Methoden und Modelle zur Phytoplanktonanalyse am Beispiel einer Restaurierungsmaßnahme an der Bleiloch Talsperre

Methoden und Modelle zur Phytoplanktonanalyse am Beispiel einer Restaurierungsmaßnahme an der Bleiloch Talsperre Zusammenfassung An der hypertrophen Bleiloch Talsperre (Thüringen, BRD) werden die Auswirkungen der 1997 in Betrieb genommenen partiellen Destratifikation (0- 20m) untersucht. Ziel der Maßnahme war die Hemmung des Phytoplanktonwachstums durch Lichtlimitation.Da es nicht gelang, auch die Oberflächenlammelle in die Durchmischung einzubeziehen, wurde auch keine Reduktion des Phytoplanktons beobachtet. Seine zeitliche Dynamik nahm deutlich zu und es traten neben typischen Längsgradienten auch extreme, kleinräumige Konzentrationsunterschiede auf. Die vorher häufigen Cyanobakterien spielten jedoch keine quantitativ bedeutsame Rolle mehr. Es wird diskutiert, wie die Belüftung die Saisonalität des Planktons stört und zu Verschiebungen der Zusammensetzung führt. Der Zusammenhang zwischen der Chlorophyll a Menge und der Stabilität der Wassersäule sowie der Einfluß wachstumsbestimmender Größen werden modelliert. Methodische Schwerpunkte umfassen die Auswertung von Phytoplankton-Pigmentdaten (HPLC-Analyse) und die Entwicklung einer Durchflußzytometer-Methode. Bei letzerer werden an lebenden Phytoplanktern die Vorwärtsstreuung sowie vier Fluoreszenzen (2 Phycoerythrine, Phycocyanin und Chlorophyll a, 514nm Anregungswellenlänge) gemessen. Zur Klassifizierung von Algen anhand von Referenzen werden zwei Methoden entwickelt, Möglichkeiten des Sortierens aufgezeigt und es wird ein Vergleich mit Mikroskopie und HPLC- Pigmentanalyse durchgeführt. Anhand von Modellrechnungen wird demonstriert, wie sich systematische bzw. zufällige Abweichungen der Pigmentstöchiometrien auf die Berechnung von Algengruppenanteilen auswirken. Strategien zur Auswertung von Pigmentdaten werden empfohlen.

Physiologische Veränderungen bei der Thylakoidmembranbiogenese und die Funktionsweise des Nukleotidaustauschfaktors GrpE in Cyanobakterien

Bei Wachstum im Dunkeln zeigten sich rudimentäre Thylakoidstrukturen, wobei nach dem Transfer ins Licht ein vollständiges Thylakoidmembransystem erneut ausgebildet wurde. Parallel stieg, der Chlorophyllgehalt pro Zelle und das Verhältnis von Phycobilisomen zu Chlorophyll verschob sich erneut auf die Seite des Chlorophylls. Das bei Wachstum im Dunkeln als Monomer vorliegende PS II, war nicht funktional. Nach dem Transfer ins Licht, war nach etwa acht bis zwölf Stunden ein aktives PS II zu detektieren. Das PS I lag nach der Inkubation im Dunkeln, in geringerer Konzentration aber aktiv als Trimer in den Zellen vor.rnZwei Typ I Signalpeptidasen aus Synechocystis sp. PCC 6803 zeigten Unterschiede im Bezug auf ihre intrazelluläre Lokalisation. Für die Untersuchungen der Lokalisation konnte ein neues System der Fluoreszenzmikroskopie entwickelt und erfolgreich eingesetzt werden. Das LepB1 zeigte einen (auto-) proteolytischen Abbau. Für Untersuchungen zur katalytischen Aktivität wurden Vorläuferproteine als Substrate für LepB2 identifiziert.rnDie Funktionsweise der GrpE-Proteine aus verwandten Cyanobakterien zeigt Unterschiede. Bei beiden GrpE-Proteinen erfolgt der reversible Übergang von einem Dimer hin zu einem Monomer innerhalb eines physiologisch relevanten Temperaturbereichs in einem Schritt. Bei dem Protein aus Synechocystis sp. ist der N-Terminus und bei dem Protein aus dem thermophilen Bakterium Thermosynechococcus der C-Terminus für die Dimerisierung essentiell. rn

