Untersuchungen zur Lokalisation und Expression des respiratorischen Proteins Neuroglobin bei Säugetieren

In der vorliegenden Arbeit wurde Neuroglobin (Ngb), ein evolutiv altes und in Metazoen konserviertes respiratorisches Protein, funktionell untersucht. Mittels des induzierbaren Tet on / Tet off Systems wurde Ngb ektopisch in der murinen Leber und im Gehirn überexprimiert. Die Transkriptome von Leber und Gehirnregionen Ngb-transgener Mäuse wurden mittels Microarrays und RNA-Seq im Vergleich zum Wildtyp analysiert, um Auswirkungen der Ngb-Überexpression zu ermitteln. Die Transkriptom-Analyse in Leber und Gehirn zeigte eine nur geringe Anzahl differenziell regulierter Gene und Stoffwechselwege nach Ngb-Überexpression. Ngb transgene Mäuse wurden CCl4-induziertem ROS-Stress ausgesetzt und die Leberfunktion untersucht. Zudem wurden primäre Hepatozyten-Kulturen etabliert und in diesen in vitro die extrinsische Apoptose induziert. Die Stressversuche zeigten: (i) Die Ngb-Überexpression hat keine protektive Wirkung in der Leber in vivo. (ii) In Leberzellen in vitro hingegen verminderte eine Ngb-Überexpression effizient die Aktivierung der apoptotischen Kaskade. Eine protektive Wirkung von Ngb ist vermutlich von betrachtetem Gewebe und dem verwendeten Stressor abhängig und keine generelle, selektierte Funktion des Proteins.rnWeiterhin wurde eine Ngb-KnockOut-Mauslinie mit einem LacZ-KnockIn-Genotyp etabliert. Hierbei zeigten die KO-Mäuse keinen offensichtlichen Phänotyp in ihrer Entwicklung, Fortpflanzung und Retina-Funktion. Unter Verwendung des LacZ-Knockin-Konstrukts konnten kontrovers diskutierte Ngb-Expressionsorte im adulten Mausgehirn (Hippocampus, Cortex und Cerebellum) sowie in Testes experimentell bestätigt werden. Parallel wurden öffentlich verfügbare RNA-Seq Datensätze ausgewertet, um die regionale Ngb-Expression systematisch ohne Antikörper-assoziierte Spezifitätsprobleme zu charakterisieren. Eine basale Ngb-Expression (RPKM: ~1-5) wurde im Hippocampus, Cortex und Cerebellum, sowie in Retina und Testes ermittelt. Eine 20-40fach höhere, starke Expression (RPKM: ~160) wurde im Hypothalamus bzw. im Hirnstamm nachgewiesen. Die „digitale“ Expressionsuntersuchung wurde mittels qRT-PCR und Western Blot bestätigt. Dieses Expressionsprofil von Ngb in der Maus weist auf eine besondere funktionelle Bedeutung von Ngb im Hypothalamus hin. Eine Funktion von Ngb in der Sauerstoffversorgung der Retina und eine generelle Funktion von Ngb in der Protektion von Neuronen sind mit dem beobachteten Expressionsspektrum weniger gut vereinbar.

Funktionelle und strukturelle Charakterisierung des Ovastacins in vivo und in vitro

