Genetische Varianten synaptischer Proteine als Risikomechanismus der Alkoholabhängigkeitund Alkohol-bezogener Phänotypen

Die Alkoholabhängigkeit gehört zu den häufigen chronischen Erkrankungen, welche mit einem vorzeitigen Verlust von Gesundheit und Lebensqualität einhergeht. Familien- und Zwillingsuntersuchungen sprechen dafür, dass mehr als 50% der Verhaltensvarianz durch genetische Faktoren zu erklären ist. In der vorliegenden kumulativen Habilitationsarbeit wurden verhaltensgenetische, molekularbiologische, humangenetische und funktionell bildgebende Untersuchungstechniken kombiniert, um ein erweitertes Verständnis der Neurobiologie der Alkoholabhängigkeit zu erzielen. In einer Serie tierexperimenteller Arbeiten konnte u.a. nachgewiesen werden, dass das Gen für das Multiple PDZ Domänen Protein Mpdz ein Kandidatengen des Alkoholentzugs, Barbituratentzugs und der neuronalen Exzitabilität darstellt. In zwei weiteren Untersuchungen wurden Kandidatengene der Alkoholpräferenz untersucht. Hier konnte mit dem Syntaxin binding protein 1 (Stxbp1) ein Kandidatengen der Alkoholpräferenz bestätigt werden. Humangenetische Untersuchungen sprechen dafür, dass molekulare Varianten in der Alpha2 Untereinheit des GABAA Rezeptors zu einem erhöhten Risiko der Entwicklung einer Alkoholabhängigkeit beim Menschen beitragen. Mit einer 18F-Fluorodesoxyglucose Untersuchung konnte nachgewiesen werden, dass Alkohol in vivo das mesolimbische Rewardsystem stimuliert, diese Stimulation jedoch nicht durch Tiagabin, einem GABA-Transporterinhibitor, hemmbar ist. Zusammengefasst sprechen die Untersuchungen dafür, dass molekulare Varianten synaptischer Proteine zu einer veränderten Alkoholempfindlichkeit und dem Risiko zur Entwicklung einer Alkoholabhängigkeit beitragen.

Atomistic simulations of cosolvent/water mixtures

In this thesis, atomistic simulations are performed to investigate hydrophobic solvation and hydrophobic interactions in cosolvent/water binary mixtures. Many cosolvent/water binary mixtures exhibit non-ideal behavior caused by aggregation at the molecular scale level although they are stable and homogenous at the macroscopic scale. Force-field based atomistic simulations provide routes to relate atomistic-scale structure and interactions to thermodynamic solution properties. The predicted solution properties are however sensitive to the parameters used to describe the molecular interactions. In this thesis, a force field for tertiary butanol (TBA) and water mixtures is parameterized by making use of the Kirkwood-Buff theory of solution. The new force field is capable of describing the alcohol-alcohol, water-water and alcohol-water clustering in the solution as well as the solution components’ chemical potential derivatives in agreement with experimental data. With the new force field, the preferential solvation and the solvation thermodynamics of a hydrophobic solute in TBA/water mixtures have been studied. First, methane solvation at various TBA/water concentrations is discussed in terms of solvation free energy-, enthalpy- and entropy- changes, which have been compared to experimental data. We observed that the methane solvation free energy varies smoothly with the alcohol/water composition while the solvation enthalpies and entropies vary nonmonotonically. The latter occurs due to structural solvent reorganization contributions which are not present in the free energy change due to exact enthalpy-entropy compensation. It is therefore concluded that the enthalpy and entropy of solvation provide more detailed information on the reorganization of solvent molecules around the inserted solute. Hydrophobic interactions in binary urea/water mixtures are next discussed. This system is particularly relevant in biology (protein folding/unfolding), however, changes in the hydrophobic interaction induced by urea molecules are not well understood. In this thesis, this interaction has been studied by calculating the free energy (potential of mean force), enthalpy and entropy changes as a function of the solute-solute distance in water and in aqueous urea (6.9 M) solution. In chapter 5, the potential of mean force in both solution systems is analyzed in terms of its enthalpic and entropic contributions. In particular, contributions of solvent reorganization in the enthalpy and entropy changes are studied separately to better understand what are the changes in interactions in the system that contribute to the free energy of association of the nonpolar solutes. We observe that in aqueous urea the association between nonpolar solutes remains thermodynamically favorable (i.e., as it is the case in pure water). This observation contrasts a long-standing belief that clusters of nonpolar molecules dissolve completely in the presence of urea molecules. The consequences of our observations for the stability of proteins in concentrated urea solutions are discussed in the chapter 6 of the thesis.

