Die funktionelle Bedeutung von MSP und Lactadherin im Rahmen der Atherosklerose

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss zweier möglicher Biomarker auf die Atherosklerose untersucht.rnMilk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8, Lactadherin) ist ein Glycoprotein, das vornehmlich von Makrophagen, glatten Muskelzellen und Endothelzellen sezerniert wird. MFG-E8-/--Mäuse zeigen vermehrt apoptotische Zellen in der atherosklerotischen Plaque, verstärkte Inflammationszeichen und vergrößerte Läsionen. In situ-Hybridisierung und Immunfluoreszenz zeigen eine starke Lactadherin-Expression in den Schaumzellen atherosklerotischer Plaques von Apo E-/-, Apo E-/-/GPx 1-/-und LDLR-/- Mäusen, vor allem in der Nähe des Lipid Core. Dort kolokalisiert Lactadherin mit dem Makrophagenmarker CD 68 und dem Chemokin Fraktalkin, das die MFG-E8 Sekretion stimuliert und so die Phagocytose forciert. Untersuchungen mittels RTD-PCR ergaben, dass Peritonealmakrophagen der Genotypen Apo E-/-, Apo E-/-/GPx 1-/- und GPx 1-/-, deren Gemeinsamkeit eine höhere Empfindlichkeit gegenüberrnoxidativem Stress ist, mehr Lactadherin exprimieren als andere Genotypen (B6, LDLR-/-). Die Inkubation muriner oder humaner Makrophagen mit oxLDL und eLDL hat keinen Einfluss auf die Expression der MFG-E8 mRNA. Der Kontakt mit apoptotischer Zellen hingegen erhöht die Expression signifikant. Lactadherin ist entscheidend für die effektive Phagozytose apoptotischer Zellen in der atherosklerotischen Läsion. Seine Expression wird vermutlich durch die Apoptose in der Nähe liegender Zellen und das verstärkte Vorkommen von ROS reguliert. Macrophage stimulating protein (MSP) übt Einfluss auf Migration, Proliferation und Phagocytose von Makrophagen aus. Seine Beteiligung an inflammatorischen Vorgängen und der Karzinogenese ist intensiv untersucht worden, nicht jedoch der Einfluss auf die Atherosklerose. Es ist bekannt, dass der SNP rs3197999 mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) assoziiert ist. Zudem geht er vermutlich mit einem erniedrigten Atheroskleroserisiko einher. Der Polymorphismus c2078t hat den Aminosäureaustausch R689C zur Folge. Rekombinant erzeugtes, mutantes und wildtypisches MSP induziert Migration und Proliferation bei THP-1-Makrophagen. MSPmut vermittelt dies jedoch wesentliche effektiver als MSPwt. Apoptose hingegen wird durch keine der Formen induziert. R689C führt zu einem “gain of function” des MSP-Proteins in Bezug auf die Proliferations- und Migrationsfähigkeit von Makrophagen und verändert vermutlich deren Cytokinfreisetzung. Dies führt möglicherweise zu einer erhöhten Phagocytoseeffizienz in der atherosklerotischen Läsion (erniedrigtes Atherosklerose-Risiko), und zu einer aberranten immunologischen Reaktion im Rahmen der CED (erhöhtes CED-Risiko).

Interactions of inhaled nanoparticles with the alveolar-capillary barrier of the human respiratory tract

