Differenzielle Expression von Tubulin-Genen bei der Entwicklung von Blattzellen der Gerste (Hordeum vulgare L.)

Die Morphogenese einer Pflanzenzelle wird in großem Maße durch die Dynamik kortikaler Mikrotubuli (MT) bestimmt, die auf die Zellwandsynthese Einfluß nehmen. In dieser Arbeit wurden die Transkriptmengen der alpha-Tubulin-Isotypen und des gamma-Tubulin während der Entwicklung des Gerstenblattes analysiert, um Zusammenhänge zu bereits beschriebenen Umwandlungen im kortikalen MT-Cytoskelett der Mesophyllzellen aufzudecken. Erstmals konnte bei einer höheren Pflanze die Genexpression auf RNA-Ebene innerhalb einer Tubulin-Multigenfamilie im Verlauf der Blattentwicklung umfassend dargestellt werden.Es wurden blattspezifische cDNA-Bibliotheken erstellt und mittels RT-PCR homologe DNA-Gensonden für die Screeningprozesse der cDNA-Bibliotheken hergestellt. cDNA-Sequenzen von alpha-, beta-, und gamma-Tubulin konnten isoliert werden. Weitere, weniger abundante alpha-Tubulin-Sequenzen wurden während zusätzlicher Screeningrunden über PCR-Ausschluß häufig vertretener, bereits bekannter Isotypen isoliert.Die cDNA-Sequenzen von insgesamt fünf verschiedenen Isotypen des alpha-Tubulin konnten aufgeklärt werden, drei Isotypen wiesen bis zu fünf im nicht kodierenden 3´-Bereich verkürzte Varianten auf, die aber in ihrer Anzahl deutlich unterrepräsentiert waren. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen umfassten bei drei Isotypen 451 Aminosäuren (AS), zwei Isotypen waren im C-Terminus um eine bzw. um zwei AS kürzer. Die fünf alpha-Tubulin-Isotypen wiesen charakteristische Expressionsmuster auf, die in drei Klassen unterteilbar waren. Die Isotypen HVATUB1 und HVATUB5 (MT-Band-Isotypen) hatten den maximalen Gehalt in Blattbereichen, in denen auch hauptsächlich Mesophyllzellen mit kortikalen MT-Bänderungen vorkommen, wobei HVATUB5 den am schwächsten exprimierte Isotyp darstellte. HVATUB3 (Random-MT-Isotyp) zeigte die stärksten Expressionsraten. Die im Meristem und meristemnahen Bereichen bereits recht hohe Abundanz erreichte erst nach der Zellstreckungszone in einer Blattzone das Maximum, in dem hauptsächlich Mesophyllzellen mit zerstreut angeordneten MT anzutreffen sind. Die Isotypen HVATUB2 und HVATUB4 (MImax-Isotypen) waren in mitotisch aktiven, basalen Blattbereichen dominant.Die cDNA-Sequenz vom gamma-Tubulin der Gerste, HVGTUB, wurde ermittelt; die abgeleitete Aminosäuresequenz bestand aus 469 AS. Das Auftreten einer im nicht kodierenden 3´-Bereich kürzeren Variante konnte erstmals bei pflanzlichem gamma-Tubulin beschrieben werden. Southernblot-Analysen ließen darauf schließen, daß gamma-Tubulin nur als Einzelkopie im Genom der Gerste vorkommt. gamma-Tubulin wurde im mitosereichen Meristem der Blattbasis am stärksten exprimiert. Da die Abnahme der Transkriptmenge weitaus langsamer verlief als die Abnahme der Zellteilungsaktivität, ist anzunehmen, daß gamma-Tubulin neben der Erfüllung von mitose- und zellteilungsspezifischen Funktionen auch eine Rolle im Zusammenhang mit der Dynamik des kortikalen MT-Cytoskeletts spielt. Einen ersten Schritt zur Aufklärung der Genfamilie des beta-Tubulin bei Gerste stellt die Isolierung drei verschiedener cDNA-Sequenzen von beta-Tubulin dar.

Gamma-secretase modulators and inhibitors in Alzheimer's disease: influence of genetic background on efficacy and mechanism of action

According to the amyloid hypothesis, Alzheimer’s disease (AD) is caused by aberrant production or clearance of the amyloid-β (Aβ) peptides, and in particular of the longer more aggregation-prone Aβ42. The Aβ peptides are generated through successive proteolytic cleavage of the amyloid precursor protein (APP) by the β-site APP cleaving enzyme (BACE) and γ-secretase. γ-secretase produces Aβ peptides with variable C-termini ranging from Aβ34 to Aβ48, presumably by sequential trimming of longer into shorter peptides. γ-secretase is a multiprotein complex consisting of at least four different proteins and the presenilin proteins (PS1 or PS2) contain the catalytic center of the complex. In 2001 several non-steroidal anti-inflammatory drugs were identified as the founding members of a new class of γ-secretase modulators (GSMs) that can selectively reduce production of Aβ42. Concomitantly, these GSMs increase Aβ38 production indicating closely coordinated generation of Aβ42 and Aβ38 and a potential precursor-product relationship between these peptides. GSMs seem to exert their activity by direct modulation of γ-secretase. Support for this hypothesis is drawn from the finding that some PS mutations associated with early-onset familial AD (FAD) can modulate the cellular response to GSMs and to γ-secretase inhibitors (GSIs), which inhibit production of all Aβ peptides and are known to directly interact with PS. A particularly interesting FAD PS mutation is PS1-ΔExon9, a complex deletion mutant that blocks endoproteolysis of PS1 and renders cells completely non-responsive to GSMs. Studies presented in this thesis show that the diminished response of PS1-ΔExon9 to GSMs is mainly caused by its lack of endoproteolytic cleavage. Furthermore, we were able to demonstrate that a reduced response to GSMs and GSIs is not limited to PS1-ΔExon9 but is a common effect of aggressive FAD-associated PS1 mutations. Surprisingly, we also found that while the Aβ42 response to GSMs is almost completely abolished by these PS1 mutations, the accompanying Aβ38 increase was indistinguishable to wild-type PS1. Finally, the reduced response to GSIs was confirmed in a mouse model with transgenic expression of an aggressive FAD-associated PS1 mutation as a highly potent GSI failed to reduce Aβ42 levels in brain of these mice. Taken together, our findings provide clear evidence for independent generation of Aβ42 and Aβ38 peptides, and argue that the sequential cleavage model might be an oversimplification of the molecular mechanism of γ-secretase. Most importantly, our results highlight the significance of genetic background in drug discovery efforts aimed at γ-secretase, and indicate that the use of cellular models with transgenic expression of FAD-associated PS mutations might confound studies of the potency and efficacy of GSMs and GSIs. Therefore, such models should be strictly avoided in the ongoing preclinical development of these promising and potentially disease-modifying therapeutics for AD.

