Titanate-based paraelectric glass-ceramics for applications in GHz electronics

Das Gebiet der drahtlosen Kommunikationsanwendungen befindet sich in einem permanenten Entwicklungsprozess (Mobilfunkstandards: GSM/UMTS/LTE/5G, glo-bale Navigationssatellitensysteme (GNSS): GPS, GLONASS, Galileo, Beidou) zu immer höheren Datenraten und zunehmender Miniaturisierung, woraus ein hoher Bedarf für neue, optimierte Hochfrequenzmaterialien resultiert. Diese Entwicklung zeigt sich besonders in den letzten Jahren in der zunehmenden Entwicklung und Anzahl von Smartphones, welche verschiedene Technologien mit unterschiedlichen Arbeitsfrequenzen innerhalb eines Geräts kombinieren (data: 1G-4G, GPS, WLAN, Bluetooth). Die für zukünftige Technologien (z.B. 5G) benötigte Performance-steigerung kann durch die Verwendung von auf MIMO basierenden Antennensystemen realisiert werden (multiple-input & multiple-output, gesteuerte Kombination von mehreren Antennen) für welche auf dielectric Loading basierende Technologien als eine der vielversprechendsten Implementierungslösungen angesehen werden. rnDas Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer geeigneten paraelektrischen Glaskeramik ($varepsilon_{r}$ > 20, $Qf$ > 5000 GHz, |$tau_f$| < 20 ppm/K; im GHz Frequenzbe-reich) im $mathrm{La_{2}O_{3}}$-$mathrm{TiO_{2}}$-$mathrm{SiO_{2}}$-$mathrm{B_{2}O_{3}}$-System für auf dielectric Loading basierende Mobilfunkkommunikationstechnologien als Alternative zu existierenden kommerziell genutzten Sinterkeramiken. Der Fokus lag hierbei auf der Frage, wie die makroskopi-schen dielektrischen Eigenschaften der Glaskeramik mit ihrer Mikrostruktur korreliert bzw. modifiziert werden können. Es konnte gezeigt werden, dass die dielektrischen Materialanforderungen durch das untersuchte System erfüllt werden und dass auf Glaskeramik basierende Dielektrika weitere vorteilhafte nichtelektro-nische Eigenschaften gegenüber gesinterten Keramiken besitzen, womit dielektrische Glaskeramiken durchaus als geeignete Alternative angesehen werden können. rnEin stabiles Grünglas mit minimalen Glasbildneranteil wurde entwickelt und die chemische Zusammensetzung bezüglich Entglasung und Redoxinstabilitäten optimiert. Geeignete Dotierungen für dielektrisch verlustarme $mathrm{TiO_{2}}$-haltige Glaskeramiken wurden identifiziert.rnDer Einfluss der Schmelzbedingungen auf die Keimbildung wurde untersucht und der Keramisierungsprozess auf einen maximalen Anteil der gewünschten Kristallphasen optimiert um optimale dielektrische Eigenschaften zu erhalten. Die mikroskopische Struktur der Glaskeramiken wurde analysiert und ihr Einfluss auf die makroskopischen dielektrischen Eigenschaften bestimmt. Die Hochfrequenzverlustmechanismen wurden untersucht und Antennen-Prototypenserien wurden analysiert um die Eignung von auf Glaskeramik basierenden Dielektrika für die Verwendung in dielectric Loading Anwendungen zu zeigen.

A single chain antibody against a viral RNA polymerase (TBSV-BS3-Statice)