In dieser Arbeit wurden zytotoxische Effekte sowie die inflammatorische Reaktionen des distalen respiratorischen Traktes nach Nanopartikelexposition untersucht. Besondere Aufmerksamkeit lag auch auf der Untersuchung unterschiedlicher zellulärer Aufnahmewege von Nanopartikeln wie z.B. Clathrin- oder Caveolae-vermittelte Endozytose oder auch Clathrin- und Caveolae-unabhängige Endozytose (mit möglicher Beteiligung von Flotillinen). Drei unterschiedliche Nanopartikel wurden hierbei gewählt: amorphes Silica (aSNP), Organosiloxan (AmorSil) und Poly(ethyleneimin) (PEI). Alle unterschiedlichen Materialien gewinnen zunehmend an Interesse für biomedizinische Forschungsrichtungen (drug and gene delivery). Insbesondere finden aSNPs auch in der Industrie vermehrt Anwendung, und stellen somit ein ernstzunehmendes Gesundheitsrisiko dar. Dieser wird dadurch zu einem begehrten Angriffsziel für pharmazeutische Verabreichungen von Medikamenten über Nanopartikel als Vehikel aber bietet zugleich auch eine Angriffsfläche für gesundheitsschädliche Nanomaterialien. Aus diesem Grund sollten die gesundheitsschädigenden Risiken, sowie das Schicksal von zellulär aufgenommenen NPs sorgfältig untersucht werden. In vivo Studien an der alveolaren-kapillaren Barriere sind recht umständlich. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit ein Kokulturmodel benutzt, dass die Alveolar-Kapillare Barrier in vivo nachstellt. Das Model besteht aus dem humanen Lungenepithelzelltyp (z.B. NCI H441) und einem humanen microvasculären Endothelzelltyp (z.B. ISO-HAS-1), die auf entgegengesetzten Seiten eines Transwell-Filters ausgesät werden und eine dichte Barriere ausbilden. Die NP Interaktion mit Zellen in Kokultur wurde mit denen in konventioneller Monokultur verglichen, in der Zellen 24h vor dem Experiment ausgesät werden. Diese Studie zeigt, dass nicht nur die polarisierte Eigenschaft der Zellen in Kokultur sondern auch die unmittelbare Nähe von Epithel und Endothelzelle ausschlaggebend für durch aSNPs verursachte Effekte ist. Im Hinblick auf inflammatorische Marker (sICAM, IL-6, IL8-Ausschüttung), reagiert die Kokultur auf aSNPs empfindlicher als die konventionelle Monokultur, wohingegen die Epithelzellen in der Kokultur auf zytotoxikologischer Ebene (LDH-Ausschüttung) unempfindlicher auf aSNPs reagierten als die Zellen in Monokultur. Aufnahmestudien haben gezeigt, dass die Epithelzellen in Kokultur entschieden weniger NPs aufnehmen. Somit zeigen die H441 in der Kokultur ähnliche epitheliale Eigenschaften einer schützenden Barriere, wie sie auch in vivo zu finden sind. Obwohl eine ausreichende Aufnahme von NPs in H441 in Kokultur erreicht werden konnte, konnte ein Transport von NPs durch die epitheliale Schicht und eine Aufnahme in die endotheliale Schicht mit den gewählten Inkubationszeiten nicht gezeigt werden. Eine Clathrin- oder Caveolae-vermittelte Endozytose von NPs konnte mittels Immunfluoreszenz weder in der Mono- noch in der Kokultur nachgewiesen werden. Jedoch zeigte sich eine Akkumulation von NPs in Flotillin-1 und-2 enthaltende Vesikel in Epithelzellen aus beiden Kultursystemen. Ergebnisse mit Flotillin-inhibierten (siRNA) Epithelzellen, zeigten eine deutlich geringere Aufnahme von aSNPs. Zudem zeigte sich eine eine reduzierte Viabilität (MTS) von aSNP-behandelten Zellen. Dies deutet auf eine Beteiligung von Flotillinen an unbekannten (Clathrin oder Caveolae -unabhängig) Endozytosemechanismen und (oder) endosomaler Speicherung. Zusammenfassend waren die Aufnahmemechanismen für alle untesuchten NPs in konventioneller Monokultur und Kokultur vergleichbar, obwohl sich die Barriereeigenschaften deutlich unterscheiden. Diese Arbeit zeigt deutlich, dass sich die Zellen in Kokultur anders verhalten. Die Zellen erreichen hierbei einen höheren Differenzierungsgrad und eine Zellkommunikation mit anderen relevanten Zelltypen wird ermöglicht. Durch das Einbringen eines dritten relevanten Zelltyps in die Kokultur, des Alveolarmakrophagen (Zelllinie THP-1), welcher die erste Verteidigungsfront im Alveolus bildet, wird diese Aussage weiter bekräftigt. Erste Versuche haben gezeigt, dass die Triplekultur bezüglich ihrer Barriereeigenschaften und IL-8-Ausschüttung sensitiver auf z.B. TNF- oder LPS-Stimulation reagiert als die Kokultur. Verglichen mit konventionellen Monokulturen imitieren gut ausgebildete, multizelluräre Kokulturmodelle viel präziser das zelluläre Zusammenspiel im Körper. Darum liefern Nanopartikelinteraktionen mit dem in vitro-Triplekulturmodel aufschlussreichere Ergebnisse bezüglich umweltbedingter oder pharmazeutischer NP-Exposition in der distalen Lung als es uns bisher möglich war.