Charakterisierung spezieller pflanzlicher Gamma-Tubulin-Sequenzbereiche und Detektion potentieller Interaktionspartner mittels Yeast-two-Hybrid-System

Mitotische und postmitotische Vorgänge pflanzlicher Zellen basieren auf der Funktion von Mikrotubuli. Es liegen nur wenige gesicherte Erkenntnisse zur Organisation dieser Multifunktionalität vor. Eine zentrale Bedeutung wird bei der Nukleation der Mikrotubuli an MTOCs durch γ-Tubulin zugeschrieben. Deren Zusammenlagerung an MTOCs ist jedoch noch nicht richtig verstanden. Domänen, die an der Proteinoberfläche exponiert werden, könnten in Interaktionen involviert sein. Hier werden im Besonderen der γ-A und γ-B-Peptivmotiv diskutiert. Es wurde das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv des γ-Tubulins hinsichtlich einer Konservierung innerhalb des Pflanzenreiches untersucht. Die beiden Bereiche sind bei den grünen Landpflanzen stark konserviert. Sie divergieren stark zu den einzelligen Grünalgen Chlamydomonas reinhardtii und Chlorella spec. Es wurden daher in der bestehenden phylogentischen Lücke weitere Organismen hinsichtlich des γ-A und γ-B Peptidmotivs untersucht. Auswahlkriterien der Organismen waren Ein-/Mehrzelligkeit, Besitz/Abwesenheit von Centriolen und Besitz/Abwesenheit von Geißeln. Des weiteren wurde mit verschiedenen γ-Tubulin-Konstrukten um das γ-A- und γ-B-Peptidmotiv, gewonnen aus Nicotiana tabacum (BY2) mittels Y2H-System nach Interaktionspartnern gesucht. Bei den Sequenzuntersuchungen des γ-A- und γ-B-Peptidmotivs konnte festgestellt werden, dass die Konservierung innerhalb der Streptophytenlinie erfolgt. Interessant erweist sich die Tatsache, dass dieses Motiv bei den Jochalgen, welche ebenfalls den Streptophyten angehören, nur im γ-A-Peptidmotiv auftritt. Es besteht die Möglichkeit, dass die beiden potentiellen Interaktionspartner verschiedene Proteine als Interaktions-partner besitzen. Durch eine Anwendung eines auf dem GAL4-Protein basierenden Y2H-Systems mit vier unterschiedlichen Konstrukten des γ-Tubulin-A/B-Peptidbereichs als Köder-konstrukt und einer cDNA-Bibliothek als Beutekonstrukt, wurden diverse Sequenzen identifiziert. Identifiziert wurden das Poly(A)-Bindeprotein, Glycerin-aldehyd-3-phosphatdehydrogenase, die S-adenosyl-L-methionine-Synthetase, diverse Proteasom-Untereinheiten, eine sekretorische Peroxidase, eine Ascorbat-Peroxidase, die NtPOX1-Peroxidase und verschiedene Peroxidasen aus Nicotiana tabacum, Sequenzen des Chloroplastengenoms, ein Myosin-ähnliches Protein und eine Sequenz auf dem 5. Chromosom des Medicago truncatula-Klons mth2-16f8 und diverse humane Sequenzen der Proteine DKFZp68 und DKFZp77. Die Ergebnisse weisen auf eine komplexe Funktionsweise der unterschiedlichen Komponenten des pflanzlichen Cytoskeletts und des γ-Tubulins hin. Zur Aufklärung müsste dies in Zukunft mittels anderer genetischer, biochemischer oder funktioneller Methoden untersucht werden. Hypothesen über Interaktionen der Cytoskelettkomponenten können wahrscheinlich nicht allein durch die Anwendung des Y2H-Systems aufgeklärt werden.

Charakterisierung einer pflanzlichen Variante des Cytoskelettproteins gamma-Tubulin durch Strukturmodellierung, Überexpression und Analyse der Interaktionspartner