Identifizierung und interindividuelle Expressionsvariabilität der hepatischen Doxorubizin-Reduktase im Menschen

Die in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen befassen sich mit der Identifizierung des haupt-metabolisierenden Enzyms für die Reaktion von dem Zytostatikum Doxorubizin zu dem Alkohol-Metaboliten Doxorubizinol in humanem Leberzytosol. Der Metabolismus dieser Reaktion wurde in einer humanen Leberbank analysiert, welcher eine große interindividuelle Variabilität zeigte. Da die maximale Umsatzrate häufig proportional zu der Expression des umsetzenden Enzyms in Leber ist, wurden in dieser Arbeit die Expressionsmuster der Kandidatenenzyme, verschiedene Carbonyl reduzierende Enzyme (AKRs und CBRs), ermittelt und des Weiteren der Umsatz von Doxorubizin zu Doxorubizinol in verschiedenen humanen Organen gemessen. Die metabolische Clearance der Reaktion als auch die Affinität zu Doxorubizin war am höchsten in Dünndarm, Leber und Niere, während die anderen Organe wesentlich geringere Werte zeigten. Dies steht im Einklang mit der prominenten Rolle dieser Organe in der Detoxifizierung von Fremdstoffen. Auch der Umsatz von Doxorubizin zu Doxorubizinol wurde von den verschiedenen Enzymen in sehr unterschiedlichem Maß katalysiert. AKR1C3 und CBR1 zeigten einen ausgeprägten Metabolismus von Doxorubizin während AKR1A1, AKR1B1, AKR1B10 und AKR1C4 nur geringen Maximalumsatz zeigten. Auch die Affinität von CBR1 und AKR1C3 zu Doxorubizin war wesentlich höher als die der anderen Enzyme. Inhibitoruntersuchungen zeigten weiterhin, dass ein spezifischer CBR1-Inhibitor die untersuchte Reaktion durch CBR1 als auch durch humanes Leberzytosol in gleichem Maße hemmte. Dieses Ergebnis deutet auf CBR1 als Haupt-Doxorubizin-Reduktase hin. Dies wurde in anfangs erwähnter humaner Leberbank weiter untersucht. Der Gehalt von CBR1-Protein wurde bestimmt und mit der gemessenen spezifischen Aktivität korreliert. Der Proteingehalt korrelierte mit der gemessenen spezifischen Aktivität in sechs von neun Western Blots. Dieses Ergebnis unterstützt die Vermutung, dass CBR1 als Haupt-Doxorubizin-Reduktase in humaner Leber betrachtet werden kann. Die Analyse des CBR1-Gens zeigte zwei Haplotypen, die einen signifikant verschiedenen Km-Wert zeigten als die übrigen Haplotypen. Diese Haplotypen konnten jedoch nur einen geringen Teil der Variabilität des Doxorubizin-Metabolismus erklären. Da aber ein starker interindividueller Doxorubizin-Metabolismus in humaner Leber beobachtet wird, deutet dies auf eine starke epigenetische Regulation des CBR1-Gens hin. Analysen der Promoterregion zeigten viele Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren; eine Aktivierung durch xenobiotische Substanzen kann vermutet werden. Der Metabolismus von Doxorubizin kann zu einer Deaktivierung des Medikaments und damit zu einer verminderten chemotherapeutischen Wirkung führen. Durch die Charakterisierung der humanen Doxorubizin-Reduktase in Leber ist die gezielte Suche nach Hemmstoffen für dieses Enzym möglich. Dies eröffnet die Möglichkeit, die Bildung von Doxorubizin zu Doxorubizinol zu verringern und die Inaktivierung der antineoplastischen Wirkung zu vermeiden. Eine Dosisverminderung und bessere Verträglichkeit des Medikaments kann erreicht, die schweren Nebenwirkungen reduziert werden. Die Identifizierung der verantwortlichen hepatischen Doxorubizin-Reduktase im Menschen kann somit einen wichtigen Beitrag leisten, die Krebstherapie in Zukunft verträglicher und nebenwirkungsfreier zu gestalten und Resistenzbildungen vorzubeugen.