Untersuchungen zur Funktion multipler DnaJ-Proteine in dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803

Sowohl in Synechocystis sp. PCC 6803 als auch in anderen Cyanobakterien konnten multiple DnaJ-Proteine nachgewiesen werden, deren Funktion jedoch noch weitestgehend unverstanden ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Funktionen der multiplen DnaJ-Proteine von Synechocystis sp. charakterisiert. Das DnaJ-Protein, Sll0897 gehört aufgrund seiner Domänenstruktur zu den Typ I-Proteinen, Slr0093 und Sll1933 zu den Typ II-Proteinen und Sll0909, Sll1011, Sll1384 und Sll1666 zu den Typ III DnaJ-Proteinen. Durch Komplementationsstudien des E. coli ΔdnaJ-Stammes OD259 konnte eine Komplementation des Wachstumsdefekts bei höheren Temperaturen durch die Proteine Slr0093 und Sll0897 gezeigt werden. In Synechocystis war eine komplette Disruption von sll1933 nicht möglich, weshalb das Protein Sll1933 unter normalen Wachstumsbedingungen essentiell ist. Doppelte Insertionmutationen waren lediglich bei der Kombination der Gene sll0909 und sll1384 möglich. Untersuchungen des Wachstumsverhaltens der dnaJ-Disruptions-stämme unter Hitze- und Kältestressbedingungen zeigten, dass das Protein Sll0897 eine wichtige Funktion bei der Stressantwort in Synechocystis besitzt und unter Hitzestressbedingungen essentiell ist. Eine vollständige Deletion des Gens sll0897 war Synechocystis sp. bereits unter normalen Wachstumsbedingungen nicht möglich. Bei den für ein Wachstum mindestens notwendigen Domänen des Sll0897 handelt es sich um die charakteristische J-Domäne und die Glycin-Phenylalanin-reiche Domäne. Unter Hitzestressbedingungen ist das Volllängen-Protein Sll0897 für ein Wachstum essentiell. rnNeben den in vivo Wachstumsexperimenten wurde eine Methode zur heterologen Expression der sieben DnaJ-Proteine in E. coli und einer nativen Reinigung von Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666 etabliert. Untersuchungen zur Thermostabilität der gereinigten Proteine zeigten für das Slr0093 und Sll1666 einen reversiblen Prozess, wodurch sie auch nach dem Hitzestress noch als Faltungshelfer fungieren können. Bei den Proteinen Sll0897 und Sll0909 ist der Prozess jedoch nicht reversibel, so dass sie nach Hitzestresseinwirkung neu synthetisiert oder durch Chaperoneinwirkung korrekt gefaltet werden müssen. Die Affinitäts-„Pull-Down“ Analysen lieferten keine klaren Hinweise auf die DnaK-Interaktionspartner der Proteine Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666, weshalb weitere Untersuchungen notwendig sind. Mit Hilfe der Gelfiltrationsanalysen konnten die errechneten molaren Massen der Proteine Slr0093 und Sll1666 bestätigt und beide Proteine in einer monomeren Form nachgewiesen werden. Die DnaJ-Proteine Sll0897 und Sll0909 konnten in zwei oligomeren Zuständen detektiert werden. Analysen der ATPase-Aktivität des DnaK2-Proteins alleine und des DnaK2-Proteins zusammen mit den DnaJ-Proteinen Slr0093, Sll0897, Sll0909 und Sll1666 zeigten eine Steigerung der ATP-Hydrolyserate bei der Interaktion von DnaK und DnaJ, wobei Sll0897 die größte Steigerung der ATPase-Aktivität des DnaK2 induzierte.