Wie alle Eukaryoten besitzen auch höhere Pflanzen ein mikrotubuläres Cytoskelett. Einige Funktionen dieses Cytoskeletts sind relativ stark konserviert, andere dagegen scheinen sehr pflanzenspezifisch zu sein. Dies betrifft insbesondere charakteristische mikrotubuläre Netzwerke, die bei der Neubildung und der Verstärkung der Zellwände wichtige Rollen übernehmen. Wie der Aufbau dieser Netzwerke kontrolliert wird, ist bisher relativ unklar. Typische Mikrotubuli organisierende Zentren (MTOC), insbesondere Centrosomen oder Spindelpolkörper, sind bei höheren Pflanzen nicht beobachtet worden. Von pilzlichen und tierischen Organismen weiß man, dass gamma-Tubulin (gTUB) mit seinen assoziierten Proteinen in den MTOC bei der Nukleation von Mikrotubuli eine Schlüsselfunktion hat. Dieses Mitglied der Tubulin-Superfamilie wird aber auch in Pflanzen gefunden, dessen genaue Funktion bisher unbekannt ist. Zu Beginn der Arbeit wurden mittels in silico Berechnungen Strukturmodelle des pflanzlichen gTUBs aus Nicotiana tabacum erarbeitet, da die Struktur, die zu einem Verständnis der pflanzlichen Wachstumsregulation beitragen könnte, bisher unbekannt ist. Auf Grundlage der bioinformatischen Daten konnte für weitere Studien eine notwendige gTUB-Deletionsmutante entwickelt werden. Für Röntgendiffraktionsstudien und gTUB-Interaktionspartneranalysen war die Verfügbarkeit verhältnismäßig großer Proteinmengen notwendig. Die Expression der gTUB-Volllängensequenz in gelöster und aktiver Form stellte einen immanent wichtigen Zwischenschritt dar. Das Escherichia coli T7/lacO-Expressionssystem lieferte, trotz vielversprechender Erfolge in der Vergangenheit, kein gelöstes rekombinantes gTUB. So wurden zwar verhältnismäßig hohe Expressionsraten erzielt, aber das rekombinante gTUB lag quantitativ als Inclusion bodies vor. Eine Variationen der Expressionsparameter sowie umfangreiche Versuche mittels verschiedenster Konstrukte sowie potentiell die Löslichkeit erhöhenden Tags gTUB in gelöster Form in E. coli zu exprimieren blieben erfolglos. Eine Denaturierung der Inclusion bodies und Rückfaltung wurde aufgrund der wohl bei der Tubulinfaltung notwendigen komplexeren Chaperone sowie thermodynamischer Überlegungen ausgeschlossen. Die höher evolvierte Chaperonausstattung war ein Hauptgrund für die Verwendung der eukaryotischen Hefe-Expressionssysteme K. lactis und des S. cerevisiae-Stammes FGY217 zur gTUB-Expression. So konnten nach der Selektion nur transgene Hefe-Zellen dokumentiert werden, die die gTUB-Expressionskassette nachweislich an der vorgesehenen Zielposition in ihrem Genom integrierten, aber keine dokumentierbare Expression zeigten. Die wahrscheinlichste Begründung hierfür ist, dass ein erhöhter intrazellulärer gTUB-Titer mit dem Zellwachstum und der Zellteilung dieser eukaryotischen Organismen interferierte und durch Rückkopplungen die rekombinante gTUB-CDS aus N. tabacum ausgeschaltet wurde. Der Versuch einer transienten gTUB-Überexpression in differenzierten Blattgeweben höherer Pflanzen war eine logische Konsequenz aus den vorherigen Ergebnissen und lieferte, wenn auch nicht die für eine Proteinkristallisation notwendigen Mengen, gelöstes gTUB. Bestrebungen einer stabilen Transfektion von A. thaliana oder BY-2-Zellkulturen mit einer gTUB-CDS lieferten keine transgenen Organismen, was starke Interferenzen der rekombinanten gTUB-CDS in den Zellen vermuten lies. Transfektionsversuche mit nur GFP tragenden Konstrukten ergaben hingegen eine hohe Anzahl an transgenen Organismen, die auch verhältnismäßig starke Expressionsraten zeigten. Die erzielten Proteinmengen bei der transienten gTUB-Überexpression in N. benthamiana Blattgeweben, in Co-Expression mit dem Posttransriptional Gene Silencing-Suppressorprotein p19, waren für einen Pull-Down sowie eine massenspektroskopische Analyse der Interaktionspartner ausreichend und ergaben Befunde. Eine abschließende Auswertung des erarbeiteten massenspektroskopischen Datensatzes wird jedoch erst dann möglich sein, wenn das Tabak-Proteom vollständig sequenziert ist. Die Erweiterung der bestehenden pflanzlichen Vergleichsdatenbanken um das bisher bekannte Tabak-Proteom vervielfachte die Anzahl der in dieser Studie identifizierten gTUB-Interaktionspartner. Interaktionen mit dem TCP1-Chaperon untermauern die Hypothese der zur Faltung pflanzlichen gTUBs notwendigen Chaperone. Beobachtete gTUB-Degradationsmuster in Verbindung mit Interaktionen des 26S-Proteasoms deuten auf eine Gegenregulationen bei erhöhtem gTUB-Titer auf Proteinebene hin. Da Blattgewebe selbst nur noch über eine sehr geringe und inhomogene Teilungsaktivität verfügen ist diese Regulation hoch spannend. Auch konnte durch Co-Expression des PTGS-Suppressorproteins p19 gezeigt werden, dass bei der gTUB-Expression eine Regulation auf RNA-Ebene erfolgt.

Generation of a NG2-EYFP mouse for studying the properties of NG2-expressing cells

A range of vectors were made in which the EYFP gene or the Cre gene were inserted in the start codon of the NG2 gene. The NG2-EYFP vectors were used to generate NG2-EYFP “knockin” mice by homologous recombination. The F1 generation showed lack of EYFP expression, due to NeoR cassette interference. Excision of the NeoR, by breeding the F1 generation to ELLA-Cre mice allowed proper expression of EYFP. NG2-EYFP heterozygous mice were characterized in detail for astrocytic, neurogenic and oligodendrocytic properties through antibody labeling. NG2-EYFP+ cells did not label for the astrocyte marker GFAP, but some cells did express S100 Beta. The cells did not label with any neuronal markers like Beta III tubulin, Neun, and double cortin, but many of the NG2-EYFP+ cells made intimate contacts to the neurons. These contacts are widespread throughout the grey and white matter of the brain. The NG2-EYFP+ cells did label for oligodendrocyte markers like PDGFα-R, NG2, Olig2, O4, and Sox 10. There were a few cells termed phantom cells that did label for NG2, but had no EYFP expression. This could have been caused by improper excision of the NeoR cassette in the F2 generation. The heterozygous mouse is a tool to allow the characterization of the in vivo properties of the NG2+ cells. Breeding of these mice to homozygosity yielded an NG2-knockout mouse, which was also subjected to initial characterization. The NG2-EYFP homozygous showed equivalent cell labeling results to the NG2-EYFP heterozygous mouse, but the phantom cells disappeared in the knockout. The results show that the NG2 cells are a heterogenous population that does not express astrocytic or neuronal markers. The homozygous mouse is an ideal tool to further dissect the properties of the cells, lacking NG2 in vivo.