Die Metalloprotease Ovastacin, ein Vertreter der Astacin-Familie, wurde erstmals 2004 beschrieben. Im Ovar von Säugetieren ist Ovastacin-mRNA im Zeitfenster vom Stadium der Sekundärfollikel bis kurz nach der Befruchtung der Eizelle zu finden. Der Expressionsort und -zeitpunkt sowie die Sequenzähnlichkeit von über 60% mit sogenannten „Schlüpfenzymen“ (engl. hatching enzymes), die man in den Eizellen und Zygoten niederer Wirbeltiere und Wirbelloser gefunden hatte, ließen die Vermutung aufkommen, es könnte sich hier um das Säugerhomolog dieser Proteasen handeln. Generell lösen hatching Enzyme die derben embryonalen Hüllstrukturen (bei Säugern die Zona pellucida, ZP) beim Schlüpfvorgang auf. Die essentielle Bedeutung des Ovastacins für die Befruchtung wird durch die um ca. 30% reduzierte Fruchtbarkeit von Ovastacin defizienten Mäusen belegt. Hochinteressant war in diesem Zusammenhang die Entdeckung des Ovastacins in den Cortikalgranula der Oocyten sowie seine Fähigkeit, das Zona pellucida Protein 2 zu schneiden. Die dadurch bewirkte Verhärtung der Zona pellucida verhindert das Eindringen weiterer Spermien, das heißt sie baut eine Barriere gegen Polyspermie auf. Ziel dieser Arbeit war es, Belege für die physiologische Funktion des Ovastacins zu finden. Vor allem galt es, potentielle Aktivatoren zu identifizieren, da das Enzym wie alle Astacine als inaktive Vorstufe gebildet wird, die proteolytisch aktiviert werden muss. Zu diesem Zweck exprimierte ich rekombinantes Pro-Ovastacin in Insektenzellen. Aktivierungsstudien in vitro zeigten, dass ein saures Milieu zu einer Aktivierung führt, ohne die Abspaltung des Propeptids zu bewirken. Sequenzalignments und ein homologes Strukturmodell des Ovastacins wiesen auf Trypsin- oder Elastase-ähnliche Serinproteasen als potentielle Aktivierungsenzyme hin. Tatsächlich konnte mit diesen beiden Proteasetypen zum ersten Mal aktives Ovastacin aus Pro-Ovastacin erzeugt werden. Trypsin kommt als physiologischer Aktivator allerdings nicht in Betracht, da es bisher in keinem der Gewebe nachgewiesen werden konnte, in dem Ovastacin exprimiert wird. Die neutrophile Elastase dagegen konnte in der Leber, im Herz sowie im Blutplasma nachgewiesen werden. Mit Hilfe spezifischer Antikörper konnte das Herz als Expressionsort für Ovastacin bestätigt werden. Somit wäre Elastase ein potentieller physiologischer Aktivator von Ovastacin. Die Identifikation des Ovastacins in Geweben wie Leber, Herz, Nabelschnur und im Blutplasma weist auf eine Rolle der Protease in proteolytischen Netzwerken außerhalb der Spermien-Ei-Interaktion hin. Die Bedeutung der biologischen Kontrolle des Ovastacins bei der Befruchtung der Säugereizelle wird durch die Beobachtung untermauert, dass das Leberprotein Fetuin B als physiologischer Ovastacininhibitor fungiert und dadurch eine vorzeitige Verhärtung der Zona pellucida verhindert, die andernfalls die Penetration von Spermien prinzipiell verhindern würde.

Differenzielle Expression von Tubulin-Genen bei der Entwicklung von Blattzellen der Gerste (Hordeum vulgare L.)

