Generation of FLT3-ITD-reactive T-cell populations from different sources

Approximately 25% of acute myeloid leukemias (AMLs) carry internal tandem duplications (ITD) of various lengths within the gene encoding the FMS-like tyrosine kinase receptor 3 (FLT3). Although varying duplication sites exist, most of these length mutations affect the protein´s juxtamembrane domain. FLT3-ITDs support leukemic transformation by constitutive phosphorylation resulting in uncontrolled activation, and their presence is associated with worse prognosis. As known form previous work, they represent leukemia- and patient-specific neoantigens that can be recognized by autologous AML-reactive CD8+ T cells (Graf et al., 2007; Graf et al., unpublished). Herein, in patient FL, diagnosed with FLT3-ITD+ AML and in first complete remission after induction chemotherapy, T cells against her leukemia´s individual FLT3-ITD were detected at a frequency up to 1.7x10-3 among peripheral blood CD8+ T lymphocytes. This rather high frequency suggested, that FLT3-ITD-reactive T cells had been expanded in vivo due to the induction of an anti-leukemia response.rnrnCell material from AML patients is limited, and the patients´ anti-leukemia T-cell repertoire might be skewed, e.g. due to complex previous leukemia-host interactions and chemotherapy. Therefore, allogeneic sources, i.e. buffy coats (BCs) from health donors and umbilical cord blood (UCB) donations, were exploited for the presence and the expansion of FLT3-ITD-reactive T-cell populations. BC- and UCB-derived CD8+ T cells, were distributed at 105 cells per well on microtiter plates and, were stimulated with antigen-presenting cells (APCs) transfected with in vitro-transcribed mRNA (IVT-mRNA) encoding selected FTL3-ITDs. APCs were autologous CD8- blood mononuclear cells, monocytes or FastDCs.rnrnBuffy coat lymphocytes from 19 healthy individuals were analyzed for CD8+ T-cell reactivity against three immunogenic FLT3-ITDs previously identified in patients VE, IN and QQ and designated as VE_, IN_ and QQ_FLT3-ITD, respectively. These healthy donors carried at least one of the HLA I alleles known to present an ITD-derived peptide from one of these FLT3-ITDs. Reactivities against single ITDs were observed in 8/19 donors. In 4 donors the frequencies of ITD-reactive T cells were determined and were estimated to be in the range of 1.25x10-6 to 2.83x10-7 CD8+ T cells. These frequencies were 1,000- to 10,000-fold lower than the frequency of autologous FLT3-ITD-reactive T cells observed in patient FL. Restricting HLA I molecules were identified in two donors. In one of them, the recognition of VE_FLT3-ITD was found to be restricted by HLA-C*07:02, which is different from the HLA allele restricting the anti-ITD T cells of patient VE. In another donor, the recognition of IN_FLT3-ITD was restricted by HLA-B*35:01, which also had been observed in patient IN (Graf et al., unpublished). By gradual 3´-fragmentation of the IN_FLT3-ITD cDNA, the 10-mer peptide CPSDNEYFYV was identified as the target of allogeneic T cells against IN_FLT3-ITD. rnLymphocytes in umbilical cord blood predominantly exhibit a naïve phenotype. Seven UCB donations were analyzed for T-cell responses against the FLT3-ITDs of patients VE, IN, QQ, JC and FL irrespective of their HLA phenotype. ITD-reactive responses against all stimulatory FLT3-ITDs were observed in 5/7 UCB donations. The frequencies of T cells against single FLT3-ITDs in CD8+ lymphocytes were estimated to be in the range of 1.8x10-5 to 3.6x10-6, which is nearly 15-fold higher than the frequencies observed in BCs. Restricting HLA I molecules were identified in 4 of these 5 positive UCB donations. They were mostly different from those observed in the respective patients. But in one UCB donation T cells against the JC_FLT3-ITD had exactly the same peptide specificity and HLA restriction as seen before in patient JC (Graf et al., 2007). Analyses of UCB responder lymphocytes led to the identification of the 10-mer peptide YESDNEYFYV, encoded by FL_FLT3-ITD, that was recognized in association with the frequent allele HLA-A*02:01. This peptide was able to stimulate and enrich ITD-reactive T cells from UCB lymphocytes in vitro. Peptide responders not only recognized the peptide, but also COS-7 cells co-transfected with FL_FLT3-ITD and HLA-A*02:01.rnrnIn conclusion, T cells against AML- and individual-specific FLT3-ITDs were successfully generated not only from patient-derived blood, but also from allogeneic sources. Thereby, ITD-reactive T cells were detected more readily and at higher frequencies in umbilical cord blood than in buffy coat lymphocytes. It occurred that peptide specificity and HLA restriction of allogeneic, ITD-reactive T cells were identical to autologous patient-derived T cells. As shown herein, allogeneic, FLT3-ITD-reactive T cells can be used for the identification of FLT3-ITD-encoded peptides, e.g. for future therapeutic vaccination studies. In addition, these T cells or their receptors can be applied to adoptive transfer.