Identifizierung von Hexosecarriern und Regulation des Phosphoketolasewegs in Oenococcus oeni

Oenococcus oeni ist ein heterofermentatives Milchsäurebakterium, das Hexosen über den Phosphoketolaseweg zu Lactat, Acetyl-P und CO2 umsetzt. In Anhängigkeit von der C-Quelle werden Ethanol, Acetat, Mannit und geringe Mengen an Erythrit gebildet. Im Genom von O. oeni PSU-1 wurden neun Gene für sekundäre Carrier identifiziert, die aufgrund ihrer Sequenz und Lage im Genom als Kandidaten für Hexosecarrier in Frage kommen. In Stamm O. oeni B1 wurde die Expression der Gene OEOE_0819 und OEOE_1574 stark durch Glucose induziert. Die Gene konnten jedoch Hexosetransport-Defektmutanten von E. coli nicht komplementieren. Die deutliche Induktion der Gene deutet auf ihre Funktion im Hexosetransport hin. Bei den Carriern 819 und 1574 handelt es sich vermutlich um früher identifizierte Δp-getriebene sekundäre Hexosetransporter. Die Expression der Kandidaten zeigte teilweise Unterschiede bei verschiedenen O. oeni Stämmen. Auch die Funktion von Phosphotransferasesystemen bei der Aufnahme von Hexosen wurde durch Expressionsmessungen untersucht. Einige Systeme weisen Ähnlichkeit zu Glucose- und Fructose-transportierenden Systemen auf und kommen als Aufnahmesysteme für Hexosen in Frage. Das Phosphotransferasesystem OEOE_0464-0466 wird besonders durch Fructose induziert. O. oeni bildet in Abhängigkeit von der C-Quelle unterschiedliche Wege zur Reoxidation des im zentralen Phosphoketolaseweg entstandenen NAD(P)H aus. Die Regulation des Zentralstoffwechsels und des peripheren Stoffwechsels wurde durch Bestimmung der relativen Genexpression und durch Proteomanalysen untersucht. Die Anwesenheit von Citrat und Pyruvat ändert die Expression der Gene deutlich. Bei Zucht mit Ribose, Glucose oder Fructose jedoch bleibt die der meisten Gene konstant. Am stärksten wird der Ethanolweg reguliert, der hauptsächlich nach Zucht mit Glucose zur Reoxidation des NAD(P)H genutzt wird. Die Expression des adhE-Gens der Acetaldehyd- und Alkohol-Dehydrogenase nimmt bei Zucht auf anderen C-Quellen stark ab. Pyruvat ist ein zentrales Intermediat des Energiestoffwechsels und Ausgangsprodukt für Reaktionen des Bausstoffwechsels. Die Expression einiger Pyruvat-liefernder und Pyruvat-verbrauchender Reaktionen wurde bestimmt, um so die Entstehung und den Verbrauch des Pyruvats abhängig von der Stoffwechselsituation beurteilen zu können.