Die Morphogenese einer Pflanzenzelle wird in großem Maße durch die Dynamik kortikaler Mikrotubuli (MT) bestimmt, die auf die Zellwandsynthese Einfluß nehmen. In dieser Arbeit wurden die Transkriptmengen der alpha-Tubulin-Isotypen und des gamma-Tubulin während der Entwicklung des Gerstenblattes analysiert, um Zusammenhänge zu bereits beschriebenen Umwandlungen im kortikalen MT-Cytoskelett der Mesophyllzellen aufzudecken. Erstmals konnte bei einer höheren Pflanze die Genexpression auf RNA-Ebene innerhalb einer Tubulin-Multigenfamilie im Verlauf der Blattentwicklung umfassend dargestellt werden.Es wurden blattspezifische cDNA-Bibliotheken erstellt und mittels RT-PCR homologe DNA-Gensonden für die Screeningprozesse der cDNA-Bibliotheken hergestellt. cDNA-Sequenzen von alpha-, beta-, und gamma-Tubulin konnten isoliert werden. Weitere, weniger abundante alpha-Tubulin-Sequenzen wurden während zusätzlicher Screeningrunden über PCR-Ausschluß häufig vertretener, bereits bekannter Isotypen isoliert.Die cDNA-Sequenzen von insgesamt fünf verschiedenen Isotypen des alpha-Tubulin konnten aufgeklärt werden, drei Isotypen wiesen bis zu fünf im nicht kodierenden 3´-Bereich verkürzte Varianten auf, die aber in ihrer Anzahl deutlich unterrepräsentiert waren. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen umfassten bei drei Isotypen 451 Aminosäuren (AS), zwei Isotypen waren im C-Terminus um eine bzw. um zwei AS kürzer. Die fünf alpha-Tubulin-Isotypen wiesen charakteristische Expressionsmuster auf, die in drei Klassen unterteilbar waren. Die Isotypen HVATUB1 und HVATUB5 (MT-Band-Isotypen) hatten den maximalen Gehalt in Blattbereichen, in denen auch hauptsächlich Mesophyllzellen mit kortikalen MT-Bänderungen vorkommen, wobei HVATUB5 den am schwächsten exprimierte Isotyp darstellte. HVATUB3 (Random-MT-Isotyp) zeigte die stärksten Expressionsraten. Die im Meristem und meristemnahen Bereichen bereits recht hohe Abundanz erreichte erst nach der Zellstreckungszone in einer Blattzone das Maximum, in dem hauptsächlich Mesophyllzellen mit zerstreut angeordneten MT anzutreffen sind. Die Isotypen HVATUB2 und HVATUB4 (MImax-Isotypen) waren in mitotisch aktiven, basalen Blattbereichen dominant.Die cDNA-Sequenz vom gamma-Tubulin der Gerste, HVGTUB, wurde ermittelt; die abgeleitete Aminosäuresequenz bestand aus 469 AS. Das Auftreten einer im nicht kodierenden 3´-Bereich kürzeren Variante konnte erstmals bei pflanzlichem gamma-Tubulin beschrieben werden. Southernblot-Analysen ließen darauf schließen, daß gamma-Tubulin nur als Einzelkopie im Genom der Gerste vorkommt. gamma-Tubulin wurde im mitosereichen Meristem der Blattbasis am stärksten exprimiert. Da die Abnahme der Transkriptmenge weitaus langsamer verlief als die Abnahme der Zellteilungsaktivität, ist anzunehmen, daß gamma-Tubulin neben der Erfüllung von mitose- und zellteilungsspezifischen Funktionen auch eine Rolle im Zusammenhang mit der Dynamik des kortikalen MT-Cytoskeletts spielt. Einen ersten Schritt zur Aufklärung der Genfamilie des beta-Tubulin bei Gerste stellt die Isolierung drei verschiedener cDNA-Sequenzen von beta-Tubulin dar.

Untersuchungen zur rekombinanten Expression und Faltung pflanzlicher Tyrosinasen

In ihrer dualen Funktion als Monophenolhydroxylase (EC 1.14.18.1) und Diphenoloxidase (EC 1.10.3.1) ist die Tyrosinase das Schlüsselenzym der Melanogenese, der Synthese des Melanins, und übernimmt damit quer durch alle Organismenreiche Aufgaben von der Pigmentierung bis hin zu einer Beteiligung an der Immunantwort. Sie zählt, zusammen mit den Catecholoxidasen und Hämocyaninen, zu den Typ-3-Kupfer-Proteinen, die sich durch ein Aktives Zentrum auszeichnen, das in der Lage ist, Sauerstoff und phenolische Substrate reversibel zwischen zwei Kupfer-Ionen zu binden. Bisher konnte weder die Funktion der pflanzlichen Tyrosinase genau identifiziert, noch die Struktur eines solchen Enzyms aufgeklärt werden. Mit dem späteren Ziel, durch eine röntgenkristallographische Analyse die zugrunde liegende strukturelle Ursache der zusätzlichen Monophenolhydroxylase-Aktivität von Tyrosinasen gegenüber reinen Catecholoxidasen ermitteln zu können, wurde in dieser Arbeit ein bakterielles Expressionssystem entwickelt, das zur Herstellung einer rekombinanten Tyrosinase oder Polyphenoloxidase (PPO) aus Spinacia oleracea (Spinat) für die Kristallisation verwendet werden kann. Das rekombinante Protein wurde in Form von Inclusion Bodies isoliert, anhand einer Affinitätschromatographie aufgereinigt und in anschließende Rückfaltungsexperimente eingesetzt. In einer parallelen Versuchsreihe konnte Spinat, aufgrund seiner hohen Tyrosinaseaktivität, als geeignetes Objekt für die Isolation des nativen Enzyms identifiziert werden. Im Anschluss an eine Thylakoidpräparation, Solubilisierung der Thylakoidmembranen und Fällung des Proteins mit Ammoniumsulfat, wurden Experimente zur weiteren Anreicherung der Tyrosinase-Aktivität über eine Anionenaustausch-Chromatographie und zur Etablierung einiger nachfolgender Aufreinigungsschritte durchgeführt.