Untersuchungen zur selektiven Deletion alloreaktiver Spender-T- Lymphozyten durch CD178-modifizierte dendritische Zellen im Rahmen der allogenen Blutstammzelltransplantation

Eine der häufigsten Komplikationen bei der allogenen Blutstammzelltransplantation stellt die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (Graft versus Host Disease, GvHD) dar. Sie wird durch allogene Spender-T-Lymphozyten verursacht, die Gewebe des Transplantatempfängers erkennen und inflammatorische Entzündungsprozesse auslösen. Neben dieser Alloreaktivität induzieren Spender-T-Lymphozyten jedoch auch immuntherapeutisch erwünschte Transplantat-gegen-Leukämie-Reaktionen (Graft versus Leukemia, GvL-Reaktion), bei denen residuelle Tumor- bzw. Leukämiezellen im Patienten durch Spender-T-Zellen spezifisch erkannt und eliminiert werden. Im Rahmen einer verbesserten Immmuntherapie wird daher versucht, GvHD-reaktive und GvL-reaktive Spender-T-Lymphozyten effizient voneinander zu separieren und so eine wirkungsvolle GvHD-Prophylaxe bzw. optimierte GvL-Induktion zu erreichen. In diesem Kontext war es Ziel dieser Arbeit, murine dendritische Zellen (DZ) so zu modifizieren, daß sie für die spezifische Deletion alloreaktiver T-Zellen in murinen GvHD/GvL-Tiermodellen eingesetzt werden können. Die Modifikation der DZ sollte dazu führen, daß über das CD95/CD178-System Aktivierungs-induzierter Zelltod (activation induced cell death, AICD) in alloreaktiven T-Zellen ausgelöst wird. Hierzu wurden für die Modifikation der DZ zwei verschiedene Mechanismen angewandt: a) die Transfektion der DZ mit CD178-mRNA sowie b) die zielgerichtete Immobilisierung von hCD178-X-Fusionsproteinen auf Oberflächenmolekülen von DZ bzw. T-Zellen. Als Positivkontrolle für die Induktion CD95-vermittelter Apoptose diente der agonistische anti-CD95-Antikörper Jo2. Bei der Transfektion muriner DZ mit mRNA zeigte sich anhand des Reportergens EGFP, daß aus dem Knochenmark generierte DZ mit hoher Effizienz mit EGFP-mRNA transfizierbar waren. Im Falle von hCD178-mRNA führte die Transfektion jedoch zu einer insuffizienten CD178-Expression, die mit den regulatorischen Eigenschaften der zytoplasmatischen CD178-Region in Verbindung gebracht werden konnte. So führte die Verwendung einer zytoplasmatisch trunkierten Form der CD178-mRNA (CD178Dzyt) zu einer durchflußzytometrisch nachweisbaren CD178-Expression in DZ. Mit diesen CD178Dzyt-exprimierenden DZ konnte in einem Proliferationstest die Proliferation alloreaktiver T-Zellen inhibiert werden. Die Beladung von DZ bzw. von T-Zellen mit hCD178-X-Fusionsproteinen führte in vitro ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion von Alloreaktivität. Dabei konnte eine spezifische Deletion/Inhibition alloreaktiver T-Zellen nachgewiesen werden. Die Elimination alloreaktiver T-Zellen erfolgte in beiden Verfahren über AICD. Darüber hinaus wurde eine Bifunktionalität der Fusionsproteine festgestellt, da sie neben der Induktion CD95-vermittelter Apoptose auch in der Lage waren, die Kostimulation allogener T-Zellen effizient zu inhibieren. Mit Hilfe adoptiver T-Zell-Transferexperimente konnten abschließend die in vitro gewonnenen Ergebnisse in vivo in zwei verschiedenen GvHD-Mausmodellen bestätigt werden.

In vitro generation and characterization of acute myeloid leukemia-reactive CD8 + cytotoxic T-lymphocyte clones from healthy donors

Donor-derived CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) eliminating host leukemic cells mediate curative graft-versus-leukemia (GVL) reactions after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). The leukemia-reactive CTLs recognize hematopoiesis-restricted or broadly expressed minor histocompatibility and leukemia-associated peptide antigens that are presented by human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on recipient cells. The development of allogeneic CTL therapy in acute myeloid leukemia (AML) is hampered by the poor efficiency of current techniques for generating leukemia-reactive CTLs from unprimed healthy donors in vitro. In this work, a novel allogeneic mini-mixed lymphocyte/leukemia culture (mini-MLLC) approach was established by stimulating CD8+ T cells isolated from peripheral blood of healthy donors at comparably low numbers (i.e. 10e4/well) with HLA class I-matched primary AML blasts in 96-well microtiter plates. Before culture, CD8+ T cells were immunomagnetically separated into CD62L(high)+ and CD62L(low)+/neg subsets enriched for naive/central memory and effector memory cells, respectively. The application of 96-well microtiter plates aimed at creating multiple different responder-stimulator cell compositions in order to provide for the growth of leukemia-reactive CTLs optimized culture conditions by chance. The culture medium was supplemented with interleukin (IL)-7, IL-12, and IL-15. On day 14, IL-12 was replaced by IL-2. In eight different related and unrelated donor/AML pairs with complete HLA class I match, numerous CTL populations were isolated that specifically lysed myeloid leukemias in association with various HLA-A, -B, or -C alleles. These CTLs recognized neither lymphoblastoid B cell lines of donor and patient origin nor primary B cell leukemias expressing the corresponding HLA restriction element. CTLs expressed T cell receptors of single V-beta chain families, indicating their clonality. The vast majority of CTL clones were obtained from mini-MLLCs initiated with CD8+ CD62L(high)+ cells. Using antigen-specific stimulation, multiple CTL populations were amplified to 10e8-10e10 cells within six to eight weeks. The capability of mini-MLLC derived AML-reactive CTL clones to inhibit the engraftment of human primary AML blasts was investigated in the immunodeficient nonobese diabetic/severe combined immune deficient IL-2 receptor common γ-chain deficient (NOD/SCID IL2Rγnull) mouse model. The leukemic engraftment in NOD/SCID IL2Rγnull was specifically prevented if inoculated AML blasts had been pre-incubated in vitro with AML-reactive CTLs, but not with anti-melanoma control CTLs. These results demonstrate that myeloid leukemia-specific CTL clones capable of preventing AML engraftment in mice can be rapidly isolated from CD8+ CD62L(high)+ T cells of healthy donors in vitro. The efficient generation and expansion of these CTLs by the newly established mini-MLLC approach opens the door for several potential applications. First, CTLs can be used within T cell-driven antigen identification strategies to extend the panel of molecularly defined AML antigens that are recognizable by T cells of healthy donors. Second, because these CTLs can be isolated from the stem cell donor by mini-MLLC prior to transplantation, they could be infused into AML patients as a part of the stem cell allograft, or early after transplantation when the leukemia burden is low. The capability of these T cells to expand and function in vivo might require the simultaneous administration of AML-reactive CD4+ T cells generated by a similar in vitro strategy or, less complex, the co-transfer of CD8-depleted donor lymphocytes. To prepare clinical testing, the mini-MLLC approach should now be translated into a protocol that is compatible with good manufacturing practice guidelines.