Hsp70-Chaperone und ihre Rolle bei der Thylakoidmembranbiogenese im Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803

Im Genom des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC6803 sind vier homologe Hsp70-Proteine kodiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse über die möglichen Funktionen der einzelnen Mitglieder der Hsp70-Proteinfamilie in dem Modellorganismus gewonnen bzw. bekannte Aufgabenbereiche erweitert werden. Wie für E. coli schon gezeigt, konnte auch für Synechocystis sp. nachgewiesen werden, dass eine Deletion des ribosomassoziierten Chaperons Trigger Factor ohne Beeinträchtigung der Zellviabilität möglich ist. Darüber hinaus war auch eine Doppeldeletion mit dnaK1 durchführbar. Als Auswirkung der Deletion ließ sich in den jeweiligen Deletionsstämmen eine veränderte Expression der homologen Hsp70-Proteine und Trigger Factor nachweisen. Mit Hilfe der Synechocystis sp.-Mutationsstämme ∆dnaK1, ∆dnaK2, ∆dnaK3, ∆tig und ∆dnaK1∆tig wurden Auswirkungen der Deletion bzw. Depletion umfassend dargestellt und daraus hervorgehende putative Funktionen eingehend diskutiert. Die Reduzierung der zellulären DnaK3-Konzentration um etwa 70 % führte im Depletionsstamm ΔdnaK3 zu weitreichenden physiologischen Änderungen hinsichtlich photosynthetischer Prozesse. Zusammen mit einer lichtabhängigen Expression, konnte DnaK3 als essentieller Faktor für die funktionelle Aufrechterhaltung der Thylakoidmembran identifiziert werden. Durch die Analyse des Proteoms und Lipidoms dunkeladaptierter Synechocystis sp.-Zellen konnte im Vergleich zu älteren Studien eine erheblich größere Anzahl von Proteinen detektiert und quantifiziert werden, womit neue Erkenntnisse über die physiologischen Veränderungen unter heterotrophem Wachstum sowie der Thylakoidmembranbiogenese gewonnen werden konnten.

Three-dimensional electron microscopy of myriapod hemocyanin, planorbid snail acetylcholine-binding protein and cyanobacterial Vipp1

Three-dimensional electron microscopy (3-D EM) provides a framework for the analysis of large protein quaternary structures. The advantage over the generally higher resolving meth- od of X-ray crystallography is the embedding of the proteins in their physiological environ- ment. However, results of the two methods can be combined to obtain superior structural information. In this work, three different protein types – (i) Myriapod hemocyanin, (ii) vesi- cle-inducing protein in plastids 1 (Vipp1) and (iii) acetylcholine-binding protein (AChBP) – were structurally analyzed by 2-D and 3-D EM and, where possible, functionally interpreted.rnMyriapod hemocyanins have been previously shown to be 6x6-meric assemblies that, in case of Scutigera coleoptrata hemocyanin (ScoHc), show two 3x6-mer planes whith a stag- gering angle of approximately 60°. Here, previously observed structural differences between oxy- and deoxy-ScoHc could be substantiated. A 4° rotation between hexamers of two dif- ferent 3x6-mer planes was measured, which originates at the most central inter-hexamer in- terface. Further information about allosteric behaviour in myriapod hemocyanin was gained by analyzing Polydesmus angustus hemocyanin (PanHc), which shows a stable 3x6-mer and divergent histidine patterns in the inter-hexamer interfaces when compared to ScoHc. Both findings would conclusively explain the very different oxygen binding properties of chilopod and diplopod hemocyanin.rnVipp1 is a protein found in cyanobacteria and higher plants which is essential for thyla- koid membrane function and forms highly variable ring-shaped structures. In the course of this study, the first 3-D analysis of Vipp1 was conducted and yielded reconstructions of six differently sized Vipp1 rings from negatively stained images at resolutions between 20 to 30 Å. Furthermore, mutational analyses identified specific N-terminal amino acids that are essential for ring formation. On the basis of these analyses and previously published results, a hypothetical model of the Vipp1 tertiary and quaternary structure was generated.rnAChBP is a water-soluble protein in the hemolymph of mollusks. It is a structural and functional homologue of the ligand-binding domain of nicotinic acetylcholine receptors. For the freshwater snail Biomphalaria glabrata, we previously described two types of AChBP (BgAChBP1 and BgAChBP2). In this work, a 6 Å 3-D reconstruction of native BgAChBP is presented, which shows a dodecahedral assembly that is unprecedented for an AChBP. Single particle analysis of recombinantely expressed BgAChBP types led to preliminary results show- ing a dodecahedral assembly of BgAChBP1 and a dipentameric assembly of BgAChBP2. This indicates divergent biological functions of the two types.