Vergleichende Untersuchungen zur funktionellen Wechselwirkung von T-Helferzellen, regulatorischen T-Zellen und dendritischen Zellen

Dendritische Zellen (DC) verbinden angeborene und adaptive Immunität. Abhängig vom Aktivierungsgrad vermitteln sie Toleranz oder Immunität. Hier wurden konventionelle DC (kDC) und plasmazytoide DC (pDC) hinsichtlich ihrer T-Zellstimulation in An- und Abwesenheit regulatorischer T Zellen (Treg) verglichen. Als starke T-Zellstimulatoren induzieren aktivierte kDC Treg-Proliferation. Proliferierende Treg sind nicht suppressiv, weshalb T-Effektorzellen nach kDC-Stimulation in Treg-Anwesenheit proliferieren. Demgegenüber vermitteln aktivierte pDC nur schwache T-Zellstimulation, die aber ausreicht T-Effektorzellproliferation auszulösen. Aktivierte pDC brechen aber nicht die Anergie von Treg und induzieren daher nicht ihre Proliferation. Trotz der geringen T-Zellstimulation sind pDC in der Lage Proliferation und Expansion von T-Effektorzellen in Treg-Gegenwart zu bewirken. Dies konnte auf ein insuffizientes pDC-vermitteltes T-Zellrezeptorsignal für Treg zurückgeführt werden, das keine funktionelle pDC-vermittelte Treg-Aktivierung bewirkt.rnUnter homöostatischen Bedingung vermitteln DC Toleranz, so induzieren unreife kDC Treg in der Peripherie. Hierbei ist eine ICOS-vermittelte Kostimulation essentiell für die Induktion des IL-10-Rezeptors auf T-Zellen. Ein gleichzeitiges starkes CD28-Signal überkommt den ICOS-vermittelten Effekt und wirkt der IL-10R-Expression entgegen. Daher führt nur die Stimulation mit unreifen kDC zu IL-10-sensitiven T-Zellen in denen dann ein anergischer Phänotyp etabliert wird, der Teil des Differenzierungsprozesses zur induzierten Treg ist. Die ICOS/ICOS-L-Interaktion ist somit zentral für die Aufrechterhaltung peripherer Toleranz.rn

Zur Rolle der Antigendosis in IgE-vermittelten Immunantworten und der allergischen Atemwegsentzündung

Die Verabreichung von hohen Antigendosen im Rahmen der allergenspezifischen Immuntherapie (SIT) resultiert in der Induktion einer allergenspezifischen Toleranz in sensibilisierten Patienten. Vorangegangene Studien der Klinischen Forschergruppe Allergie identifizierten CD4-CD8- doppelt-negative T-Zellen (dnTZ), welche nach wiederholter intraperitonealer Injektion von hohen Dosen (HD) des an das Adjuvans Aluminiumhydroxid adsorbierten Antigens Keyhole Limpet Hemocyanin in Mäusen induziert wurden, als potente Suppressorzellen für die IgE-Produktion. Mäuse, die hingegen mit niedrigen Dosen (LD) desselben Antigens behandelt wurden, entwickelten eine starke, persistierende IgE-Immunantwort. rnIm Fokus meiner Doktorarbeit stand die phänotypische Charakterisierung der dnTZ aus HD-Mäusen sowie die Aufklärung möglicher inhibitorischer Wirkmechanismen. In Erweiterung der bisherigen Arbeiten und in Anlehnung an die klinische Praxis bei der Durchführung der SIT habe ich bei meinen Untersuchungen die subkutane Injektion ohne Adjuvans als alternative Applikationsroute verwendet. In meinen Studien konnte ich durch die zusätzliche Verwendung des klinisch relevanten Allergens Ovalbumin die Allgemeingültigkeit des Konzepts der antigendosisabhängigen Regulation der IgE- Produktion durch dnTZ verifizieren. Die Vakzinierung mit hohen Antigendosen verhinderte die Ausbildung einer IgE-Produktion in antigenspezifischer Weise. HD- Mäuse wiesen in vitro eine geringere Aktivierung von TH2-Zellen als LD-Mäuse auf. Im Mausmodell der allergischen Atemwegsentzündung wiesen HD-Mäuse eine reduzierte Atemwegsreaktivität sowie eine geringere pulmonale TH2-Zytokin- produktion auf. rnIch konnte zudem tendenziell eine leicht erhöhte Anzahl von dnTZ in HD-Mäusen messen. Die in HD-Mäusen induzierten dnTZ habe ich durchflusszytometrisch charakterisiert, konnte jedoch keinen eindeutigen Marker für suppressive dnTZ identifizieren. In einem adoptiven Transferexperiment war eine T-Zellpopulation von HD-Mäusen aus der γδ-T-Zell-Rezeptor-tragende T-Zellen depletiert worden waren, ähnlich wie die Ausgangs-T-Zellpopulation in der Lage die IgE-Produktion in den Rezipienten zu inhibieren, was darauf schließen lässt, dass die untersuchten regulatorischen dnTZ einen αβ-T-Zell-Rezeptor exprimieren. rn

