wurde. Hierbei wurden drei Mutanten isoliert. In Komplementationsanalysen stellte sich heraus, dass es sich in zwei Fällen um Allele desselben Gens handelt. Die Identifizierung der betroffenen Gene gelang durch eine PCR-basierte Kartierung von single nucleotide polymorphisms nach Verpaarung mit dem Hawaii-Stamm (snp-mapping) und anschließender RNAi-Analyse der Einzelgene in den identifizierten Chromosomenabschnitten. Im einen Fall handelte es sich um das sma-5-Gen, einer Serin/Threonin-Kinase mit Homologie zu den MAP-Kinasen MAPK7/ERK5 der Säuger. Hier wurden, ebenso wie beim ifc-2 (RNAi)-Phänotyp, progressive blasenförmige Ausstülpungen des Darmlumens beobachtet. Die beiden anderen Allele tragen Mutationen in einem bisher nicht näher charakterisierten Gen. In diesen Würmern kommt es zu einem vollständigen Auflösung des IFB-2::CFP-Netzwerks mit prominenten Akkumulationen um die apikalen Junktionen. Das Darmlumen ist stellenweise geweitet und das elektronendichte Terminalgeflecht fehlt fast vollständig, die Integrität des Darmepithels ist jedoch nicht kompromittiert. Die anderen IFs des Terminalgeflechts sind ebenfalls fehlverteilt, und die intestinale Expression von Aktin ist stark reduziert. Expressionskonstrukte des Gens zeigten weiterhin, dass es darmspezifisch synthetisiert wird und mit den IFs im Terminalgeflecht kolokalisiert. Das Protein ist, ähnlich wie das IF-assoziierte Filaggrin der Säuger ausgesprochen histidinreich. Es enthält außerdem eine Prolin-reiche Domäne, die Teil einer potentiellen Aktin-Bindedomäne ist. Auf Grund all dieser Eigenschaften wird die Bezeichnung IFO-1 (intermediate filament organizer) für das neue Protein vorgeschlagen, das möglicherweise als struktureller Zytoskelett-Linker wirkt. Die vorgestellten Ergebnisse untermauern die Bedeutung von C. elegans für die Identifizierung von Faktoren, die IF-Netzwerke regulieren, und die Möglichkeit, Defekte im lebenden Gesamtorganismus zu bestimmen.

Funktionelle Untersuchungen von FLORICAULA und KNOX-Genen in Eschscholzia californica Cham.

FLORICAULA (FLO) und KNOTTED1-like Homöobox (KNOX)-Gene übernehmen neben ihren konservierten Funktionen in der Achsenentwicklung in verschiedenen Eudikotylen eine Funktion in der Fiederblattentwicklung. Zur Klärung der Frage nach dem ursprünglichen Regulationsweg der Fiederblattentwicklung in Hinblick auf FLO und KNOX-Gene innerhalb der Eudikotylen wurde hier die Bedeutung dieser Gene für die Fiederblattentwicklung von Eschscholzia californica als Modell für die Ranunculales, die Schwestergruppe aller anderen Eudikotylen untersucht. Es wurde ein Protokoll zur Erzeugung von somatischen Embryonen aus unreifen Samen entwickelt. Wege zur Herstellung von Mutanten durch Agrobacterium-vermittelte Transformation werden vorgeschlagen. Die Bedeutung von Auxin für die Blattentwicklung und die Untersuchung der Interaktion von ESCHSCHOLZIA CALIFORNICA FLORICAULA (EcFLO) und des KNOX- Gens ESCHSCHOLZIA CALIFORNICA SHOOT MERISTEMLESS (EcSTM) mit Auxin wurde durch Hemmung des Auxintransports untersucht. Trotz gravierender Störungen in der Blattpositionierung und -morphologie konnten Expressionsänderungen beider Gene nicht nachgewiesen werden. Ein Funktionsverlust von EcFLO und KNOX-Genen in E. californica wurden mittels Virus induziertem Gen Silencing (VIGS) erzeugt. VIGS von EcFLO rief keinen Phänotypen hervor. VIGS des KNOX-Gens EcSTM erzeugte dagegen in einigen Pflanzen eine Reduktion der Fiederzahl. Auch molekularbiologisch konnte das Silencing von EcSTM, nicht aber das Silencing von EcFLO nachgewiesen werden. Die Ergebnisse belegen die Notwendigkeit des ungestörten Auxintransports für die Blattentwicklung von E. californica und machen die Beteiligung des KNOX-Gens EcSTM an der Blattentwicklung wahrscheinlich. Die Beteiligung von EcFLO an der Fiederbildung konnte nicht nachgewiesen werden.