Entstehung und Dynamik des Keratinfilament-Netzwerks

Das zytoplasmatische Zytoskelett besteht aus drei Filamentsystemen, die aus Aktin, Tubulin und Intermediärfilamentproteinen aufgebaut sind und dreidimensionale Netzwerke ausbilden. Das Intermediärfilamentsystem, dem vor allem mechanische Stabilisierungsfunktionen zugesprochen werden, unterscheidet sich von den anderen durch seine Fähigkeit, spontan aus seinen Polypeptiduntereinheiten ohne weitere Kofaktoren zu polymerisieren und durch seinen unpolaren Aufbau. Es ist bis heute unbekannt, wie Intermediärfilamentnetzwerke in vivo moduliert werden und wie ihre Anordnung in den Kontext des Gesamtzytoskeletts koordiniert wird. Am Beispiel der epithelialen Intermediärfilamentproteine, den Keratinen, sollte daher untersucht werden, wie und wo neue Intermediärfilamente entstehen, welche Bedeutung den anderen Filamentsystemen bei dem Netzwerkaufbau und –Turn-Over zukommen und wie die Netzwerkbildung gesteuert wird. Zur Beantwortung dieser Fragestellungen wurden Zellklone hergestellt, die fluoreszierende Keratine synthetisieren. In der Zelllinie SK8/18-2, deren gesamtes Netzwerk aus derartigen Chimären aufgebaut ist, konnten anhand von mikroskopischen Zeitrafferaufnahmen der Fluoreszenzmuster Keratinfilamentvorläufer (KFP) identifiziert und deren Dynamik direkt in lebenden Zellen verfolgt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die KFP in einem Plasmamembran-nahen Bereich entstehen, in dem sie zuerst als punktförmige Partikel detektiert werden. Nach einer initialen, sphäroidalen Wachstumsphase elongieren die Partikel zu kleinen Filamentstückchen. Diese können miteinander fusionieren und werden über ihre Enden in das periphere Netzwerk integriert. Der Wachstumsprozess ist gekoppelt an eine kontinuierliche, langsame Bewegung in Richtung auf das Zellzentrum. Diese Motilität sistiert vollständig nach pharmakologisch induziertem Abbau der Aktinfilamente. In Zeitraffer-aufnahmen kann jedoch in derartig behandelten Zellen ein wesentlich schnellerer Transport, der in verschiedene Richtungen verläuft und durch lange Ruhephasen unterbrochen wird, beobachtet werden. Dieser Modus, der gelegentlich auch in unbehandelten Zellen gefunden wurde, ist abhängig von intakten Mikrotubuli. Erst durch Zerstörung der Aktinfilamente und der Mikrotubuli erlischt die Motilität der KFPs vollständig. Bei der Suche nach Regulatoren der Keratinnetzwerkbildung wurde die p38 MAPK als zentraler Faktor identifiziert. Erstmals konnte eine direkte räumliche und zeitliche Korrelation zwischen einer spezifischen Enzymaktivität durch Nachweis der phosphorylierten p38 MAPK, der daraus folgenden Phosphorylierung eines Keratins, hier Serin 73 des Keratin 8, und der daraus resultierenden Veränderung des Netzwerkaufbaus, d. h. der Ausbildung von Keratingranula, nachgewiesen werden. Diese koordinierten Veränderungen wurden in unterschiedlichen Stresssituationen in verschiedenen Zellsystemen und in Zellen mit mutierten Keratinen beobachtet. Genetische (shRNA) und pharmakologische Manipulationen der p38 MAPK-Aktivität deuten auf einen engen kausalen Zusammenhang hin.

Differential cell type-specific transcriptional regulation of the CYP1A1 gene

Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) monooxygenase plays an important role in the metabolism of environmental pollutants such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and halogenated polycyclic aromatic hydrocarbons (HAHs). Oxidation of these compounds converts them to the metabolites that subsequently can be conjugated to hydrophilic endogenous entities e.g. glutathione. Derivates generated in this way are water soluble and can be excreted in bile or urine, which is a defense mechanism. Besides detoxification, metabolism by CYP1A1 may lead to deleterious effects since the highly reactive intermediate metabolites are able to react with DNA and thus cause mutagenic effects, as it is in the case of benzo(a) pyrene (B[a]P). CYP1A1 is normally not expressed or expressed at a very low level in the cells but it is inducible by many PAHs and HAHs e.g. by B[a]P or 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Transcriptional activation of the CYP1A1 gene is mediated by aryl hydrocarbon receptor (AHR), a basic-helix-loop-helix (bHLH) transcription factor. In the absence of a ligand AHR stays predominantly in the cytoplasm. Ligand binding causes translocation of AHR to the nuclear compartment, its heterodimerization with another bHLH protein, the aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT) and binding of the AHR/ARNT heterodimer to a DNA motif designated dioxin responsive element (DRE). This process leads to the transcriptional activation of the responsive genes containing DREs in their regulatory regions, e.g. that coding for CYP1A1. TCDD is the most potent known agonist of AHR. Since it is not metabolized by the activated enzymes, exposure to this compound leads to a persisting activation of AHR resulting in diverse toxic effects in the organism. To enlighten the molecular mechanisms that mediate the toxicity of xenobiotics like TCDD and related compounds, the AHR-dependent regulation of the CYP1A1 gene was investigated in two cell lines: human cervix carcinoma (HeLa) and mouse hepatoma (Hepa). Study of AHR activation and its consequence concerning expression of the CYP1A1 enzyme confirmed the TCDD-dependent formation of the AHR/ARNT complex on DRE leading to an increase of the CYP1A1 transcription in Hepa cells. In contrast, in HeLa cells formation of the AHR/ARNT heterodimer and binding of a protein complex containing AHR and ARNT to DRE occurred naturally in the absence of TCDD. Moreover, treatment with TCDD did not affect the AHR/ARNT dimer formation and binding of these proteins to DRE in these cells. Even though the constitutive complex on DRE exists in HeLa, transcription of the CYP1A1 gene was not increased. Furthermore, the CYP1A1 level in HeLa cells remained unchanged in the presence of TCDD suggesting repressional mechanism of the AHR complex function which may hinder the TCDD-dependent mechanisms in these cells. Similar to the native, the mouse CYP1A1-driven reporter constructs containing different regulatory elements were not inducible by TCDD in HeLa cells, which supported a presence of cell type specific trans-acting factor in HeLa cells able to repress both the native CYP1A1 and CYP1A1-driven reporter genes rather than species specific differences between CYP1A1 genes of human and rodent origin. The different regulation of the AHR-mediated transcription of CYP1A1 gene in Hepa and HeLa cells was further explored in order to elucidate two aspects of the AHR function: (I) mechanism involved in the activation of AHR in the absence of exogenous ligand and (II) factor that repress function of the exogenous ligand-independent AHR/ARNT complex. Since preliminary studies revealed that the activation of PKA causes an activation of AHR in Hepa cells in the absence of TCDD, the PKA-dependent signalling pathway was the proposed endogenous mechanism leading to the TCDD-independent activation of AHR in HeLa cells. Activation of PKA by forskolin or db-cAMP as well as inhibition of the kinase by H89 in both HeLa and Hepa cells did not lead to alterations in the AHR interaction with ARNT in the absence of TCDD and had no effect on binding of these proteins to DRE. Moreover, the modulators of PKA did not influence the CYP1A1 activity in these cells in the presence and in the absence of TCDD. Thus, an involvement of PKA in the regulation of the CYP1A1 Gen in HeLa cells was not evaluated in the course of this study. Repression of genes by transcription factors bound to their responsive elements in the absence of ligands has been described for nuclear receptors. These receptors interact with protein complex containing histone deacetylase (HDAC), enzyme responsible for the repressional effect. Thus, a participation of histone deacetylase in the transcriptional modulation of CYP1A1 gene by the constitutively DNA-bound AHR/ARNT complex was supposed. Inhibition of the HDAC activity by trichostatin A (TSA) or sodium butyrate (NaBu) led to an increase of the CYP1A1 transcription in the presence but not in the absence of TCDD in Hepa and HeLa cells. Since amount of the AHR and ARNT proteins remained unchanged upon treatment of the cells with TSA or NaBu, the transcriptional upregulation of CYP1A1 gene was not due to an increased expression of the regulatory proteins. These findings strongly suggest an involvement of HDAC in the repression of the CYP1A1 gene. Similar to the native human CYP1A1 also the mouse CYP1A1-driven reporter gene transfected into HeLa cells was repressed by histone deacetylase since the presence of TSA or NaBu led to an increase in the reporter activity. Induction of reporter gene did not require a presence of the promoter or negative regulatory regions of the CYP1A1 gene. A promoter-distal fragment containing three DREs together with surrounding sequences was sufficient to mediate the effects of the HDAC inhibitors suggesting that the AHR/ARNT binding to its specific DNA recognition site may be important for the CYP1A1 repression. Histone deacetylase is recruited to the specific genes by corepressors, proteins that bind to the transcription factors and interact with other members of the HDAC complex. Western blot analyses revealed a presence of HDAC1 and the corepressors mSin3A (mammalian homolog of yeast Sin3) and SMRT (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptor) in both cell types, while the corepressor NCoR (nuclear receptor corepressor) was expressed exclusively in HeLa cells. Thus the high inducibility of CYP1A1 in Hepa cells may be due to the absence of NCoR in these cells in contrast to the non-responsive HeLa cells, where the presence of NCoR would support repression of the gene by histone deacetylase. This hypothesis was verified in reporter gene experiments where expression constructs coding for the particular members of the HDAC complex were cotransfected in Hepa cells together with the TCDD-inducible reporter constructs containing the CYP1A1 regulatory sequences. An overexpression of NCoR however did not decrease but instead led to a slight increase of the reporter gene activity in the cells. The expected inhibition was observed solely in the case of SMRT that slightly reduced constitutive and TCDD-induced reporter gene activity. A simultaneous expression of NCoR and SMRT shown no further effects and coexpression of HDAC1 with the two corepressors did not alter this situation. Thus, additional factors that are likely involved in the repression of CYP1A1 gene by HDAC complex remained to be identified. Taking together, characterisation of an exogenous ligand independent AHR/ARNT complex on DRE in HeLa cells that repress transcription of the CYP1A1 gene creates a model system enabling investigation of endogenous processes involved in the regulation of AHR function. This study implicates HDAC-mediated repression of CYP1A1 gene that contributes to the xenobiotic-induced expression in a tissue specific manner. Elucidation of these processes gains an insight into mechanisms leading to deleterious effects of TCDD and related compounds.