Immunevasion des murinen Cytomegalovirus: Regulatoren der MHC-Klasse-I vermittelten Antigenpräsentation

Zu den Immunevasionsmechanismen des murinen Cytomegalovirus, die sich im Laufe der Koevolution von Virus und Wirt entwickelt haben, gehört die Interferenz von drei viralen Regulatoren mit der Antigenpräsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle, wodurch die Aktivierung von zytotoxischen CD8 T-Zellen beeinflusst wird: Während m152/gp40 peptidbeladene MHC-Klasse-I-Komplexe im cis-Golgi-Kompartiment akkumuliert, führt m06/gp48 diese Komplexe der lysosomalen Degradation zu. Im Gegensatz dazu vermittelt m04/gp34 deren Transport an die Zelloberfläche, wurde in der Literatur bisher aber trotzdem als Inhibitor der CD8 T-Zellaktivierung beschrieben. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss dieser viralen Proteine auf die Peptidpräsentation bzw. die T-Zellaktivierung zu untersuchen. Dazu wurde ein Set von Viren verwendet, das neben mCMV-WT aus mCMV-Deletionsmutanten besteht, die jedes der regulatorischen Proteine einzeln bzw. in allen möglichen Kombinationen exprimieren, einschließlich einer Mutante, die keines der Proteine besitzt. Entgegen der bisher gültigen Annahme konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass m04/gp34 die Antigenpräsentation nicht inhibiert. Wird es allein exprimiert, bleibt die T-Zellaktivierung unbeeinflusst. Wird es zusammen mit m152/gp40 exprimiert, stellt es die T-Zellaktivierung wieder her, indem es den herunter regulierenden Effekt von m152/gp40 antagonisiert. Dieser positiv regulierende Effekt von m04/gp34 wird wiederum durch m06/gp48 aufgehoben. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, wie die verschiedenen Effekte dieser Virusproteine in vivo das Überleben im infizierten Wirt steuern. So wird im adoptiven Transfermodell die Infektion mit der Deletionsmutante, die m152/gp40 alleine exprimiert, schlechter kontrolliert als die Infektion mit der m152/gp40 und m04/gp34 exprimierenden Mutante. Dieser die CD8 T-Zellkontrolle verbessernde Effekt von m04/gp34 wird durch m06/gp48 wieder aufgehoben. Dass ein viraler Erreger nicht nur negative Regulatoren der Antigenpräsentation exprimiert, sondern auch einen positiven Regulator, der den Effekt eines negativen Regulators wieder aufhebt, ist in der Literatur beispiellos. Durch differentielle Expression dieser Regulatoren eröffnet sich damit dem Virus die Möglichkeit, die Antigenpräsentation gezielt zu modulieren.

Vibrational spectroscopic and electrochemical investigations of multi-centered heme proteins in biomimetic membrane architectures

Membrane proteins play a major role in every living cell. They are the key factors in the cell’s metabolism and in other functions, for example in cell-cell interaction, signal transduction, and transport of ions and nutrients. Cytochrome c oxidase (CcO), as one of the membrane proteins of the respiratory chain, plays a significant role in the energy transformation of higher organisms. CcO is a multi centered heme protein, utilizing redox energy to actively transport protons across the mitochondrial membrane. One aim of this dissertation is to investigate single steps in the mechanism of the ion transfer process coupled to electron transfer, which are not fully understood. The protein-tethered bilayer lipid membrane is a general approach to immobilize membrane proteins in an oriented fashion on a planar electrode embedded in a biomimetic membrane. This system enables the combination of electrochemical techniques with surface enhanced resonance Raman (SERRS), surface enhanced reflection absorption infrared (SEIRAS), and surface plasmon spectroscopy to study protein mediated electron and ion transport processes. The orientation of the enzymes within the surface confined architecture can be controlled by specific site-mutations, i.e. the insertion of a poly-histidine tag to different subunits of the enzyme. CcO can, thus, be oriented uniformly with its natural electron pathway entry pointing either towards or away from the electrode surface. The first orientation allows an ultra-fast direct electron transfer(ET) into the protein, not provided by conventional systems, which can be leveraged to study intrinsic charge transfer processes. The second orientation permits to study the interaction with its natural electron donor cytochrome c. Electrochemical and SERR measurements show conclusively that the redox site structure and the activity of the surface confined enzyme are preserved. Therefore, this biomimetic system offers a unique platform to study the kinetics of the ET processes in order to clarify mechanistic properties of the enzyme. Highly sensitive and ultra fast electrochemical techniques allow the separation of ET steps between all four redox centres including the determination of ET rates. Furthermore, proton transfer coupled to ET could be directly measured and discriminated from other ion transfer processes, revealing novel mechanistic information of the proton transfer mechanism of cytochrome c oxidase. In order to study the kinetics of the ET inside the protein, including the catalytic center, time resolved SEIRAS and SERRS measurements were performed to gain more insight into the structural and coordination changes of the heme environment. The electrical behaviour of tethered membrane systems and membrane intrinsic proteins as well as related charge transfer processes were simulated by solving the respective sets of differential equations, utilizing a software package called SPICE. This helps to understand charge transfer processes across membranes and to develop models that can help to elucidate mechanisms of complex enzymatic processes.