Hox genes and the regulation of programmed cell death in the embryonic central nervous system of Drosophila melanogaster

This study deals with the function and regulation of programmed cell death, or apoptosis, in the development of the embryonic central nervous system of Drosophila melanogaster. The first part provides a description of apoptosis-deficient embryos, which showed that preventing apoptosis does not cause gross morphological defects in the CNS, as it appears well organized despite the presence of too many cells. An analysis of the incidence and pattern of apoptosis over the course of development discloses a partly very orderly pattern suggesting tight spatio-temporal control, but also reveals random apoptotic cells, which suggests a certain amount of plasticity in the embryo. This analysis also allowed precise identification of some of the dying neural cells in the embryo, and establishment of single cell models for studying regulation of segment-specific apoptosis in the embryonic CNS. In the second part of the work, further investigations into mechanisms controlling segment-specific apoptosis revealed the involvement of two Hox genes, Antennapedia (Antp) and Ultrabithorax (Ubx), in this process. Hox genes control the formation of segment-specific structures in their domains of expression, but also regulate organ and tissue morphogenesis. The study presented here shows that Antp and Ubx play antagonistic roles in motoneuron survival in the embryo. Ubx expression in the CNS is strongly upregulated at a late point in development, when most cells have begun to differentiate. This upregulation shortly precedes Ubx-dependent, segment-specific apoptosis of two differentiated motoneurons. It could further be demonstrated that Antp is required for proper development of the NB7-3 lineage and for survival of the NB7-3 motoneuron in the anterior thoracic segments. In segments where Antp and Ubx expression overlaps, Ubx counteracts the anti-apoptotic function of Antp, resulting in cell death. Thus, these two Hox genes play opposing roles in the survival of differentiated neurons in the late developing nervous system. They thereby contribute to establishment of correct connections between outward-projecting neurons and their targets, which is crucial for the assembly of functional neural circuits, as these have to fulfill region-specific locomotion and sensory requirements along the antero-posterior body axis.

Assessing the role of sCYLD and Bcl-3 in immune regulation

CYLD is a deubiquitinating enzyme, which negatively regulates NF-κB signaling by removing Lys63-linked polyubiquitin chains from its substrates. In mice, there are two variants of CYLD: full-length CYLD (FL-CYLD) and its short splice variant sCYLD. sCYLD lacks the NEMO and TRAF2 binding sites and CYLDex7/8 mice, which have been generated in our laboratory, overexpress sCYLD in the absence of the full length transcript. In this thesis, we show that bone marrow-derived macrophages (BMDCs) overexpressing sCYLD display a hyperactive phenotype. They have increased levels of the inflammatory cytokines IL-6 and TNFα, have exaggerated stimulatory capacity and fail to induce tolerance in in vivo experiments. CYLDex7/8 BMDCs have increased levels of nuclear Bcl-3, which we could show to be directly induced by sCYLD expression. NF-κB signaling was markedly upregulated in CYLDex7/8 BMDCs.rnBcl-3 overexpressing BMDCs with normal CYLD expression, however, were not hyperactive, suggesting that Bcl-3 overexpression is not sufficient for causing the observed phenotype. Taken together we propose a model in which the exclusive overexpression of sCYLD with high nuclear levels of Bcl-3 in BMDCs is accompanied by an increased NF-κB activation, resulting in a hyperactive phenotype.rnWe further analyzed macrophages overexpressing sCYLD using the LysMcre CyldFL/FL strain, but could not detect differences in activation marker expression, cytokine secretion or iNOS production. LysMcre CyldFL/FL mice immunized with MOG35-55 peptide showed a more severe course of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), which could not be explained by enhanced levels of MHC class II on CNS-resident macrophages and microglia or increased T cell infiltration.rnMice overexpressing Bcl-3 in T cells develop spontaneous colitis. They have less peripheral memory/effector T cells and less Th1 cells, whereas Th17 numbers are normal. Naïve T cells overexpressing Bcl-3 show defects in in vitro differentiation to the Th1 or Th17 fate. CD4+ T cells overexpressing Bcl-3 show enhanced survival capacity in in vitro culture, but have a defect in proliferative capacity when stimulated in vitro or when adoptively transferred into lymphopenic hosts.