Nukleation pflanzlicher Mikrotubuli: Expression relevanter Gene

Die wichtigsten Bestandteile des Cytoskeletts in pflanzlichen Zellen sind die Actinfilamente und die Mikrotubuli. Die Mikrotubuli spielen in der Organisation und der Morphogenese von pflanzlichen Zellen eine wichtige Rolle. Sie sind zusammen mit den Cellulosefibrillen an der Formgebung der Pflanzenzelle beteiligt. Sie bilden das Präprophaseband, das die Zellteilungsebene bestimmt und die Mitosespindel, die für die Trennung der Chromosomen sorgt, sowie den Phragmoplasten, der die Zellwand zwischen den Tochterzellen bildet. Weiterhin geben die Mikrotubuli durch Interaktion mit den Cellulose-Synthase-Komplexen die Richtung der Zellexpansion vor (GRANGER und CYR, 2001; LLOYD und CHAN, 2002; BASKIN, 2002). Die Mikrotubuli sind auch an der Stabilisierung der Zellform und an Transportprozessen beteiligt. Als Bestandteil der Mikrotubuli-organisierenden Zentren (MTOCs) wurde das γ-Tubulin identifiziert, das sehr wahrscheinlich an der Nukleation der Mikrotubuli beteiligt ist, indem es die Assemblierung der αβ-Tubulindimere zu Mikrotubuli einleitet. In tierischen Zellen ist durch intensive Forschung inzwischen relativ viel über die Funktion von γ-Tubulin, vor allem im Verlauf der Zellteilung bekannt, wie z. B. die Lokalisation in Centrosomen mit ihren paarweise angeordneten Centriolen, die die MTOCs darstellen. In pflanzlichen Zellen sind bisher nur wenige Funktionen des Proteins hinreichend geklärt. Die höheren Pflanzen besitzen keine Centriolen und keine Centrosomen. Über die Zellteilung hinaus gibt es kaum Anhaltspunkte über das Vorhandensein oder eventuelle Aufgaben von γ-Tubulin in expandierenden und voll expandierten Zellkulturen und Pflanzengeweben. In dieser Arbeit wurde die Expression über PCR und die Messung des Proteingehalts von cytoskelett-relevanten Proteinen in den Entwicklungsstadien der Zellsuspensionskultur (BY-2) und von Blattstadien der Tabakpflanze (SR1) von Nicotiana tabacum gemessen. Primäres Ziel war es eine Aussage zu erhalten, in welchem Ausmaß γ-Tubulin in expandierenden und voll expandierten Zellen noch exprimiert wird und ob bzw. wie eine Regulation (transkriptionell oder posttranskriptionell) des γ-Tubulins in der Pflanze stattfindet. Für den Nachweis des γ-Tubulins auf der Proteinebene wurde ein pflanzenspezifischer γ-Tubulin Antikörper zu entwickelt. Bei diesem Antikörper handelte es sich um einen polyklonalen Antikörper, der spezifisch gegen eine Sequenz in pflanzlichem γ-Tubulin gerichtet ist. Dabei zeigte der in der Arbeit entwickelte Antikörper gegen die pflanzliche JOSHI-Domäne spezifische Signale. Der erfolgte Nachweis von γ-Tubulin auf der Proteinebene und der Transkripte zeigte bis in die ältesten untersuchten Stadien der Zellsuspensionskultur (BY-2) und in Geweben der Blattstadien der Tabakpflanze (SR1) deutliche Signale für γ-Tubulin. Es war somit nicht nur in meristematisch aktiven Zellen und Geweben von Nicotiana tabacum, sondern auch in nichtmitotischen Zellen und Geweben vorhanden. Hierbei war über die Phasen der Zellteilung und der Zellformgebung hinweg auf beiden Ebenen eine parallele Entwicklung mit relativ konstanten starken Signalen zu beobachten. Nach dem Einstellen der Teilungsaktivität fiel der Gehalt an mRNA deutlich ab. Dabei nahm die Konzentration des Proteins im Vergleich zur mRNA zeitlich verzögert ab. Diese Ergebnisse bei der Zellsuspensionskultur (BY-2) und Tabakpflanze (SR1) gehen mit der möglichen Nukleationstätigkeit des Proteins konform. Es waren geringere aber doch deutlichen Signale bei Absterbenden Zellen der Zellkultur, bzw. bei expandierenden und voll expandierten und seneszenten Blättern der Tabakpflanze (SR1) nachzuweisen. Dies lässt die Folgerung zu, dass die nachgewiesene mRNA von γ-Tubulin nicht posttranskriptionell reguliert wird, sondern dass das γ-Tubulin auch eine wichtige Rolle außerhalb der Zellteilung in den postmitotischen Stadien, z. B. als organisierender Faktor bei der Umgestaltung oder Stabilisierung des Mikrotubuli-Cytoskeletts, spielt. Der γ-Tubulin-Gehalt in den Geweben der SR1-Pflanze zeigte über die Zellkultur hinaus, dass die Expression von α-Tubulin nach Einstellen der Teilungsaktivität kontinuierlich abnimmt. Dieses Ergebnis legt die Vermutung nahe, dass γ-Tubulin in älteren Blattgeweben zusätzliche Aufgaben übernehmen könnte, die nicht auf eine gleichzeitige Expression von α-Tubulin angewiesen sind. So kann beispielsweise eine Beteiligung von γ-Tubulin an der Stabilisierung der Mikrotubuli, und damit einhergehend eine Abnahme der dynamischen Instabilität dieser Filamente, eine denkbare Funktion des Proteins in expandierendem und voll expandiertem Gewebe sein. Die Aufgaben von γ-Tubulin in sehr altem Gewebe mit deutlichen Anzeichen der Seneszenz können allerdings nach dem derzeitigen Stand der Forschung nicht eindeutig beantwortet werden und bedürfen weitergehenden Untersuchungen, da dadurch ein die Komplexität und die Dynamik des pflanzlichen Cytoskeletts geklärt werden kann.