Die Identifizierung und Charakterisierung von HLA-Klasse-I-restringierten Minorhistokompatibilitätsantigenen und Leukämie-assoziierten Antigenen mittels cDNA-Expressionsklonierung

Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (allo-HSCT) bietet bei einem hohen Anteil akuter Leukämien die einzige kurative Behandlungsmöglichkeit. Um die mit ihr assoziierte Morbidität und Mortalität zu senken und ihre Effektivität zu steigern, soll die GvL (graft-versus-leukemia)-Reaktion als eigentliches Therapieziel gegenüber der unerwünschten GvHD (graft-versus-host disease) möglichst selektiv verstärkt werden. Wesentliche Mediatoren beider Effekte sind alloreaktive T-Zellen. Bei HLA-Übereinstimmung zwischen Spender und Empfänger sind so genannte Minorhistokompatibilitätsantigene (mHAgs) und Leukämie-assoziierte Antigene (LAA) die mutmaßlichen Zielstrukturen beider Reaktionen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden in dem Leukämie-Modell der Patientin MZ201 [akute myeloische Leukämie (AML) vom Subtyp FAB M5] mittels T-Zell-basierter cDNA-Expressionsklonierung zwei neue Antigene identifiziert, die von allogenen, AML-reaktiven CD8+ T-Lymphozyten aus Blut eines HLA-passenden gesunden Spenders erkannt wurden. Es handelt sich zum einen um das HLA-B*5601-restringierte mHAg PLAUR-317P, das aus einem Polymorphismus des Gens PLAUR (plasminogen activator, urokinase receptor) resultiert. Das von den T-Zellen am Besten erkannte Peptid enthält die Aminosäuren 316 - 327. PLAUR wird in lymphohämatopoetischen Zellen und in verschiedenen Malignomen überexprimiert und ist dabei mit schlechterer Prognose und vermehrter Gewebeinvasivität assoziiert. Etwa 30% getesteter Individuen tragen das Allel PLAUR-317P. Zum anderen handelt es sich um ein Epitop aus der Signalregion des Chemokins CXCL3 [chemokine (C-X-C motif) ligand 3], das von CD8+ T-Zellen des gleichen Spenders auf Leukämiezellen der Patientin MZ201 in Assoziation mit HLA-A*0201 erkannt wurde. Auch CXCL3 wird vorwiegend in Zellen der Myelopoese exprimiert. Aufgrund ihres Expressionsmusters sind beide Antigene potentielle Zielstrukturen für die Elimination der Empfänger-Hämatopoese unter Einschluss der Leukämieblasten im Rahmen der allo-HSCT. Weiterführende Untersuchungen müssen zeigen, ob diese Antigene tatsächlich in vivo GvL-Reaktionen hervorrufen. Die Kenntnis eines repräsentativen Spektrums solcher Antigene würde verbesserte Spenderselektionen erlauben und neue Wege des adoptiven T-Zelltransfers erschließen helfen.

Etablierung eines In-vivo-Modells zur Untersuchung der Rolle epidermaler Langerhanszellen bei der Entstehung der Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung nach allogener Blutstammzelltransplantation