Post-transkriptionelle Regulation der Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase

Die Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase (iNOS) wird sowohl über transkriptionelle als auch über post-transkriptionelle Mechanismen reguliert. Dabei spielt die Modulation der iNOS-mRNA-Stabilität durch RNA-bindende Proteine eine bedeutende Rolle. In dieser Arbeit konnte eine Beteiligung des p38-MAPK-Signaltransduktionsweges sowie der RNA-bindenden Proteine TTP, KSRP, HuR und PTB an der Regulation der iNOS-Expression dargestellt werden. Hemmung der p38-MAPK führte zu einer Reduktion der iNOS-mRNA-Expression, hatte aber keinen Effekt auf die iNOS-Promotoraktivität. Das RNA-bindende Protein Tristetraprolin (TTP) erhöhte die Stabilität der iNOS-mRNA nach Zytokin-Stimulation, ohne jedoch mit ihr zu interagieren. Die Proteinexpression von TTP war unter dem Einfluss von Zytokinen erhöht; Inhibition der p38-MAPK verursachte eine Verminderung der Zytokin-stimulierten TTP-Expression. Das „KH-type splicing regulatory protein" (KSRP) übte einen destabilisierenden Effekt auf die iNOS-mRNA aus. Der Abbau der mRNA wird dabei wahrscheinlich durch eine Zytokin-unabhängige Interaktion von KSRP mit dem Exosom vermittelt. Ebenso konnte zwischen KSRP und TTP eine Wechselwirkung beobachtet werden, die nach Induktion der iNOS-Expression mit Zytokinen verstärkt und durch p38-MAPK-Inhibitoren hemmbar war. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Bindung von KSRP an die iNOS-mRNA-3’-UTR für die Vermittlung des destabilisierenden Effekts essentiell ist. Eine genaue Lokalisierung der KSRP-Bindungsstelle ergab, dass KSRP ebenso wie HuR mit dem AU-reichen Element am 3’-Ende der 3’-UTR interagiert. KSRP und HuR sind in der Lage, um diese Bindungsstelle zu konkurrieren. Nach Zytokin-Stimulation war dementsprechend die endogene Bindung von KSRP an die iNOS-mRNA vermindert, während die endogene Bindung von HuR an die iNOS-mRNA verstärkt war. Die Stabilisierung der iNOS-mRNA nach Zytokin-Stimulation ergibt sich demnach aus einer Verminderung der Bindung des KSRP-Exosom-Komplexes an die iNOS-mRNA als Folge der verstärkten Interaktion von TTP und KSRP. Dies ermöglicht parallel eine vermehrte Bindung von HuR an die iNOS-3’-UTR und führt damit zu einer Stabilisierung der iNOS-mRNA und so letztendlich auch zu einer Erhöhung der iNOS-Expression. Außerdem konnte eine Beteiligung des Polypyrimidin-Trakt-bindenden Proteins (PTB) an der Regulation der humanen iNOS-Expression gezeigt werden. PTB erhöhte die Expression der iNOS und interagierte Zytokin-unabhängig mit KSRP. Zusammenfassend lässt sich schließen, dass ein Zusammenspiel verschiedener Proteine in einem komplexen Netzwerk für die fein abgestimmte Regulation der humanen iNOS-Expression auf post-transkriptioneller Ebene verantwortlich.