Measurement and modeling of cloud condensation nuclei in continental air

Atmospheric aerosol particles serving as cloud condensation nuclei (CCN) are key elements of the hydrological cycle and climate. Knowledge of the spatial and temporal distribution of CCN in the atmosphere is essential to understand and describe the effects of aerosols in meteorological models. In this study, CCN properties were measured in polluted and pristine air of different continental regions, and the results were parameterized for efficient prediction of CCN concentrations.The continuous-flow CCN counter used for size-resolved measurements of CCN efficiency spectra (activation curves) was calibrated with ammonium sulfate and sodium chloride aerosols for a wide range of water vapor supersaturations (S=0.068% to 1.27%). A comprehensive uncertainty analysis showed that the instrument calibration depends strongly on the applied particle generation techniques, Köhler model calculations, and water activity parameterizations (relative deviations in S up to 25%). Laboratory experiments and a comparison with other CCN instruments confirmed the high accuracy and precision of the calibration and measurement procedures developed and applied in this study.The mean CCN number concentrations (NCCN,S) observed in polluted mega-city air and biomass burning smoke (Beijing and Pearl River Delta, China) ranged from 1000 cm−3 at S=0.068% to 16 000 cm−3 at S=1.27%, which is about two orders of magnitude higher than in pristine air at remote continental sites (Swiss Alps, Amazonian rainforest). Effective average hygroscopicity parameters, κ, describing the influence of chemical composition on the CCN activity of aerosol particles were derived from the measurement data. They varied in the range of 0.3±0.2, were size-dependent, and could be parameterized as a function of organic and inorganic aerosol mass fraction. At low S (≤0.27%), substantial portions of externally mixed CCN-inactive particles with much lower hygroscopicity were observed in polluted air (fresh soot particles with κ≈0.01). Thus, the aerosol particle mixing state needs to be known for highly accurate predictions of NCCN,S. Nevertheless, the observed CCN number concentrations could be efficiently approximated using measured aerosol particle number size distributions and a simple κ-Köhler model with a single proxy for the effective average particle hygroscopicity. The relative deviations between observations and model predictions were on average less than 20% when a constant average value of κ=0.3 was used in conjunction with variable size distribution data. With a constant average size distribution, however, the deviations increased up to 100% and more. The measurement and model results demonstrate that the aerosol particle number and size are the major predictors for the variability of the CCN concentration in continental boundary layer air, followed by particle composition and hygroscopicity as relatively minor modulators. Depending on the required and applicable level of detail, the measurement results and parameterizations presented in this study can be directly implemented in detailed process models as well as in large-scale atmospheric and climate models for efficient description of the CCN activity of atmospheric aerosols.

Effects of low-density lipoprotein receptor-related protein 4 and apolipoprotein E isoforms on bone metabolism in vivo

LRP4, member of the LDLR family, is a multifunctional membrane-bound receptor that is expressed in various tissues. The expression of LRP4 by osteoblasts, its novel interaction with Wnt-signaling inhibitors Dkk1 and SOST, and the lower levels of activated beta-catenin in different bone locations described here, adds another player to the long list of established factors that modulate canonical Wnt-signaling in bone. By demonstrating that in addition to Wise, LRP4 is able to interact with two additional important modulators of Wnt- and BMP-signaling, our perspective of the complexity of the integration of BMP and Wnt-signaling pathways on the osteoblast surface has expanded further. Nevertheless the recently described association of both the SOST and LRP4 genes with BMD in humans, together with our findings suggest that LRP4 plays a physiologically important role in the skeletal development and bone metabolism not only in rodents, but in humans as well. The efficiency with which LRP4 binds both SOST and Dkk1, presumably at the osteoblastic surface, LRP4 may act as a sink and competes with LRP5/6 for the binding of these Wnt antagonists, which then are no longer available for suppression of the signal through the LRP5/6 axis. rnApoE, a 299 amino acid glycoprotein, is a crucial regulator in the uptake of triglyceride, phospholipids, cholesteryl esters, and cholesterol into cells. ApoE has been linked to osteoporosis, and such a role is further strengthened by the present of a high bone mass phenotype in ApoE null mice. Until recently, the effects of respective ApoE isoforms E2, E3, and E4, and their impact on bone metabolism, have been unclear. Here we report that respective human ApoE knockin mice display diverse effects on bone metabolism. ApoE2 mice show decreased trabecular bone volume per total volume in femoral bone and lumbar spine in comparison to ApoE3 and E4 animals. In this context, urinary bone resorption marker DPD is increased in these animals, which is accompanied by a low ratio of osteoclastogenesis markers OPG/RANKL. Interestingly, serum bone formation markers ALP and OCN are diminished in ApoE4 mice. In contrast to this finding, ApoE2 mice show the lowest bone formation of all groups in vivo. These findings cannot be explained by the low receptor-affinity of ApoE2 and subsequent decreased uptake of triglyceride-rich lipoproteins by osteoblasts, resulting in elevated levels of undercarboxylated osteocalcin. Thus, other crucial pathways relevant for bone metabolism, e. g. Wnt/beta-catenin-signaling pathways, must be, compared to the ApoE3/4 isoforms, more affected by the ApoE2 isoform.