Expression of antibodies in plant against essential viral proteins could provide an alternative approach to engineered viral resistance. Engineered single chain Fv antibodies scFV are particularly suitable for expression in plant because of their small size and the lack of assembly requirements. RNA-dependent RNA polymerases (RdRps) function as the catalytic subunit of viral replicases required for the replication of all positive strand RNA viruses. By using Phage technology we selected scFvs from a phage library using purified E.coli expressed TBSV(Tomato bushy stunt virus) replicase as antigen. The scFvs mediated-inhibition of RdRp activity was studied in vitro and in planta. In vitro experiments showed the inhibition of CNV(Cucumber necrosis virus) and TCV(Turnip crinkle virus) RdRp. Transient in planta assays based on agroinfiltration and an infectious clone of TBSV demonstrated the inhibition of the replication of TBSV(Tomato bushy stunt virus). Epitope mapping showed that the selected scFvs target the motif E of RdRp which is involved in template binding.Moreover T1 plants of transgenic lines of N. benthamiana expressing different scFvs either in the cytoplasm or the ER (endoplasmic reticulum) showed a high level of resistance against infection with TBSV and RCNMV(Red clover necrotic mosaic virus) upon inoculation with virus particles. This is the first report that scFvs against a RdRp of a plant viruses can inhibit viral replication in vivo. The resistance is even efficient against viruses belonging to different virus families.

Comparative genomic sequencing analysis of a region in human chromosome 11p15.3, mouse chromosome 7 and analysis of the novel STK33, Stk33 gene

The comparative genomic sequence analysis of a region in human chromosome 11p15.3 and its homologous segment in mouse chromosome 7 between ST5 and LMO1 genes has been performed. 158,201 bases were sequenced in the mouse and compared with the syntenic region in human, partially available in the public databases. The analysed region exhibits the typical eukaryotic genomic structure and compared with the close neighbouring regions, strikingly reflexes the mosaic pattern distribution of (G+C) and repeats content despites its relative short size. Within this region the novel gene STK33 was discovered (Stk33 in the mouse), that codes for a serine/threonine kinase. The finding of this gene constitutes an excellent example of the strength of the comparative sequencing approach. Poor gene-predictions in the mouse genomic sequence were corrected and improved by the comparison with the unordered data from the human genomic sequence publicly available. Phylogenetical analysis suggests that STK33 belongs to the calcium/calmodulin-dependent protein kinases group and seems to be a novelty in the chordate lineage. The gene, as a whole, seems to evolve under purifying selection whereas some regions appear to be under strong positive selection. Both human and mouse versions of serine/threonine kinase 33, consists of seventeen exons highly conserved in the coding regions, particularly in those coding for the core protein kinase domain. Also the exon/intron structure in the coding regions of the gene is conserved between human and mouse. The existence and functionality of the gene is supported by the presence of entries in the EST databases and was in vivo fully confirmed by isolating specific transcripts from human uterus total RNA and from several mouse tissues. Strong evidence for alternative splicing was found, which may result in tissue-specific starting points of transcription and in some extent, different protein N-termini. RT-PCR and hybridisation experiments suggest that STK33/Stk33 is differentially expressed in a few tissues and in relative low levels. STK33 has been shown to be reproducibly down-regulated in tumor tissues, particularly in ovarian tumors. RNA in-situ hybridisation experiments using mouse Stk33-specific probes showed expression in dividing cells from lung and germinal epithelium and possibly also in macrophages from kidney and lungs. Preliminary experimentation with antibodies designed in this work, performed in parallel to the preparation of this manuscript, seems to confirm this expression pattern. The fact that the chromosomal region 11p15 in which STK33 is located may be associated with several human diseases including tumor development, suggest further investigation is necessary to establish the role of STK33 in human health.