Funktionelle Charakterisierung der Protein-Kinase CK2 in der Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch regulatorische T-Zellen

Regulatorische T-Zellen (Tregs) leisten durch ihre suppressiven Eigenschaften einen essenziellen Beitrag zur Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz. Sie verhindern schädliche Immunreaktionen gegen Autoantigene, kommensale Bakterien, sowie harmlose Nahrungsmittel-bestandteile. Gleichzeitig gewährleisten sie die Entwicklung effektiver Immunantworten gegen eindringende Pathogene, wie z.B. Parasiten, Bakterien und Viren. Damit haben Tregs direkten Einfluss auf das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz. Fehler in der suppressiven Funktionsweise von Tregs begünstigen daher auf der einen Seite die Entstehung zahlreicher autoimmuner Erkrankungen und Allergien. Auf der anderen Seite können Tregs Immunreaktionen bei chronischen Infektionen reduzieren, sowie die Entstehung effektiver Immunantworten gegen Tumore hemmen. Ihre Beteiligung an der Ätiologie all dieser Krankheiten macht Tregs zu einem bedeutenden potenziellen Zielobjekt, um diese Krankheiten effektiv zu therapieren. Die Erweiterung des Grundwissens um die molekularen Mechanismen der Treg-vermittelten Suppression ist daher ein notwendiger Schritt bei der Entwicklung Treg-basierter Theraphieansätze. 2003 konnte mit Foxp3 ein Transkriptionsfaktor identifiziert werden, der maßgeblich die suppressiven Funktionen von Tregs steuert. Um weiteren Einblick in die der Suppression zugrundeliegenden Signalwege zu erhalten, wurde im Institut für Immunologie ein komparativer Kinomarray durchgeführt, anhand dessen die Casein Kinase 2 (CK2) als eine der aktivsten Kinasen in Tregs identifiziert wurde (Daten freundlicherweise von Prof. Dr. Tobias Bopp bereitgestellt). rnBasierend auf den Ergebnissen des Kinomarrays wurde in dieser Arbeit die Funktion der CK2 in Tregs untersucht. Dabei konnte in in vitro Experimenten die Treg-vermittelte Suppression durch den pharmakologische CK2 Inhibitor DMAT aufgehoben werden. Weil derartige Inhibitoren jedoch nicht absolut spezifisch die Aktivität nur einer Kinase supprimieren, wurden außerdem Mäuse mit konditionalem „knockout“ der CK2β Untereinheit spezifisch in Tregs gekreuzt (CK2βTreg-/- Mäuse). Die Analyse dieser Tiere offenbarte eine essenzielle Beteiligung der CK2 an den suppressiven Funktionen von Tregs. So entwickeln CK2βTreg-/- Mäuse mit zunehmendem Alter Splenomegalien und Lymphadenopathien, von denen in besonderem Maße die Mukosa-assoziierten Lymphknoten betroffen sind. Eine Analyse des Aktivierungsstatus der T-Zellen in den Tieren konnte zudem einen erhöhten Anteil sogenannter Effektor-Gedächtnis T-Zellen aufdecken, die charakteristische Merkmale eines Th2 Phänotyps zeigten. Erhöhte Titer des Antikörperisotyps IgE in den Seren von CK2βTreg-/- Mäusen suggerieren zusätzlich eine fehlerhafte Suppression speziell Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2β-defiziente Tregs. In Th2-vermittelten Asthma Experimenten in vivo konnte der Verdacht der fehlerhaften Kontrolle von Th2-Antwort bestätigt werden, wobei zusätzlich aufgedeckt wurde, dass bereits unbehandelte CK2βTreg-/- Mäuse Zeichen einer Entzündungsreaktion in der Lunge aufweisen. Bei der Suche nach den molekularen Ursachen der fehlerhaften Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2β-defiziente Tregs konnten zwei mögliche Erklärungsansätze gefunden werden. Zum einen zeigen CK2β-defiziente Tregs eine verringerte Expression von Foxp3, was, in Analogie zu Ergebnissen der Gruppe von R. Flavell (Wang Y.Y. Nature. 445, 766-770 (2007)), zu einer Konversion von Tregs zu Th2 Zellen und damit zur Entstehung eines Th2-basierten, autoimmunen Phänotyps führt. Des Weiteren weisen CK2β-defiziente Tregs eine reduzierte Expression des Transkriptionsfaktors IRF4 auf, der in Tregs entscheidend für die Kontrolle Th2-basierter Immunreaktionen ist (Zheng Y. Nature. 19; 351-356 (2009)). Die dargelegten Ergebnisse identifizieren die CK2 damit als Kinase, die entscheidend an der Treg-vermittelten Suppression speziell Th2-basierter Immunantworten beteiligt ist. Demnach könnten pharmakologische CK2 Inhibitoren beispielsweise dazu eingesetzt werden, um die Treg-vermittelte Suppression im Rahmen chronischer Parasiten-Infektionen aufzuheben. Die in CK2βTreg-/- Mäusen beobachtete Prävalenz der Funktion der CK2 für Mukosa-assoziierte Organe stellt dabei einen zusätzlichen Vorteil dar, weil systemische Nebenwirkungen, die durch die Blockade der Treg-vermittelte Suppression entstehen, zumindest in nicht-Mukosa-assoziierten Geweben nicht zu erwarten sind.rn