Dendritische Zellen der Haut, wie z.B. die Langerhanszellen (LC) der Epidermis, sind potente antigenpräsentierende Zellen (APC). Nach allogener Blutstammzelltransplantation (engl.: hematopoietic stemm cell transplantation, HSCT) persistieren Empfänger-APC und können Spender-T-Zellen aktivieren. Somit spielen dendritische Zellen eine kritische Rolle bei der Initiierung von akuter Transplantat-Gegen-Wirt-Reaktion (engl.: graft-versus-host-disease, GvHD).rnIn der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem entwickelt, welches humane Haut in einem Xenotransplantationsmodell nutzt, um die Wechselwirkung dieser gewebsständigen APC mit alloreaktiven T-Zellen zu untersuchen. Dafür wurden humane Resthautpräparate von subkutanem Gewebe befreit und intraskaptulär auf immunsupprimierte NOD/LtSz-scid IL2R#-null Mäuse (NSG) transplantiert. Diesen Tieren fehlen funktionale T-, B- und NK-Zellen, und sie tolerieren somit ein xenogenes Transplantat. Im Vergleich zu anderen immundefizienten Stämmen, haben sie eine erhöhte Lebenserwartung und es ist zudem möglich humane Hämatopoese durch Stammzellgabe zu etablieren.rnPublizierte Methoden der Hauttransplantation wurden für diese Arbeit optimiert und weiterentwickelt. So konnte die Erfolgsrate von 44% auf bis zu 95% gesteigert werden. Erste Untersuchungen fokussierten den Einfluss der Wundheilung auf die Verteilung dermaler Zellpopulationen, wie z.B. CD11c positive APC, und die Population der LC in der Epidermis. Während der ersten Wochen der Wundheilung war ein vorübergehendes Verschwinden der LC aus der Epidermis zu beobachten. Im Gegensatz dazu waren CD11c positive dermale Zellen permanent detektierbar. Die zu späteren Zeitpunkten festgestellte Repopulation der Epidermis mit LC unterstützt die Hypothese einer lokalen Vorläuferzelle. Die vorgelegten Daten und die lokale proliferative Aktivität dieser Zellen unterstreichen ihre Unabhängigkeit vom peripheren Blut. Versuche, eine Depletion der LC mittels UVC-Bestrahlung zu erreichen, gelangen nicht. Auch dies spricht für das Vorhandensein eines lokalen Vorläufers.rnZur Induktion von GvHD in der transplantierten Haut wurden in vitro DC des Hautspenders generiert und damit HLA-disparate T-Zellen stimuliert. Auf diese Weise sollte eine maximale Alloreaktivität gegen das Hauttransplantat generiert werden. In allen vorgestellten Systemen ließ sich nach Infusion der T-Lymphozyten in transplantierte Tiere, eine T-Zellinduzierte inflammatorische Reaktion auslösen. Optisch war eine deutliche Rötung des Transplantats feststellbar. Diese war jedoch nur in den Proben besonders deutlich, welche T-Zellen mit vorheriger in vitro Stimulation durch DC des Hautspenders erhalten hatten. Histologisch konnten Anzeichen einer Entzündung nachgewiesen werden. Neben Akanthose und Hyperparakeratose, waren deutliche T-Zellinfiltrate detektierbar. Auch Spaltbildung und Ablösung der Epidermis, sowie vereinzelte Apoptosen der epidermalen Zellen wiesen auf eine GvHD artige Entzündung hin.rnEine weitere Beobachtung nach T-Zellgabe, war die Depletion der LC aus der Epidermis. Auch konnte durch spätere T-Zellgaben keine weitere Hautrötung ausgelöst werden. Dies belegt die Funktion der LC als primäre Zielzelle der alloreaktiven T-Zellen. Unterstrichen wird dies durch Verwendung einer LC defizienten Haut, welche keine Hautrötung oder Anzeichen einer Entzündung entwickelte.rnZusammenfassend wurde für diese Arbeit ein Modellsystem entwickelt, welches es erlaubt Untersuchungen entzündlicher Hautkrankheiten unter Berücksichtigung hautständiger APC durchzuführen. Dabei kann dieses Modell in Zukunft für die Untersuchung von APC modulierenden Agenzien genutzt werden, da präklinische Modelle für spezies-spezifische Therapien bislang fehlten. Das Entstehen einer Entzündung könnte so verhindert oder eine Behandlung ermöglicht werden.

Molekulare Grundlagen der Immunkontrolle des murinen Cytomegalovirus in Gegenwart viruskodierter Immunevasine

Die Kontrolle der Infektion mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) wird primär durch antivirale CD8 T-Zellen vermittelt. Während der Koevolution zwischen Virus und Wirt wurden Immunevasionsmechanismen entwickelt, die direkt die Expression der Peptid-MHC-Klasse-I-Komplexe an der Zelloberfläche beeinflussen und es dem Virus ermöglichen, der Immunkontrolle des Wirtes zu entkommen. Da HCMV und das murine CMV (mCMV) zum Teil analoge Strategien zur Modulation des MHC-Klasse-I-Antigen-Präsentationswegs entwickelt haben, wurde in der vorliegenden Arbeit auf das experimentelle Modell mit mCMV zurückgegriffen. Die für die Immunevasion verantwortlichen Genprodukte m04/gp34, m06/gp48 und m152/gp40 werden aufgrund ihres regulatorischen Einflusses auf die Antigenpräsentation als vRAPs (viral regulators of antigen presentation) bezeichnet. Diese interferieren mit dem Transport Peptid-beladener MHC-Klasse-I-Moleküle und reduzieren in ihrer konzertierten Wirkung die Präsentation viraler Peptide an der Zelloberfläche.rnDie Transplantation hämatopoietischer Zellen nach Immunoablation stellt eine etablierte Therapieform bei malignen hämatologischen Erkrankungen dar. Zwischen Immunoablation und der Rekonstitution des Immunsystems sind die Empfänger der transferierten Zellen stark immunsupprimiert und anfällig für eine CMV-Erkrankung bei Reaktivierung des Virus. Neben der Gabe antiviraler Medikamente ist der adoptive Transfer antiviraler CD8 T-Zellen eine vielversprechende Therapiemöglichkeit, um reaktivierende CMV zu kontrollieren, bis das körpereigene Immunsystem wieder funktionsfähig ist. Obwohl im murinen Modell sehr wohl etabliert, stellen im humanen System die eingeschränkte Wirkung und die Notwendigkeit der konsequenten Gabe hoher Zellzahlen gewisse logistische Schwierigkeiten dar, welche die Methode bisher von der klinischen Routine ausschließen.rnDas murine Modell sagte eine Rolle von IFN-γ voraus, da Depletion dieses Zytokins zu einer verminderten Schutzwirkung gegen die mCMV-Infektion führt.rnIm ersten Teil dieser Arbeit sollte ein möglicher inhibitorischer Effekt von m04 auf m152 untersucht werden, der bei der Rekombinanten Δm06W beobachtet wurde. Mit neu generierten Viren (Δm06L1+2) konnte dieser Effekt allerdings nicht bestätigt werden. Bei Δm06W fehlte jedoch eine höher N-glykosylierte Isoform des m152-Proteins. Um zu untersuchen, ob die N-Glykosylierung von m152 für seine Funktion notwendig ist, wurde ein rekombinantes Virus generiert, das in Folge einer Deletion aller 3 N-Glykosylierungssequenzen nur eine nicht-glykosylierte Isoform des m152-Proteins bilden kann. In Übereinstimmung mit der zwischenzeitlich publizierten Kristallstruktur das Komplexes von m152 und dem Liganden RAE-1 des aktivierenden NK-Zellrezeptors NKG2D konnte erstmals gezeigt werden, dass die Funktionen von m152 in der adaptiven und in der angeborenen Immunität auch von der nicht N-glykosylierten Isoform wahrgenommen werden können.rnIm zweiten Teil der Arbeit sollte mit Hilfe eines Sets an vRAP Deletionsmutanten der Einfluss von IFN γ auf die einzeln oder in Kombination exprimierten vRAPs untersucht werden. Es zeigte sich, dass Vorbehandlung der Zellen mit IFN-γ die Antigenprozessierung nach Infektion stark erhöht und die vRAPs dann nicht mehr in der Lage sind, die Präsentation aller Peptid-beladener MHC-Klasse-I-Komplexe zu verhindern. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass vorher nicht-schützende CD8 T-Zellen Schutz vermitteln können, wenn das Gewebe der Rezipienten konstitutiv mit IFN-γ versorgt wird. Die zusätzliche Gabe von IFN-γ stellt daher eine vielversprechende Möglichkeit dar, den adoptiven Transfer als Therapie in der klinischen Routine einzusetzen.