RNA-basierte Impfstoffe zur Induktion optimaler Immunantworten

Antigen-kodierende RNA wird als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptid-, Protein-, rekombinanten viralen oder DNA basierten Impfstoffen betrachtet. Der endgültige klinische Nutzen RNA-basierter Impfstoffe wird von der Optimierung verschiedener Parameter abhängig sein, die zur Induktion und effizienten Expansion der humoralen und zellvermittelten Immunantwort beitragen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Etablierung pharmakologischer und immunologischer Parameter für die Generierung effektiver Immunantworten durch RNA-Impfstoffe sowie deren Wirksamkeit in vitro und im Mausmodell unter Nutzung von Modellantigenen zu testen. Zur Untersuchung und Optimierung der RNA-Pharmakokinetik, als einem Schlüsselaspekt der klinischen Medikamentenentwicklung, wurde der Einfluss von strukturellen Modifikationen auf die Transkriptstabilität und Translationseffizienz von Reporter-Proteinen in einer zeitabhängigen Kinetik evaluiert. Es wurde gezeigt, dass ein poly(A) Schwanz von 120 Adenosinen, verglichen mit einem kürzeren, ein freies 3´ poly(A) Ende, verglichen mit einem verdeckten und eine doppelte β-globin 3´ UTR, unabhängig voneinander zu einer Erhöhung der IVT-RNA Stabilität und zu einer Verbesserung der Translationseffizienz beitrugen und dadurch insgesamt zu einer erhöhten Proteinexpression führten. Antigen-kodierende IVT-RNA mit diesen molekularen Merkmalen in Kombination führte, im Vergleich zur Standard IVT-RNA, zu einer erhöhten Dichte und Stabilität von Peptid/MHC-Komplexen auf der Zelloberfläche transfizierter DCs und dadurch zu einer verbesserten Stimulation von CD4+ und CD8+ T-Zellen im murinen und humanen System. Mit dem Ziel, die RNA kodierte Antigenform für die Induktion einer verstärkten Antikörperantwort zu modifizieren, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein Antigen-IgM Fusionskonstrukt hergestellt und hinsichtlich seiner Eignung als neues Impfstoff-Format untersucht. Die Ausgangshypothese, dass die RNA kodierten Antigen-IgM Fusionsproteine polymerisieren, von transfizierten Zellen sezerniert werden und aufgrund der repetitiven Antigenstruktur im Vergleich mit dem monomeren Antigen zu einer Verstärkung der Antikörperantwort führen, wurde in vitro und in vivo im Mausmodell bestätigt. Die Entwicklung und Evaluierung von Zytokinfusionsproteinen zur selektiven Verstärkung der antigenspezifischen Immunantworten bildeten den dritten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Zur weiteren Verstärkung der Antikörperantwort wurde basierend auf den Resultaten aus dem zweiten Teil ein IL2-IgM Fusionskonstrukt hergestellt. Die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2-IgM kodierender IVT-RNA führte zu einer signifikant stärkeren Antikörperantwort als die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2. Für die Initiierung einer erfolgreichen anti-Tumor-Immunantwort ist das Priming antigenspezifischer T-Zellen essentiell. Um die Effizienz dieses Prozesses zu steigern, wurde ein bifunktionelles IL2-mCD40L Fusionskonstrukt hergestellt und sein Einfluss auf die Effektorfunktion von DCs in vitro und in vivo untersucht. Es wurde gezeigt, dass ein RNA kodiertes IL2-mCD40L Fusionsprotein als genetisches Adjuvanz zu einer Effizienzsteigerung des Priming zytotoxischer T-Zellen führt. Somit wurden in dieser Arbeit durch die Optimierung der Pharmakokinetik, die Modifikation der Antigenform und die Herstellung und Evaluierung von Zytokinfusionskonstrukten als genetische Adjuvantien, RNA-basierte Impfstoffe für eine optimierte Induktion von antigenspezifischen Immunantworten weiter verbessert.

Induktion und Analyse spezifischer Immunantworten nach intranodaler Immunisierung mit RNA im murinen Modell