Objektive Schläfrigkeitsmessung unter Alkoholeinfluss

Alkohol und Schläfrigkeit sind die wichtigsten fahrerbezogenen Faktoren bei der Entstehung von Autounfällen. Bislang gibt es relativ wenige konkrete Erkenntnisse über die schläfrigkeitsfördernde Wirkung von Alkohol. Mit der vorliegenden Arbeit sollte erstmals eine quantitative und objektive Analyse der (Tages-)Schläfrigkeit unter Alkoholeinfluss während der gesamten Alkoholumsetzungskurve erstellt werden. Mit dem pupillographischen Schläfrigkeitstest (PST) steht ein Verfahren zur Verfügung, mit dem es möglich ist, Schläfrigkeit unter Alkoholeinfluss quantitativ zu bestimmen. Diese Methode beruht auf der Vermessung der Pupille, deren Durchmesser der efferenten sympathischen Steuerung unterliegt. Bei zunehmender Schläfrigkeit lässt der sympathische Einfluss auf die Pupillenweite nach und es kommt zu typischen Oszillationen der Pupille. Diese Oszillationen, sogenannte „Fatigue Waves“, werden in einem ruhigen, abgedunkelten Raum mittels Infrarotkamera über 11 Minuten kontinuierlich aufgezeichnet und als Pupillen-Unruhe-Index (PUI) in mm / min ausgegeben. Für diesen Wert existieren Normwerte, welche eine Einteilung der PUI-Werte in „normal“, „erhöht“ und „pathologisch“ ermöglichen. Es wurde ein standardisiertes Kollektiv von 53 Probanden zwischen 20 und 60 Jahren untersucht. Dieses bestand aus 28 Männern und 25 Frauen. Die Probanden wurden wahlweise mit Bier oder Wein stufenweise unter Blutalkohohol-konzentrationen von annähernd 0,3, 0,5 und 0,8 ‰ gesetzt, die genaue BAK wurde jeweils durch Gaschromatographie und ADH-Methode bestimmt. Während dieser Anflutungsphase wurde bei jeder der drei Stufen die Schläfrigkeit bestimmt. Dies geschah zum einen mittels objektivem PST und zum anderen durch die subjektive Stanford Sleepiness Scale (SSS), eine siebenstufige Skala zur Einschätzung der eigenen Schläfrigkeit. In der Eliminationsphase der Alkoholumsetzungskurve wurde wiederum bei 0,5 und 0,3 ‰ sowohl die subjektive als auch die objektive Schläfrigkeit gemessen. Eine Kontrollgruppe von 11 Probanden aus dem genannten Kollektiv wurde zu einem späteren Zeitpunkt unter gleichen Bedingungen ohne Alkoholeinfluss untersucht. Im Ergebnis zeigte die Anflutungsphase zunächst ein signifikantes Absinken des PUI um 5,9 %, gleichbedeutend mit einer höheren Vigilanz. Im weiteren Verlauf war das Maximum der Schläfrigkeit in der Eliminationsphase bei einer verhältnismäßig geringen BAK von durchschnittlich 0,54 ‰ zu beobachten. Der PUI hatte sich im Vergleich zum Ausgangswert um durchschnittlich 17,4 % erhöht und 40,4 % der Probanden wiesen erhöhte oder pathologische Schläfrigkeitswerte auf. Dieser Anteil lag um hochsignifikante 110 % höher als bei der Ausgangsmessung. Insgesamt ließ sich keine Korrelation zwischen objektiver und subjektiver Schläfrigkeit feststellen, obwohl auch die subjektive Schläfrigkeit stieg. Das Maximum der subjektiven Schläfrigkeit fiel zusammen mit dem Maximum der Alkoholisierung von 0,8 ‰. Wirkung auf das Ausmaß der Schläfrigkeit hatten die Häufigkeit des Alkoholkonsums, der Body-Mass-Index (BMI) und das Geschlecht. Je häufiger die Probanden nach eigenen Angaben Alkohol tranken und je höher der jeweilige BMI war, desto geringer war der Einfluss des Alkohols auf die Schläfrigkeit. Mit der Eigenschaft „weibliches Geschlecht“ ging eine höhere objektive Schläfrigkeit einher, allerdings auch eine höhere subjektive Einschätzung der eigenen Schläfrigkeit. Ein Einfluss der Getränkeart ließ sich hingegen nicht nachweisen. Für die Abnahme der Vigilanz spielte es keine Rolle, ob dies durch Bier oder Wein verursacht worden war. Bedenklich erschien die Tatsache, dass zum einen die Probanden das Ausmaß der eigenen Schläfrigkeit sogar unter relativ geringer Alkoholisierung nicht adäquat einschätzen konnten, und dass zum anderen das Maximum der Schläfrigkeit – und damit auch des mutmaßlichen Unfallrisikos – in der Eliminationsphase lag. Ein Zeitpunkt, zu dem sicherlich die meisten Alkoholfahrten unternommen werden.

Abstinenzverhalten von Patienten mit alkoholtoxischer Leberzirrhose in der Wartezeit vor Lebertransplantation: Selbstauskunft versus Alkoholmarker

Die alkoholische Leberzirrhose ist eine anerkannte Indikation für eine Lebertransplantation. Die Prognose dieser Patientengruppe ist bei sicherer Langzeitabstinenz besser als diejenige von Patienten mit einer Leberzirrhose anderer Genese. Jeglicher Alkoholkonsum stellt eine absolute Kontraindikation für eine Transplantation dar. In vielen Ländern gibt es die Forderung nach einer sechsmonatigen Alkoholabstinenz sowie einer guten Compliance vor der Lebertransplantation. Zu deren Überprüfung stehen in der Praxis meist methodisch unzureichende Standards zur Verfügung. Mit der seit den 80er Jahren in der Rechtsmedizin etablierten Alkoholbegleitstoff-Analyse werden die Serumkonzentrationen von Ethanol und anderen Alkoholen und Begleitstoffen, wie z.B. dem Methanol, bestimmt. Methanol ist ein sensitiver und spezifischer Indikator für einen rezenten Alkoholkonsum, da es aufgrund von kompetitiver Hemmung der ADH durch exogen herbeigeführtes (konsumiertes) Ethanol im Serum akkumuliert. Die Alkoholbegleitstoff-Analyse eignet sich im klinischen Alltag zur Überprüfung eines rezenten Alkoholkonsums bei Patienten mit Alkoholismushintergrund. rnIn dieser Studie wurde der Methanoltest standardisiert bei 41 Patienten mit einer ALC auf der Warteliste für eine LTx angewandt. Es wurde bei 32 von 92 Blutuntersuchungen ein Rückfall nachgewiesen, während die Selbstauskunft und der Ethanoltest jeweils nur in 3 Fällen positiv ausfielen. Der Methanoltest wies also in 29 Fällen (1/3) einen rezenten Alkoholkonsum nach, der weder in der Selbstauskunft noch durch den Ethanoltest aufgedeckt worden war.rnEs konnte gezeigt werden, dass der Methanoltest als Bestandteil der Alkoholbegleitstoff-Analyse für die Überprüfung des Abstinenzverhaltens von Patienten mit alkoholtoxischer Leberzirrhose auf der Warteliste vor Transplantation besser geeignet ist als die Selbstauskunft und der direkte Nachweis von Ethanol im Blut der Patienten. In der Praxis zeigte sich, dass mit einer unangekündigten Untersuchung mehr Rückfälle diagnostiziert werden können als bei länger im Voraus geplanten Routine-Untersuchungsterminen. rn