Analysen zur Expression proinflammatorischer Mediatoren in humanen Zellkulturmodellen und murinen Tiermodellen chronisch-inflammatorischer Erkrankungen

Die humane induzierbare NO-Synthase (iNOS) spielt bei zahlreichen Erkrankungen wie Asthma, Krebs und der rheumatoiden Arthritis eine entscheidende Rolle. Durch Fehlregulation der iNOS-Expression kommt es häufig zu massiven Gewebeschädigungen. Aus diesem Grund ist es wichtig die Mechanismen der Genregulation der iNOS-Expression zu verstehen. Bei Affinitätschromatographie-Analysen wurde das zytosolische PolyA-bindende Protein (PABP) als direkter Interaktionspartner der 3´UTR der humanen iNOS identifiziert. Weitere Bindungsanalysen konnten eine spezifische Bindestelle für PABP in der 5´UTR und zwei Bindestellen im AU-reichen Bereich der 3´UTR der humanen iNOS nachweisen. Eine siRNA-mediierte Herabregulation von PABP mit Hilfe der stabilen Expression spezifischer siRNAs in DLD-1 Zellen (siPABP Zellen) zeigte eine signifikant verringerte Expression der humanen iNOS und damit einhergehend eine verringerte NO-Produktion nach Zytokinstimulation. Promotoranalysen zeigten keine Veränderung der Induzierbarkeit des humanen 16 kb iNOS-Promotors in siPABP Zellen. RNA-Stabilitätsanalysen zeigten einen verstärkten Abbau der iNOS-mRNA in diesen Zellen, so dass davon auszugehen ist, dass die Regulation der humanen iNOS über die mRNA-Stabilität erfolgt. Reportergen-Analysen mit Plasmiden, welche die 5’ und/oder 3’UTR Sequenzen der humanen iNOS mit den identifizierten PABP-Bindestellen oder Mutationen in diesen Bindestellen enthielten, zeigten, dass PABP die iNOS-mRNA über die 5´UTR stabilisiert und anscheinend über die 3´UTR einen destabilisierenden Effekt auf die mRNA ausübt. Ebenfalls scheint PABP über die 3’UTR dieTranslation der iNOS mRNA zu hemmen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass PABP, über seine allgemeinen Funktionen hinaus, eine spezifische Rolle in der Regulation der Expression der humanen iNOS einnimmt.rnDie rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch entzündliche Autoimmunerkrankung, welche überwiegend die peripheren Gelenke der Hände und Füße betrifft. Die aktuellen Therapiemöglichkeiten sind immer noch mit einer Vielzahl von Nebenwirkungen behaftet und führen nicht zur vollständigen Remission der Erkrankung, so dass die Entwicklung neuer Medikamente unerlässlich ist. In dieser Arbeit wurden die antiinflammatorischen Substanzen Gallielalacton (Gal) und Oxacyclododecindion (Oxa) im Mausmodell der kollagen-induzierten Arthritis (CIA) getestet. Leider waren beide Substanzen nicht in der Lage die Symptome der CIA zu vermindern, obwohl beide im Modell der LPS-induzierten akuten Entzündung die Expression proinflammatorischer Mediatoren senken konnten. Die Substanz S-Curvularin (SC) hat sich im CIA-Modell bereits bewährt und wurde in dieser Arbeit weiter untersucht. SC war in der Lage die Expression knorpel- und knochendestruktiver Markergene signifikant zu verrindern. rnIn der vorliegenden Arbeit wurden neue microRNAs identifiziert, die in der Pathogenese der CIA eine Dysregulation zeigen. Die Expression dieser microRNAs wurde von SC wieder auf das Normalniveau gebracht, so dass SC eine vielversprechende Substanz in der Therapie chronisch inflammatorische Erkrangungen sein könnte. Die neu identifizierten CIA-relevanten microRNAs könnten als neueRA-Marker oder als Zielstrukturen für neue Medikamente dienen.rn