Die Wirksamkeit einer Vakzine ist von vielen Parametern abhängig. Dazu gehören unter anderen: das ausgewählte Antigen, die Formulation in der das Antigen benutzt wird sowie die Applikationsroute. Antigen-kodierende Ribonukleinsäuren (RNA) gilt heutzutage als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptiden, rekombinanten Proteinen, viralen Systemen oder DNA basierten Impfstoffen. Bezüglich des Applikationsortes repräsentiert der Lymphknoten ein optimales Milieu für die Interaktion zwischen antigenpräsentierenden Zellen und T-Zellen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung dieser Arbeit, ein auf direktem in vivo Transfer von Antigen-kodierender in vitro transkribierter RNA (IVT-RNA) basierendes Impfverfahren zu entwickeln, zu charakterisieren und auf seine anti-tumorale Wirksamkeit zu testen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen (DCs) in vitro hocheffizient mit IVT-RNA transfiziert werden können und eine hohe stimulatorische Kapazität besitzen. Durch Sequenzmodifikation der IVT-RNA konnten wir die Transkriptstabilität und Translationseffizienz erhöhen was zu einer Steigerung der stimulatorischen Kapazität in vivo führte. Darüber hinaus untersuchten wir die Auswirkung der Insertion eines Signalpeptides 5’ sowie einer C-terminalen transmembran- und zytosolischen-Domäne eines MHC-Klasse-I-Moleküls am 3’ der Antigen-kodierenden Sequenz auf die Effizienz der MHC-Klasse-I und -II Präsentation. Wir konnten in vitro und in vivo nachweisen, dass diese Modifikation zu einer gesteigerten, simultanen Stimulation von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen führt. Auf der Basis der optimierten Vektorkassetten etablierten wir die intranodale (i.n.) Transfektion von antigenpräsentierenden Zellen in der Maus. Dazu nutzten wir verschiedene Reportersysteme (eGFP-RNA, fluoreszensmarkierte RNA) und konnten zeigen, dass die intranodale Applikation von IVT-RNA zu selektiven Transfektion und Maturation lymphknotenresidenter DCs führt. Zur Untersuchung der immunologischen Effekte wurden in erster Linie auf Influenza-Hemagglutinin-A und Ovalbumin basierende Modellantigensysteme verwendet. Beide Antigene wurden als Antigen-MHC-Fusionskonstrukte genutzt. Als Responderzellen wurden TCR-transgene Lymphozyten verwendet, die MHC-Klasse-I oder -Klasse-II restringierte Epitope des Influenza-Hemagglutinin-A bzw. des Ovalbumin-Proteins erkennen. Wir konnten in vivo zeigen, dass die intranodale Immunisierung mit IVT-RNA zu einer effizienten Stimulation und Expansion von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen in einer dosisabhängigen Weise führt. Funktionell konnte gezeigt werden, dass diese T-Zellen Zytokine sezernieren und zur Zytolyse befähigt sind. Wir waren in der Lage durch repetitive i.n. RNA Immunisierung ein ‚Priming’ CD8+ T-Zellen in naiven Mäusen sowohl gegen virale als auch gegen Tumor assoziierte Antigene zu erreichen. Die geprimten T-Zellen waren befähigt eine zytolytische Aktivität gegen mit spezifischem Peptid beladene Targetzellen zu generieren. Darüber hinaus waren wir in der Lage Gedächtnisszellen expandieren zu können. Abschließend konnten wir in Tumormodellen sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Experimenten zeigen dass die i.n. RNA Vakzination die Potenz zur Induktion einer anti-tumoralen Immunität besitzt.

Bedeutung der viralen IE4-Region für die Genexpression und Replikation des humanen Cytomegalovirus