Reaktionen monovalenter Münzmetalle in flüssigem Ammoniak

Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals eine Reihe von Ammoniakaten von Münzmetallhalogeniden (M(I)Hal) und Pseudohalogeniden aus flüssigem Ammoniak in einkristalliner Form isoliert und strukturell charakterisiert werden. Mit dem Ammoniakat des Gold(I)-iodids wurden Metathesen in flüssigem Ammoniak durchgeführt, die die Isolierung einiger sehr thermolabiler, teilweise explosiver Alkoholate des Golds ermöglichten. Die Bestimmung der Kristallstruktur eines Gold(I)-phenolates erlaubte erste Einblicke in deren Aufbau.rnIn der Reihe der Ammoniakate der M(I)Hal mit Ausnahme von Silberiodid, werden keine direkten Metall-Halogen-Kontakte ausgebildet. Die Ammoniakate der Chloride und Bromide des Kupfers und Silbers sowie des Kupferiodids besitzen isotype Strukturen. Sie liegen als Trisammoniakate [M(NH3)3]Hal vor. Im Ammoniakat von Silberiodid besitzen die Silberionen durchgängig die Koordinationszahl 4. Neben Ag•••NH3- findet man auch direkte Kationen-rnAnionen-Kontakte und sehr kurze Ag(I)-Ag(I)-Abstände. Das Goldkation im Ammoniakat von Goldiodid besitzt die Koordinationszahl 2 und wird ausschließlich durch Ammoniakmoleküle koordiniert. Die gebildeten H3N-NH3-Hanteln werden über aurophile Wechselwirkungen verknüpft.rn rnDie Ammoniakate der Cyanide von Silber und Gold, enthalten molekulare Baueinheiten des Typs:(H3N)nMCN [(n= 1 für M= Au und n= 2 für M= Ag].rnrnAnders als bei den solvatfreien Homologen wird eine Ausbildung von Polymerketten nicht beobachtet. Das linear aufgebaute Ammoniakat von Goldcyanid ermöglicht die Ausbildung von aurophilen Wechselwirkungen. Metallophile Wechselwirkungen zwischen dem als Dimer vorliegenden Ammoniakat von AgCN scheinen nicht ausgebildet zu werden.rnrnMetatheseversuche von Goldiodid mit einem Amid und diversen Alkanolaten lieferten teilweise explosive Produkte. Es ist davon auszugehen, dass mit zunehmender Basizität der eingesetzten Anionen, die an das Gold(I)-ion koordinierten Ammoniakmoleküle deprotoniert werden und explosives Goldamid gebildet wird. Der als zweites Produkt entstehende Alkohol kann ebenfalls ein Ammoniakat bilden. Im Fall von Li-Fencholat wird ein solches in Form sehr tiefschmelzender Einkristalle erhalten.rnrnDa die Deprotonierung der an Gold koordinierten Ammoniakmoleküle unweigerlich zu explosiven oder sehr instabilen Produkten führt, wurde die geringere Basizität der Phenolate ausgenutzt, um dies zu umgehen. Im Falle der Umsetzung von AuI mit Li-2,6-di-tert.-butylphenolat gelang tatsächlich die Isolierung eines kristallinen Gold(I)-phenolats.rn

Leberregeneration bei fortgeschrittener Leberzirrhose : Untersuchung Albumin-exprimierender Gallengangsproliferate mittels In-situ-Hybridisierung