Die Rolle von Chemokinrezeptor CXCR4 und Connective Tissue Growth Factor innerhalb der Tumor-Stroma-Interaktion in der akuten myeloischen Leukämie

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine heterogene Erkrankung der hämatopoetischen Vorläuferzelle, die durch unkontrollierte Vermehrung und ein reduziertes Differenzierungsverhalten gekennzeichnet ist. Aufgrund von Therapieresistenzen und häufig vorkommenden Rückfällen ist die AML mit einer schlechten Langzeitprognose verbunden. Neue Studienergebnisse zeigen, dass leukämische Zellen einer hierarchischen Ordnung unterliegen, an deren Spitze die leukämische Stammzelle (LSC) steht, welche den Tumor speist und ähnliche Charakteristika besitzt wie die hämatopoetische Stammzelle. Die LSC nutzt den Kontakt zu Zellen der hämatopoetischen Nische des Knochenmarks, um die erste Therapie zu überdauern und Resistenzen zu erwerben. Neue Therapieansätze versuchen diese Interaktion zwischen leukämischen Zellen und supportiv wirkenden Stromazellen anzugreifen. rnrnIn dieser Arbeit sollte die Bedeutung des CXC-Motiv Chemokinrezeptors Typ 4 (CXCR4) und des Connective Tissue Growth Factors (CTGF) innerhalb der AML-Stroma-Interaktion untersucht werden. CXCR4, der in vivo dafür sorgt, dass AML-Zellen in der Nische gehalten und geschützt werden, wurde durch den neuwertigen humanen CXCR4-spezifischen Antikörper BMS-936564/MDX-1338 in AML-Zelllinien und Patientenzellen in Zellkulturversuchen blockiert. Dies induzierte Apoptose sowie Differenzierung und führte in Kokulturversuchen zu einer Aufhebung des Stroma-vermittelten Schutzes gegenüber der Chemotherapie. Für diese Effekte musste teilweise ein sekundärer Antikörper verwendet werden, der die CXCR4-Moleküle miteinander kreuzvernetzt.rnDie Auswertung eines quantitativen Real time PCR (qPCR)-Arrays ergab, dass CTGF in der AML-Zelllinie Molm-14 nach Kontakt zu Stromazellen hochreguliert wird. Diese Hochregulation konnte in insgesamt drei AML-Zelllinien sowie in drei Patientenproben in qPCR- und Western Blot-Versuchen bestätigt werden. Weitere Untersuchungen zeigten, dass diese Hochregulation (i) unabhängig von der Stromazelllinie ist, (ii) den direkten Kontakt zum Stroma benötigt und (iii) auch unter hypoxischen Bedingungen, wie sie innerhalb des Knochenmarks vorherrschen, stattfindet. Der durch Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Kontakt gesteuerte Hippo-Signalweg konnte aus folgenden Gründen als möglicher upstream-Regulationsmechanismus identifiziert werden: (i) Dessen zentraler Transkriptions-Kofaktor TAZ wurde in kokultivierten Molm-14-Zellen stabilisiert, (ii) der shRNA-gesteuerte Knockdown von TAZ führte zu einer reduzierten CTGF-Hochregulation, (iii) CTGF wurde in Abhängigkeit von der Zelldichte reguliert, (iv) Cysteine-rich angiogenic inducer 61 (Cyr61), ein weiteres Zielgen von TAZ, wurde in kokultivierten AML-Zellen ebenfalls verstärkt exprimiert. Der Knockdown von CTGF führte in vitro zu einer partiellen Aufhebung der Stroma-vermittelten Resistenz und die Blockierung von CTGF durch den Antikörper FG-3019 wirkte im AML-Mausmodell lebensverlängernd. rn rnDie Rolle von CTGF in der AML ist bisher nicht untersucht. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass CTGF ein interessantes Therapieziel in der AML darstellt. Es bedarf weiterer Untersuchungen, um die Bedeutung von CTGF in der Tumor-Stroma-Interaktion näher zu charakterisieren und nachgeschaltete Signalwege zu identifizieren.