Optimierte biologische Aktivität allo- und tumorreaktiver CD8-+-T-Lymphozyten im humanisierten Mausmodell durch IL-15-Superagonisten

Interleukin 15 (IL-15) gilt als eines der vielversprechendsten zukünftigen Medikamente für die Krebstherapie. Es fördert die Proliferation, Persistenz und Funktion von CD8+ T-Zellen und vermittelt zahlreiche Effekte, die es als überlegene Alternative für das derzeit in der Klinik verwendete IL-2 erscheinen lassen. Für den Einsatz von IL-15 in der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein Protokoll zur Herstellung von rekombinantem IL-15 in E. coli etabliert. Das hergestellte Protein hatte eine zu kommerziellen Produkten vergleichbare Bioaktivität und begünstigte die Persistenz und Aktivität antigenspezifischer, humaner CD8+ T Zellen nach adoptivem Transfer in NSG-Mäuse, wobei unter anderem ein verstärkter Effekt auf T Zellen mit TSCM-Phänotyp beobachtet wurde. Um die Bioaktivität von IL-15 zu steigern, wurden super-agonistische IL-15-Fusions¬proteine entworfen und im Expi293-System hergestellt. Dabei wurde IL 15 kovalent mit der Sushi-Domäne, der IL-15Rα-Kette und einer IgG1-Fc-Domäne verbunden, was zu einer gesteigerten Affinität der IL 15-Superagonisten zum physiologischen, niederaffinen IL 15Rβγ und zu einer stark erhöhten Halbwertszeit in Mausserum führte. Die gesteigerte Affinität der IL-15-Super¬agonisten wurde durch die IL 15Rα-Sushi-Domäne vermittelt. Eine um 13 Amino¬säuren verlängerte Sushi-Domäne zeigte im Vergleich zur normalen Form eine nochmals ge¬steigerte Affinität. Die längere Halbwertszeit wurde von der Sushi- und der IgG1-Fc-Domäne vermittelt. Die IgG1-Fc-Domäne verstärkte die Wirkung der Fusionsproteine zusätzlich über einen Mechanismus, der wahrscheinlich mit der Transpräsentation durch Fc Re¬ze¬ptoren zusammen–hängt. Die gesteigerte Bioaktivität der IL-15-Superagonisten wurde im Tiermodell mit humanen und murinen T-Zellen bestätigt und ILR13+-Fc wurde als das Fusionsprotein mit der höchsten Bioaktivität identifiziert. Im Vergleich zu anderen IL-15-Superagonisten vereint es alle derzeit bekannten Eigenschaften zur Bioaktivitätssteigerung in einem einzigen Protein. In therapeutischen Versuchen mit adoptivem Transfer tumorreaktiver T-Zellen konnte der Antitumoreffekt durch ILR13+-Fc maßgeblich verstärkt werden. Als Modellsysteme wurden NSG-Mäuse, die mit humanen AML-Blasten oder einem soliden Ovarialkarzinom engraftet wurden, verwendet. Dabei wurden sowohl antigenspezifische als auch unspezifische Effekte beobachtet. Die unspezifischen Effekte wurden wahrscheinlich durch eine ILR13+-Fc-vermittelte Überexpression von NKG2D, einem Rezeptor der angeborenen Immunantwort, auf den adoptiv transferierten T Zellen vermittelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass IL-15 und die IL-15-Superagonisten die Proliferation und Reaktivität von CD8+ T-Zellen im Rahmen der Immuntherapie fördern können. Aufgrund der hohen Bioaktivität und potenzierten Wirksamkeit, könnten vor allem die IL 15-Superagonisten in Zukunft bei der Entwicklung effizienter Therapiemethoden eingesetzt werden und dadurch einen wichtigen Beitrag zu Behandlung von Krebs leisten. rnrn