Die Leber besitzt das Potential nach verursachter Zellschädigung durch chemische, toxische, traumatische oder virale Einwirkung (55, 73, 79, 95) sich selbst zu regenerieren. Dies geschieht entweder durch Hyperplasie der Hepatozyten, d.h. einer Volumenzunahme durch vermehrte Zellteilung und Erhöhung der Zellzahl (73, 79). Bei massiver und chronischer Leberzellschädigung, wie z.B. alkohol-verursachter Leberzirrhose oder durch chronisch virale Hepatitis (55, 74, 81) können die Hepatozyten den entstandenen Defekt nicht kompensieren und die oval cells, Bezeichnung im Rahmen der Nagetiermodelle, werden aktiviert (98, 105). Das humane Equivalent zu den oval cells bei Nagetieren stellen die hepatischen Progenitorzellen dar (79), diese sind in den Hering-Kanälchen lokalisiert (1, 42, 49). Aufgrund ihrer bipotenten Differenzierungsfähigkeit, können aus den hepatischen Progenitorzellen sowohl Hepatozyten als auch Cholangiozyten hervorgehen (18, 45). rnFür die Untersuchungen einer positiven Albumin-mRNA-Expression in Gallengangsproliferaten bei menschlichen zirrhotischen Leberpräparaten, die im Rahmen der Leberregeneration aus hepatischen Progenitorzellen entstehen, bietet sich das bereits etablierte Verfahren der Albumin mRNA in situ Hybridisierung an. Zur Durchführung der Methode wurde ein bereits etabliertes Protokoll zur in situ Hybridiserung von mRNAs peroxisomaler Proteine verwendet (86, 87).rnDas Patientenkollektiv bestand aus insgesamt 50 Patienten (9 weiblichen und 41 männlichen), im Alter von 40 bis 69 Jahren (Median=53, 25 %-Perzentile=49, 75%-Perzentile=60). Sieben Patienten zeigten eine Leberzirrhose auf dem Boden einer Hepatitis B, 24 Patienten eine Leberzirrhose auf dem Boden einer Hepatitis C und 19 Patienten waren an einer äthyltoxisch-bedingten Leberzirrhose erkrankt. Zusätzlich wurde bei insgesamt 23 Patienten im Rahmen der histologischen Befundung ein Hepatozelluläres Karzinom (HCC) diagnostiziert. rnMikroskopisch zeigte sich in 48 von 50 Präparaten eine Gallengangsproliferation innerhalb der bindegewebigen Septen. Bei Vorliegen einer Gallengangsproliferation wurde deren Ausprägung in 4 Grade (0=keine, 1=wenig, 2=mäßig und 3=stark) eingeteilt. Ein möglicher signifikanter Unterschied, ob der Grad einer Gallengangsproliferation auf eine bestimmte Ursache der Leberzirrhose zurück zu führen ist, ließ sich mit einem p-Wert von 0,247 nicht eruieren. Ebenso wie die Gallengansproliferation wurde die Albuminexpression in Grade eingeteilt. Dabei wurde zwischen keiner (Grad 0), einer intermediären (Grad 1) und einer starken (Grad 2) Albuminexpression unterschieden. Hier waren mit einem p-Wert von 0,586 keine Unterschiede zwischen der Gradeinteilung der Albuminexpression und den 3 Gruppen zu erkennen.rnZwischen den Präparaten mit einem HCC und ohne HCC ergaben sich hinsichtlich des Grades der Gallengangsproliferation mit einem p-Wert von 0,803 keine signifikanten Unterschiede. In Bezug auf die Gradeinteilung der Albuminexpressionrnzeigte sich ebenfalls kein signifikanter Unterschied mit einem p-Wert von 0,275 zwischen Präparaten mit und ohne Nachweis eines HCCs. Ebenfalls zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen der Gallengangsproliferation (p-Wert von 0,709) und Albuminexpression (p-Wert von 0,613) zwischen Patienten jünger und älter als 60 Jahre.rnDie Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass mittels der in situ Hybridisierung ein Nachweis der Gallengangsproliferation in leberzirrhotischen Präparaten unterschiedlicher Ätiologien gelingt. Zudem kann diese Arbeit beweisen, dass die Gallengangsproliferate Albumin exprimieren und dass der Nachweis dieser Albuminexpression mittels in situ Hybridisierung möglich ist. Allerdings zeigte sich kein signifikanter Unterschied der Albumin-mRNA-Expression in den Gallengangsproliferaten zwischen den unterschiedlichen Ätiologien der Leberzirrhose und ebenfalls nicht im Vergleich von Leberzirrhosen unterschiedlicher Genese mit und ohne gleichzeitigem Nachweis eines HCCs. rn