Einfluss der Modulation von P-Glykoprotein (P-gp) auf die Verfügbarkeit und Wirksamkeit der pharmakologischen Behandlung psychiatrischer Erkrankungen im Tiermodell

P-Glykoprotein (P-gp) ist ein ATP-verbrauchender Transporter, der in Organschranken exprimiert wird, um Fremdstoffe auszuschleusen, darunter auch Psychopharmaka. Im Rahmen dieser Arbeit wurde im Tiermodell der Maus untersucht, welche pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Konsequenzen sich bei Verabreichung von Risperidon als P-gp Modellsubstrat ergeben, wenn die Expression von P-gp induziert wird. Als potenzielle Induktoren wurden Dexamethason, Rifampicin, Quercetin, 5-Pregnen-3ß-ol-20-on-16α-Carbonitril (PCN) und Acitretin geprüft. Es konnte gezeigt werden, dass alle Substanzen die Verteilung von Risperidon und seinem aktiven Metaboliten 9-Hydroxyrisperidon beeinflussten. Während sich für Quercetin und Acitretin leichte P-gp inhibitorische Eigenschaften ergaben, die an Hand von erhöhten Konzentrationen von Risperidon und 9-Hydroxyrisperidon gezeigt werden konnten, führten die bekannten P-gp Induktoren Rifampicin, Dexamethason und PCN zu verringerten Konzentrationen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Durch Western Blot Untersuchungen wurde bestätigt, dass die Induktoren die P-gp Expression im Hirngewebe tendenziell steigerten. Dies sprach dafür, dass bei Verabreichung einer Komedikation, die P-gp induziert, mit einer veränderten Verteilung von P-gp Substraten zu rechnen ist. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass durch eine Hemmung bzw. Induktion von P-gp nicht nur die Pharmakokinetik, sondern auch die Pharmakodynamik von Risperidon und 9-Hydroxyrisperidon verändert wird. Dies wurde durch verhaltenspharmakologische Untersuchungen gezeigt. Durch Risperidon induzierte motorische Effekte auf dem RotaRod waren nach Induktion von P-gp abgeschwächt. Dies zeigte sich auch für Haloperidol, welches kein Substrat ist. Da P-gp abhängige Effekte in diesem Fall keine bedeutende Rolle spielen, ist davon auszugehen, dass neben der Induktion von P-gp an der Blut-Hirn Schranke auch andere Mechanismen wie z.B. eine Induktion von Enzymen der CYP-Familie an den beobachteten Effekten beteiligt sind. Bei Untersuchungen von kognitiven Leistungen in der Barnes Maze konnte gezeigt werden, dass Haloperidol im Gegensatz zu Risperidon das Lernverhalten negativ beeinflussen kann. Eine P-gp Induktion schien jedoch keinen deutlichen Einfluss auf das Lernverhalten unter Antipsychotika-Gabe zu haben und sprach vielmehr für substanzabhängige Effekte der einzelnen Antipsychotika bzw. P-gp Modulatoren. Zusatzuntersuchungen zur Hirngängigkeit von Acitretin, einem synthetischen Retinoid, welches derzeit als potenzielles Antidementivum geprüft wird, konnten belegen, dass es die Blut-Hirn Schranke überwindet. Bereits 1h nach Injektion war Acitretin in hoher Konzentration im Gehirn nachweisbar. Durch die Analyse zur Verteilung von Acitretin in Hirngewebe und Serum von P-gp Wildtyp und P-gp doppel knockout Mäusen konnte belegt werden, dass Acitretin nicht P-gp abhängig transportiert wird. Die Daten insgesamt betrachtet, lassen den Schluss zu, dass durch Verabreichung von Medikamenten, die P-gp Modulatoren sind, bei Antipsychotika mit pharmakokinetischen Interaktionen zu rechnen ist, welche die Wirksamkeit der Medikamente einschränken können.

Identifizierung chemischer Transportinhibitoren zur Modulation (patho)biologischer Genprodukte

