Untersuchungen zur rekombinanten Expression und Faltung pflanzlicher Tyrosinasen

In ihrer dualen Funktion als Monophenolhydroxylase (EC 1.14.18.1) und Diphenoloxidase (EC 1.10.3.1) ist die Tyrosinase das Schlüsselenzym der Melanogenese, der Synthese des Melanins, und übernimmt damit quer durch alle Organismenreiche Aufgaben von der Pigmentierung bis hin zu einer Beteiligung an der Immunantwort. Sie zählt, zusammen mit den Catecholoxidasen und Hämocyaninen, zu den Typ-3-Kupfer-Proteinen, die sich durch ein Aktives Zentrum auszeichnen, das in der Lage ist, Sauerstoff und phenolische Substrate reversibel zwischen zwei Kupfer-Ionen zu binden. Bisher konnte weder die Funktion der pflanzlichen Tyrosinase genau identifiziert, noch die Struktur eines solchen Enzyms aufgeklärt werden. Mit dem späteren Ziel, durch eine röntgenkristallographische Analyse die zugrunde liegende strukturelle Ursache der zusätzlichen Monophenolhydroxylase-Aktivität von Tyrosinasen gegenüber reinen Catecholoxidasen ermitteln zu können, wurde in dieser Arbeit ein bakterielles Expressionssystem entwickelt, das zur Herstellung einer rekombinanten Tyrosinase oder Polyphenoloxidase (PPO) aus Spinacia oleracea (Spinat) für die Kristallisation verwendet werden kann. Das rekombinante Protein wurde in Form von Inclusion Bodies isoliert, anhand einer Affinitätschromatographie aufgereinigt und in anschließende Rückfaltungsexperimente eingesetzt. In einer parallelen Versuchsreihe konnte Spinat, aufgrund seiner hohen Tyrosinaseaktivität, als geeignetes Objekt für die Isolation des nativen Enzyms identifiziert werden. Im Anschluss an eine Thylakoidpräparation, Solubilisierung der Thylakoidmembranen und Fällung des Proteins mit Ammoniumsulfat, wurden Experimente zur weiteren Anreicherung der Tyrosinase-Aktivität über eine Anionenaustausch-Chromatographie und zur Etablierung einiger nachfolgender Aufreinigungsschritte durchgeführt.

As monophenol hydroxylase (EC 1.14.18.1) and diphenol oxidase (EC 1.10.3.1) tyrosinase is the key enzyme of melanogenesis, the synthesis of melanin, and is involved in important physiological mechanisms throughout all organisms such as pigmentation and immune response. Tyrosinases, as well as catechol oxidases and hemocyanins, belong to the class of type-3 copper proteins containing a catalytic site which reversibly binds oxygen and phenolic substrates between two copper ions. The physiological function of tyrosinases in plants is not yet understood, neither is the 3D structure of any tyrosinase known so far. For further understanding of differences in the catalytic mechanisms of tyrosinase and catechol oxidase a crystal structure of tyrosinase is crucial. In this study a method for bacterial expression of a recombinant tyrosinase or polyphenol oxidase (ppo) from Spinacia oleracea (spinach) was established to provide protein for crystallization. The recombinant protein was isolated as inclusion bodies, purified using affinity chromatography and included in subsequent refolding experiments. In a parallel approach spinach was identified as optimal source for isolation of the native enzyme, due to its high tyrosinase activity. Following thylakoid preparation, solubilization of thylakoid membranes and protein precipitation with ammonium sulphate, enrichment of tyrosinase activity was achieved through ion exchange chromatography. Experiments for further purification of the enzyme were initiated.