Biologisch aktive Sekundärmetabolite aus Pflanzen und Pilzen : Phenanthro-Alkaloide ; phytotoxische Dioxolanone

Als Phenanthro-Alkaloide wird eine kleine Gruppe von pentacyclischen, auf dem Phenanthren-Strukturmotiv basierenden Indolizidinen sowie Chinolizidinen bezeichnet. Von Letztgenannten sind bisher fünf, von den homologen Phenanthroindolizidinen mehr als sechzig natürliche Vertreter gefunden worden. Das wohl bekannteste Alkaloid in dieser Gruppe ist das Indolizidin-Alkaloid Tylophorin, das beispielsweise aus Tylophora indica (Apocynaceae, "Hundsgiftgewächse") gewonnen werden kann. Tylophorin und verwandte Derivate besitzen potente biologische und physiologische Wirkungen. So entfalten sie sowohl antiinflammatorische als auch antineoplastische Effekte (wirksam auch bei MDR-Tumorzelllinien, MDR = "multi drug resistant").rnrnDas Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Methoden zur Herstellung von Phenanthro-Alkaloiden und deren Derivaten zu entwickeln. Ausgehend von (S)-Prolin konnten sowohl (S)-(+)-Tylophorin (>99% ee) als auch ein bisher noch nicht beschriebenes Derivat, das sich durch eine deutlich geringere Lichtempfindlichkeit im Vergleich zu Tylophorin aus¬zeichnet, in 33%-iger Gesamtausbeute über neun lineare Stufen, hergestellt werden. Die Synthese von (R)-(-)-Tylophorin gelang in analoger Weise aus (R)-Prolin in 21%-iger Ausbeute (93% ee). Der Einsatz von Schutzgruppen war nicht notwendig.rnDer Schlüsselschritt ist in beiden Fällen eine Cyclisierung an eine C=N-Doppelbindung über freie Radikale, die bei der Synthese des neuen Derivats hochstereoselektiv zur Bildung des (13aS,14S) Diastereomers führt. Die Synthese von 7-Methoxycryptopleurin gelang durch eine ähnliche Synthesestrategie. rnrnZur Herstellung von Cryptopleurin ist zunächst ein neuer Syntheseweg für 9-(Hydroxymethyl)-2,3,6-trimethoxyphenanthren entwickelt worden. Dieser führt über den Aufbau eines Biphenylsystems durch palladiumkatalysierte Kreuzkupplung, eine anschließende COREY-FUCHS-Transformation und als Schlüsselschritt über eine Gold-NHC-Komplex katalysierte 6-endo-dig-Cyclisierung zum entsprechenden Phenanthren. Diese Ringschlussreaktion verläuft in gewünschter Weise regioselektiv unter Bildung des 2,3,6-trimethoxysubstituierten Phenanthrens. Die Bil¬dung des regioisomeren 2,3,8-Trimethoxyphenanthrens wird nicht beobachtet. Der Alkohol wird dann in fünf linearen Stufen (34%) in das Xanthogenat überführt, aus dem sich durch eine zweistufige Reaktionssequenz, bestehend aus einer Radikal¬cyclisierung nach ZARD und einer Reduktion mit LiAlH4 das extrem lichtempfindliche und hochtoxische Alkaloid (R)-(-)-Cryptopleurin gewinnen ließ (50%).rnNachdem beide Enantiomere und das Racemat von Tylophorin synthetisiert worden waren und zum Vergleich bereit standen, wurde Tylophorin aus Tylophora indica extrahiert. rnDie Motivation rührte unter anderem daher, dass in der bisherigen Literatur Unstimmigkeiten über das in der Natur vorkommende Enantiomer des Tylophorins herrschten. Vor Beginn dieser Arbeit ging man davon aus, dass in T. indica nur (R)-(-)-Tylophorin vorkommt und für die Diskrepanzen zwischen den berichteten Drehwerten von, aus Pflanzenmaterial isolierten und des synthetisierten Naturstoffs, dessen Zersetzung vor oder während der Messung verantwortlich ist. Dieser Effekt kann zwar auch beobachtet werden, jedoch trägt er nur in geringem Maße zur Erniederigung des Drehwertes bei. Schließlich sind Proben von synthetisiertem Tylophorin in gleichem Maße von der schnell eintretenden Oxidation des Alkaloids betroffen. Aus dem Rohextrakt ist Tylophorin durch RP-HPLC isoliert worden. Anschließend wurde die Probe mittels chiraler HPLC/MS analysiert. Durch den Vergleich mit den bereit stehenden synthetischen Proben von (R)- und (S)-Tylophorin konnte in dieser Arbeit erstmals experimentell belegt werden, dass es sich bei (−)-Tylophorin aus T. indica um ein scalemisches Gemisch im Verhältnis von 56:44 (R:S) handelt.rnrnDas Ziel dieses Teilprojektes war die Entwicklung einer Synthese für den bisher noch nicht synthetisch hergestellten phytotoxischen Sekundärmetabolit (+)-Phenguignardiasäure. Isoliert wurde diese Verbindung aus Guignardia bidwellii, dem Erreger der Schwarzfäule der Weinrebe. Die absolute Konfiguration des quartären Stereozentrums war zu Beginn dieser Arbeit nicht bekannt. Ausgehend von (R)-Phenylmilchsäure und 3-Phenylprop-2-in-1-ol gelang die Synthese beider Enantiomere des Dioxolanons in acht linearen Stufen. Sie liefert den experimentellen Beweis (ECD, Polarimetrie) für die (S)-Konfiguration von natürlicher (+)-Phenguignardiasäure.rnrn