Zur Kooperativität des Vogelspinnen-Hämocyanins

Zusammenfassung Kooperativität bei Atmungsproteinen bedeutet eine Änderung der O2-Affinität während der Beladung mit O2 und läßt sich durch die Wechselbeziehung zwischen O2-Beladung und Konformation beschreiben. In dieser Arbeit wurde das 24-mere Hämocyanin der Vogelspinne Eurypelma californicum bzgl. Beladung und Konformationen sowohl auf der Ensemble- wie auch auf der Einzel-Molekül-Ebene charakterisiert. EnsembleDie Bindung von O2 an Hämocyanine ist mit einer drastischen Abnahme der Fluoreszenz-Quantenausbeute verbunden. Durch Vergleich von theoretisch und experimentell bestimmten Quantenausbeuten konnte gezeigt werden, daß die Löschung auf Förster-Transfer zurückzuführen ist, und daß kein Einfluß der Oligomerisierung, Protein-Konformation, Beweglichkeit oder Tierart besteht. Die Konformation von Hämocyaninen konnte mit Crosslinkern im oxy- und deoxy-Zustand fixiert werden. Die Charakterisierung der Produkte führte zu einer neuen Vorstellung, wie unterschiedliche Affinitäten realisiert sein können. Hierbei kommt der Dynamik der Protein-Matrix eine entscheidende Rolle zu. Einzel-MoleküleMittels Zwei-Photonen-Anregung konnten erstmalig einzelne Proteine über ihre intrinsische Tryptophan-Fluoreszenz nachgewiesen werden. Zum einen gelang es, Modellsysteme mit nur 340 Trp abzubilden, andererseits konnte die Diffusion einzelner Hämocyanine (148 Trp) mit Hilfe der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie nachgewiesen werden.Einzelne Hämocyanine konnten durch Adsorption und mildes Eintrocknen an verschiedenen Oberflächen immobilisiert werden. Mittels Atomarer Kraft-Mikroskopie (AFM) ließen sich individuelle Hämocyanine abgebilden, wobei Details der Quarärstruktur aufgelöst werden konnten.

Sensitivity enhancement in NMR by using parahydrogen induced polarization

Enhancing the sensitivity of nuclear magnetic resonance measurements via hyperpolarization techniques like parahydrogen induced polarization (PHIP) is of high interest for spectroscopic investigations. Parahydrogen induced polarization is a chemical method, which makes use of the correlation between nuclear spins in parahydrogen to create hyperpolarized molecules. The key feature of this technique is the pairwise and simultaneous transfer of the two hydrogen atoms of parahydrogen to a double or triple bond resulting in a population of the Zeeman energy levels different from the Boltzmann equation. The obtained hyperpolarization results in antiphase peaks in the NMR spectrum with high intensities. Due to these strong NMR signals, this method finds arnlot of applications in chemistry e.g. the characterization of short-lived reaction intermediates. Also in medicine it opens up the possibility to boost the sensitivity of medical diagnostics via magnetic labeling of active contrast agents. Thus, further examination and optimization of the PHIP technique is of significant importance in order to achieve the highest possible sensitivity gain.rnrnIn this work, different aspects concerning PHIP were studied with respect to its chemical and spectroscopic background. The first part of this work mainly focused on optimizing the PHIP technique by investigating different catalyst systems and developing new setups for the parahydrogenation. Further examinations facilitated the transfer of the generated polarization from the protons to heteronuclei like 13C. The second part of this thesis examined the possibility to transfer these results to different biologically active compounds to enable their later application in medical diagnostics. Onerngroup of interesting substances is represented by metabolites or neurotransmitters in mammalian cells. Other interesting substances are clinically relevant drugs like a barbituric acid derivative or antidepressant drugs like citalopram which were investigated with regard to their applicability for the PHIP technique and the possibility to achievernpolarization transfer to 13C nuclei. The last investigated substrate is a polymerizable monomer whose polymer was used as a blood plasma expander for trauma victims after the first half of the 20th century. In this case, the utility of the monomer for the PHIP technique as a basis for later investigations of a polymerization reaction using hyperpolarized monomers was examined.rnrnHence, this thesis covers the optimization of the PHIP technology, hereby combining different fields of research like chemical and spectroscopical aspects, and transfers the results to applications of real biologally acitve compounds.

Kontrolle der Grenzflächeneigenschaften anorganischer Nanopartikel mittels amphiphiler Polymere

Im Rahmen dieser Arbeit wurden amphiphile Co- und Terpolymere verwendet, um die Grenzflächeneigenschaften anorganischer Nanopartikel zu kontrollieren. Es wurde eine effiziente und vielseitige Methode entwickelt, mit der in-situ hydrophobierte, formanisotrope ZnO-, CdS- und Au-Nanopartikel sowie poröse TiO2-Nanopartikel hergestellt werden konnten. Diese Technik basierte auf der Fällung anorganischer Nanopartikel in einer inversen Emulsion mittels kombinierten Einsatzes zweier maßgeschneiderter amphiphiler Polymere. Ein Copolymer ermöglichte sowohl die Stabilisierung der Emulsion als auch die Hydrophobierung der Partikel, und ein weiteres Struktur-dirigierendes Agens (SDA) kontrollierte den Kristallisationsprozess. Infolge ihrer Form zeigten die Nanopartikel von sphärischen Teilchen abweichende Lagen der Oberflächenplasmonenresonanz und der Bandlücke. Aufgrund der hervorragenden Hydrophobierung dieser Kolloide mittels amphiphiler Copolymere konnten diese homogen in polymere Materialien eingearbeitet werden. Dies erlaubte es die speziellen Eigenschaften von nicht-sphärischen Kolloiden auf Nanokompositmaterialien zu übertragen. Darüber hinaus wurden amphipolare Copolymere genutzt, um superhydrophobe Oberflächen zu generieren. Hierzu wurden Filme bestehend aus rauen SiO2-Nanopartikeln mit fluorierten Emulgatoren beschichtet. In einem dritten Schwerpunkt dieser Arbeit wurden amphiphile Co- und Terpolymere verwendet, um anorganische Nanopartikel zu hydrophilieren. Durch Variation der Emulgatorzusammensetzung konnten die Ladung und Ladungsdichte auf der Partikeloberfläche gezielt gesteuert werden. Darüber hinaus konnte die Partikelhülle zusätzlich mit Farbstoffmolekülen funktionalisiert werden, was den erfolgreichen Einsatz der Kolloide in Zellaufnahmeexperimenten ermöglichte.