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein fakultativ-pathogener Erreger, der bei Patienten mit geschwächter oder unausgereifter Immunabwehr schwerwiegende Erkrankungen hervorrufen kann. Wie alle Herpesviren zeigt das HCMV eine streng koordinierte Expression viraler Gene, die in eine „sehr frühe-“ (IE), „frühe “ (E) und „späte-“ (L) Phase unterteilt werden kann. Die Produkte der IE-Gene IE1 und IE2 sind für die Expression der frühen Gene und somit für die Initiation der viralen DNA-Replikation entscheidend. Sie greifen gleichzeitig in den zellulären Stoffwechsel ein und schaffen damit optimale Vorraussetzungen für die virale Vermehrung. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass HCMV in lytisch infizierten Zellen ein abundantes IE-Transkript von 5 kb (IE4-RNA) exprimierte, dessen Funktion bislang unklar war. Ältere Publikationen deuteten darauf hin, dass die IE4-Genregion an der Transformation eukaryonter Zellen beteiligt sein könnte. Neuere Arbeiten zeigten, dass es sich bei diesem IE4-Transkript um ein metabolisch stabiles Intron handelt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte zunächst geklärt werden, ob die IE4-Genregion ein Protein kodiert. In der Folge sollten mit viralen Deletionsmutanten Hinweise auf die biologische Funktion des IE4-Bereichs erarbeitet werden. Durch Northern Blot Analysen und cDNA-Klonierungsexperimente konnte eine Reihe neuer Spleiß-Varianten der IE4-RNA identifiziert werden. Durch Sequenzanalysen wurde gezeigt, dass diese Transkripte keine längeren offenen Leserahmen enthalten. Zusammen mit bereits publizierten Erkenntnissen, kann aus diesen Ergebnissen mit hoher Wahrscheinlichkeit geschlossen werden, dass die IE4 Region nicht für ein Protein kodiert. Zur Analyse der biologischen Funktion der IE4-Region wurde das DNA-Genom des HCMV gezielt mutagenisiert. Eine phänotypische Analyse der entsprechenden Viren mittels Reportergen-Tests und quantitativer RealTime RT-PCR zeigte, dass einige der Mutanten eine verringerte Expression früher Gene aufwiesen, die mit einer Beeinträchtigung ihrer Replikationsfähigkeit in Fibroblastenkulturen korrelierte. Dabei war die Ausbildung eines Phänotyps jedoch von dem genetischen Hintergrund des verwendeten viralen Ausgangsstammes abhängig. Auffällig war, dass phänotypische Veränderungen nur bei solchen Mutanten sichtbar wurden, die auf der Grundlage des Laborstammes Ad169 des HCMV generiert worden waren. Die nachfolgende Analyse der Ausgangsstämme ergab deutliche Unterschiede in der IE-Genexpression. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen somit, dass die IE4-RNA mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht für ein Protein kodiert, aber bei limitierender Expression der essentiellen Regulatoren IE1 und IE2 die frühe lytische Genexpression stimuliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen die Grundlage für nachfolgende Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Funktion der IE4-RNA im Rahmen der lytischen Infektion des HCMV dar.

Evaluation of polymeric nanocarriers for RNA delivery

Therapeutic RNAs, especially siRNAs, are a promising approach for treating diseases like cancer, neurodegenerative disorders and viral infections. Their application, however, is limited due to a lack of safe and efficient delivery systems. Nanosized carriers with the ability to either complex or entrap RNA species are a promising option. rn rn rnSuch a carrier has to meet a lot of requirements, some of which are even partly contradictive. Understanding and controlling the interplay between the different demands would advance a strategic design at an early stage of therapeutic development. rn rn This work is centered around a systematic evaluation of polyplexes, such carriers that are able to complex siRNA due to electrostatic interactions. Six structurally and chemically diverse candidates, poly-L-lysine brushes, block copolymers, cationic peptides, cationic lipids, nanohydrogels, and manganese oxide particles, were tested in a simultaneous fashion. The assays, mostly based on fluorescently labeled siRNA, ranged from the evaluation of polyplex formation and stability to in vitro parameters like cellular uptake and knockdown capability. The analysis from several perspectives offered insight into the interplay between the specifications of one polyplex. Assessing the different carriers under exactly the same experimental conditions also allowed conclusions about favourable traits and starting points for further optimization. This comparative approach also revealed weaknesses of some of the conventional protocols, which were therefore contrasted with alternative methods. In addition, in vitro knockdown assays were optimized and the impact of fluorescently labeled siRNA on knockdown efficiency was assessed. rn rn rn A second class of carriers, which share the ability to entrap siRNA inside their matrix, are briefly addressed. Nanocapsules, dextran particles and liposomes were assessed for basic features like siRNA encapsulation and knockdown capability. rn rn rn rn In an approach towards targeted delivery of RNA, liposomes were endowed with mitochondriotropic tags. Despite successful functionalization, no colocalization between the liposomal cargo and mitochondria was so far observed, which makes further optimization necessary.