Weinproteine - Allergenität und Trubbildung

Wein ist eine komplexe Lösung bestehend aus verschiedensten Komponenten wie Alkohol, Polyphenolen, Polysacchariden, Sulfiten und auch Proteinen. Auch wenn Proteine nur in geringen Mengen im Wein enthalten sind, beeinflussen sie die Qualität maßgeblich. Hier ist zum einen deren potentielle Unverträglichkeit bis hin zur Allergie zu nennen, und zum anderen der Einfluss der Weinproteine auf die Trübung. Im Rahmen einer epidemiologischen Studie der Arbeitsgruppe Fronk/Decker wurde festgestellt, dass es in der Weinregion Mainz ein starkes Interesse gibt die Ursache einer Weinunverträglichkeit zu untersuchen. Für weiterführende Untersuchungen wurde im Rahmen meiner Arbeit das Lipid Transfer Protein (LTP), welches als einziges Allergen der Traube bekannt ist, aus Trauben und Wein in hohem Reinheitsgrad isoliert. Es konnte gezeigt werden, dass dessen Struktur bei der Weinherstellung nicht maßgeblich verändert wurde. In einer klinischen Studie mit 29 Probanden wurde die potentielle Allergenität von Weinproteinen, im Besonderen des LTPs untersucht. Allerdings konnte bei den untersuchten Probanden keine echte IgE-Antikörper-vermittelte Allergie auf das LTP nachgewiesen werden. Daher wird die Ursache der beschriebenen Unverträglichkeiten bei anderen Weininhaltsstoffen oder auch auf pollenassoziierten Kreuzreaktionen vermutet. Bei der Entstehung einer Weintrübung sind zahlreiche Inhaltstoffe beteiligt. Die Rolle der Proteine ist in diesem Zusammenhang noch nicht abschließend geklärt. In dieser Arbeit wurde die Komplexität der Proteinzusammensetzung in Abhängigkeit von Lage, Jahrgang, Rebsorte sowie Behandlungsmaßnahmen gezeigt. Hinsichtlich der Stabilisierung und Trübungsrelevanz der Weinproteine konnte mittels biochemischer, bioinformatischer und biophysikalischer Methoden gezeigt werden, dass nur ein Teil der im Wein enthaltenen Thaumatin-ähnlichen Proteine und Chitinasen an der Trubbildung beteiligt sind. Die Invertase hingegen denaturiert erst ab einer Temperatur von ca. 83 °C und aggregiert in der Trübung. Somit führt dieses Protein bei Wärmetests zu Bentonitbedarfsermittlung in diesem Temperaturbereich zu einer Überschätzung. Die Versuche zur temperaturabhängigen Aggregation von Proteinen zeigen, wie wichtig die Berücksichtigung der Umgebungsfaktoren bei der Trubbildung ist. So konnten unterschiedliche Wechselwirkungen im Puffer- und realen Weinsystem von potentiell trübungsstabilisierenden Polysacchariden mit den Weinproteinen detektiert werden. Für das Arabinogalactan beispielsweise wurde in den Versuchen im Weinsystem eine destabilisierende Wirkung gefunden, während es bei den Versuchen im Puffersystem eine positive Wirkung auf die Stabilisierung der Probe zeigte. Es zeigte sich, dass die verschiedenen Weininhaltsstoffe in einer komplexen Wechselwirkung zueinander stehen und somit eine molekulare Interpretation erschweren.