Einfluss des Treg-Aktivierungsmarkers GARP auf die Differenzierung und Funktion von T-Zellen

CD4+CD25+FoxP3+ regulatorische T-Zellen (Treg) spielen eine essentielle Rolle bei der Unterdrückung von schädlichen Immunreaktionen. Da aktivierte CD4+ T-Helferzellen auch CD25 und FoxP3 exprimieren, können diese nicht als spezifische Marker zur Identifikation von Treg verwendet werden. Die Analyse der Membranproteinexpression beider Populationen führte zur Identifikation von GARP (glycoprotein A repetitions predominant) als spezifischer Marker auf aktivierten Treg. GARP bindet LAP und TGF-beta, welches für die Unterdrückung von entzündlichen T-Zellantworten von Bedeutung ist. Um die Funktion von GARP unabhängig von Treg zu untersuchen, wurde ein lösliches GARP Protein (sGARP) synthetisiert und sein Effekt auf die Aktivierung und Differenzierung von humanen T-Zellen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass sGARP die Proliferation von naiven CD4+ T-Zellen supprimiert und zu einer Phosphorylierung von SMAD2/3 sowie zu der Induktion von FoxP3 führt. Zusätzlich inhibiert sGARP die Produktion von Effektorzytokinen wie IL-2 und IFN-gamma. Die Stimulation von naiven CD4+ T-Zellen mit sGARP induziert die Differenzierung zu Treg, welche in Kokultur die Aktivierung von T-Effektorzellen supprimieren. Die Wirkung war vergleichbar in naiven CD4+ und ruhenden CD4+CD45RA+ T-Zellen, konnte aber in differenzierten CD4+CD45RO+ T-Zellen nicht nachgewiesen werden. Die Induktion von FoxP3 und die Phosphorylierung von SMAD2/3 konnte durch eine Blockade des TGF-beta-Signalweges inhibiert werden. Dies lässt vermuten, dass die Funktion von sGARP zumindest teilweise von TGF-beta abhängig ist. Zusätzlich zu seiner passiven Rolle als TGF-beta-Transporter, induzierte sGARP die TGF-beta-Produktion in naiven T-Zellen und trägt so zum Mechanismus der infektiösen Toleranz bei. Des Weiteren fördert die Stimulation von sGARP in Anwesenheit von IL-6 und IL-23 die Differenzierung zu Th17 Zellen. rnNeben dem Einfluss von sGARP auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, supprimiert sGARP die Proliferation und Granzyme B-Expression in CD8+ T-Zellen. rnFür die Analyse der immunmodulatorischen Funktion von sGARP in vivo wurde ein Modell einer xenogenen GvHD (graft-versus-host disease) verwendet. Der Transfer von humanen PBMC in neugeborene, immundefiziente Rag2-/-gamma-chain-/--Mäuse führt zu einer letalen GvHD, welche durch die Applikation von humanen Treg dosisabhängig unterdrückt werden kann. In diesem Modell konnte die repetitive Gabe von sGARP, ohne zusätzliche Zugabe von Treg, ebenfalls die GvHD unterdrücken. Dies lässt auf einen synergistischen Effekt von sGARP und Treg bei der Suppression inflammatorischer T-Zellantworten schließen. rnZusammengefasst lassen die Ergebnisse auf eine entscheidende Rolle von GARP in der Modulation der peripheren Toleranz folgern und zeigen sGARP als potentes Biological für die Behandlung von unerwünschten inflammatorischen Immunantworten.