Safety and therapeutic efficacy of adoptive p53-specific T cell antigen receptor (TCR) gene transfer

Immunotherapy with T cells genetically modified by retroviral transfer of tumor-associated antigen (TAA)-specific T cell receptors (TCR) is a promising approach in targeting cancer. Therefore, using a universal TAA to target different tumor entities by only one therapeutic approach was the main criteria for our TAA-specific TCR. Here, an optimized (opt) αβ-chain p53(264-272)-specific and an opt single chain (sc) p53(264-272)-specific TCR were designed, to reduce mispairing reactions of endogenous and introduced TCR α and TCR β-chains, which might lead to off-target autoimmune reactions, similar to Graft-versus-host disease (GvHD). rnIn this study we evaluated the safety issues, which rise by the risk of p53TCR gene transfer-associated on/off-target toxicities as well as the anti-tumor response in vivo in a syngeneic HLA-A*0201 transgenic mouse model. We could successfully demonstrate that opt sc p53-specific TCR-redirected T cells prevent TCR mispairing-mediated lethal off-target autoimmunity in contrast to the parental opt αβ-chain p53-specific TCR. Since the sc p53-specific TCR proofed to be safe, all further studies were performed using sc p53-specific TCR redirected T cells only. Infusion of p53-specific TCR-redirected T cells in Human p53 knock-in (Hupki) mice after lymphodepletion-preconditioning regimen with either sublethal body irradiation (5Gy) or chemotherapy (fludarabine and cyclophosphamide) in combination with vaccination (anti-CD40, CpG1668 and p53(257-282) peptide) did not result in a depletion of hematopoietic cells. Moreover, adoptive transfer of high numbers of p53-specific TCR-redirected T cells in combination with Interleukin 2 (IL-2) also did not lead to toxic on-target reactions. The absence of host tissue damage was confirmed by histology and flow cytometry analysis. Furthermore, p53-specific TCR-redirected T cells were able to lyse p53+A2.1+ tumor cells in vitro. However, in vivo studies revealed the potent suppressive effect of the tumor microenvironment (TME) mediated by tumor-infiltrating myeloid-derived suppressor cells (MDSC). Accordingly, we could improve an insufficient anti-tumor response in vivo after injection of the sc p53-specific TCR-redirected T cells by additional depletion of immunosuppressive cells of the myeloid lineage.rnTogether, these data suggest that the optimized sc p53(264-272)-specific TCR may represent a safe and efficient approach for TCR-based gene therapy. However, combinations of immunotherapeutic strategies are needed to enhance the efficacy of adoptive cell therapy (ACT)-mediated anti-tumor responses.

Improving adoptive T cell therapies of cancer by ectopic expression of miR181a to repress inhibitory phosphatases

Adoptive T cell therapy using antigen-specific T lymphocytes is a powerful immunotherapeutic approach against cancer. Nevertheless, many T cells against tumor-antigens exhibit only weak anti-tumoral response. To overcome this barrier it is necessary to improve the potency and anti-tumoral efficacy of these T cells. Activation and activity of T cells are tightly controlled to inhibit unwanted T cell responses and to reduce the risk of autoimmunity. Both are regulated by extrinsic signals and intrinsic mechanisms which suppress T cell activation. The intrinsic mechanisms include the expression of phosphatases that counteract the activation-inducing kinases. Modifying the expression of these phosphatases allows the targeted modulation of T cell reactivity. MicroRNAs (miRNAs) are regulatory small noncoding RNA molecules that control gene expression by targeting messenger RNAs in a sequence specific manner. Gene-specific silencing plays a key role in diverse biological processes, such as development, differentiation, and functionality. miR181a has been shown to be highly expressed in immature T cells that recognize low-affinity antigens.rnThe present study successfully shows that ectopic expression of miR181a is able to enhance the sensitivity of both murine and human T cells. In CD4+ T helper cells as well as in CD8+ cytotoxic T cells the overexpression of miR181a leads to downregulation of multiple phosphatases involved in the T cell receptor signaling pathway. Overexpression of miR181a in human T cells achieves a co-stimulatory independent activation and has an anti-apoptotic effect on CD4+ T helper cells. Additionally, increasing the amount of miR181a enhances the cytolytic activity of murine CD8+ TCRtg T cells in an antigen-specific manner.rnTo test miR181a overexpressing T cells in vivo, a mouse tumor model using a B cell lymphoma cell line (A20-HA) expressing the Influenza hemagglutinin (Infl.-HA) antigen was established. The expression of model antigens in tumor cell lines enables targeted elimination of tumors using TCRtg T cells. The transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells alone has no positive effect neither on tumor control nor on survival of A20-HA tumor-bearing mice. In contrast, the co-transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ and CD4+ T cells leads to improved tumor control and prolongs survival of A20-HA tumor-bearing mice. This effect is characterized by higher amounts of effector T cells and the expansion of Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells.rnAll effects were achieved by changes in expression of several genes including molecules involved in T cell differentiation, activation, and regulation, cytotoxic effector molecules, and receptors important for the homing process of T cells in miR181a overexpressing T cells. The present study demonstrates that miR181a is able to enhance the anti-tumoral response of antigen-specific T cells and is a promising candidate for improving adoptive cell therapy.