Die intrazelluläre Lokalisation von Proteinen und Makromolekülen unterliegt in Eukaryoten einer strengen Regulation. Insbesondere erlaubt die Kompartimentierung eukaryotischer Zellen in Zellkern und Zytoplasma den simultanen Ablauf räumlich getrennter biochemischer Reaktionen, und damit die unabhängige Regulation zellulärer Programme. Da trotz intensiver Forschungsbemühungen bis dato die molekularen Details sowie die (patho)biologische Bedeutung von Kern-Zytoplasma-Transportprozessen noch immer nicht vollkommen verstanden sind, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Fokus auf die Identifizierung von chemischen Transportinhibitoren gelegt. Das zu diesem Zweck entwickelte Translokations-Biosensor-System basiert auf der Kombination von autofluoreszierenden Proteinen, sowie spezifisch ausgewählten Kernexport- und Kernimportsignalen. Nach Etablierung geeigneter Zellmodelle, die effizient und stabil die Translokations-Biosensoren exprimieren, wurde die 17 000 Substanzen umfassende Bibliothek der ChemBioNet-Initiative nach Kernexportinhibitoren mittels einer Fluoreszenzmikroskopie-basierten Hochdurchsatzanalyse-Plattform durchmustert. Zunächst wurden Translokations-Algorithmen, welche eine zuverlässige automatisierte Erkennung von Zellkern und Zytoplasma erlauben, optimiert. Im Folgenden konnten acht neue niedermolekulare Kernexport-Inhibitoren identifiziert werden, die sich in der Stärke, der Geschwindigkeit, sowie in der Beständigkeit der vermittelten Inhibition unterscheiden. Die Aktivität der Inhibitoren konnte auf den isolierten nukleären Exportsignalen (NES) von HIV-1 Rev und Survivin als auch auf den entsprechenden Volllängeproteinen mittels Mikroinjektionsexperimenten sowie durch umfassende in vitro und biochemische Methoden bestätigt werden. Zur Untersuchung der funktionellen Einheiten der Inhibitoren wurden homologe Substanzen auf Ihre Aktivität hin getestet. Dabei konnten für die Aktivität wichtige chemische Gruppen definiert werden. Alle Substanzen stellen neue Inhibitoren des Crm1-abhängigen Exports dar und zeigen keine nachweisbare NES-Selektivität. Interessanterweise konnte jedoch eine zytotoxische und Apoptose-induzierende Wirkung auf verschiedene Krebszellarten festgestellt werden. Da diese Wirkung unabhängig vom p53-Status der Tumorzellen ist und die Inhibitoren C3 und C5 die Vitalität nicht-maligner humaner Zellen signifikant weniger beeinträchtigen, wurden diese Substanzen zum internationalen Patent angemeldet. Da der nukleäre Export besonders für Tumorzellen einen wichtigen Überlebenssignalweg darstellt, könnte dessen reversible Hemmung ausgenutzt werden, um besonders in Kombination mit gängigen Krebstherapien eine therapeutisch relevante Tumorinhibition zu erzeugen. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit der neuen Exportinhibitoren ist auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten zu sehen, da auch die Aktivität des essentiellen HIV-1 Rev-Proteins inhibiert wird. Zusätzlich konnte in der Arbeit gezeigt werden, dass der zelluläre Kofaktor des Crm1-abhängigen Exports des HIV-1 Rev-Proteins, die RNA-Helikase DDX3, ein eigenes NES enthält. Der Nachweis einer direkten Interaktion des HIV-1 Rev- mit dem DDX3-Protein impliziert, dass multiple Angriffstellen für chemische Modulatoren hinsichtlich einer antiviralen Therapie gegeben sind. Da die Vielfalt des chemischen Strukturraums es unmöglich macht diesen experimentell vollständig zu durchmustern, wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Naturstoffe als vielversprechende Wirkstoffquelle untersucht. Um zukünftig umfassend bioaktive Substanzen aus diesen hochkomplexen Stoffgemischen experimentell identifizieren zu können, wurde eine Fluoreszenzmikroskopie-basierte Hochdurchsatzanalyse-Plattform am Mainz Screening Center (MSC) etabliert. Damit konnte bereits ein weiterer, bisher unbekannter Exportinhibitor aus Cyphellopsis anomala identifiziert werden. Neben einer Anwendung dieser Substanz als chemisches Werkzeug zur Aufklärung der Regulation von Transportvorgängen, stellt sich auch die evolutionsbiologisch relevante Frage, wie es dem Pilzproduzenten gelingt die Blockierung des eigenen Kernexports zu umgehen. Weiterführende Projekte müssen sich neben der Aufklärung der molekularen Wirkmechanismen der gefundenen Substanzen mit der Identifizierung spezifischer chemischer „Funktionseinheiten“ beschäftigen. Neben einem verbesserten mechanistischen Verständnis von Transportvorgängen stellen die erarbeiteten Transportinhibitoren Vorstufen zur Weiterentwicklung möglicher Wirkstoffe dar. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierte Technologie-Plattform und molekularen Werkzeuge stellen darüber hinaus eine wichtige Voraussetzung dar, um eine systematische Suche nach möglichen Wirkstoffen im Forschungsfeld der „Chemischen Biomedizin“ voranzutreiben.

Methods and strategies to identify the mode of action of phytoactive compounds

Small molecules affecting biological processes in plants are widely used in agricultural practice as herbicides or plant growth regulators and in basic plant sciences as probes to study the physiology of plants. Most of the compounds were identified in large screens by the agrochemical industry, as phytoactive natural products and more recently, novel phytoactive compounds originated from academic research by chemical screens performed to induce specific phenotypes of interest. The aim of the present PhD thesis is to evaluate different approaches used for the identification of the primary mode of action (MoA) of a phytoactive compound. Based on the methodologies used for MoA identification, three approaches are discerned: a phenotyping approach, an approach based on a genetic screen and a biochemical screening approach.rnFour scientific publications resulting from my work are presented as examples of how a phenotyping approach can successfully be applied to describe the plant MoA of different compounds in detail.rnI. A subgroup of cyanoacrylates has been discovered as plant growth inhibitors. A set of bioassays indicated a specific effect on cell division. Cytological investigations of the cell division process in plant cell cultures, studies of microtubule assembly with green fluorescent protein marker lines in vivo and cross resistant studies with Eleusine indica plants harbouring a mutation in alpha-tubulin, led to the description of alpha-tubulin as a target site of cyanoacrylates (Tresch et al., 2005).rnII. The MoA of the herbicide flamprop-m-methyl was not known so far. The studies described in Tresch et al. (2008) indicate a primary effect on cell division. Detailed studies unravelled a specific effect on mitotic microtubule figures, causing a block in cell division. In contrast to other inhibitors of microtubule rearrangement such as dinitroanilines, flamprop-m-methyl did not influence microtubule assembly in vitro. An influence of flamprop-m-methyl on a target within the cytoskeleton signalling network could be proposed (Tresch et al., 2008).rnIII. The herbicide endothall is a protein phosphatase inhibitor structurally related to the natural product cantharidin. Bioassay studies indicated a dominant effect on dark-growing cells that was unrelated to effects observed in the light. Cytological characterisation of the microtubule cytoskeleton in corn tissue and heterotrophic tobacco cells showed a specific effect of endothall on mitotic spindle formation and ultrastructure of the nucleus in combination with a decrease of the proliferation index. The observed effects are similar to those of other protein phosphatase inhibitors such as cantharidin and the structurally different okadaic acid. Additionally, the observed effects show similarities to knock-out lines of the TON1 pathway, a protein phosphatase-regulated signalling pathway. The data presented in Tresch et al. (2011) associate endothall’s known in vitro inhibition of protein phosphatases with in vivo-effects and suggest an interaction between endothall and the TON1 pathway.rnIV. Mefluidide as a plant growth regulator induces growth retardation and a specific phenotype indicating an inhibition of fatty acid biosynthesis. A test of the cuticle functionality suggested a defect in the biosynthesis of very-long-chain fatty acids (VLCFA) or waxes. Metabolic profiling studies showed similarities with different groups of VLCFA synthesis inhibitors. Detailed analyses of VLCFA composition in tissues of duckweed (Lemna paucicostata) indicated a specific inhibition of the known herbicide target 3 ketoacyl-CoA synthase (KCS). Inhibitor studies using a yeast expression system established for plant KCS proteins verified the potency of mefluidide as an inhibitor of plant KCS enzymes. It could be shown that the strength of inhibition varied for different KCS homologues. The Arabidopsis Cer6 protein, which induces a plant growth phenotype similar to mefluidide when knocked out, was one of the most sensitive KCS enzymes (Tresch et al., 2012).rnThe findings of my own work were combined with other publications reporting a successful identification of the MoA and primary target proteins of different compounds or compound classes.rnA revised three-tier approach for the MoA identification of phytoactive compounds is proposed. The approach consists of a 1st level aiming to address compound stability, uniformity of effects in different species, general cytotoxicity and the effect on common processes like transcription and translation. Based on these findings advanced studies can be defined to start the 2nd level of MoA characterisation, either with further phenotypic characterisation, starting a genetic screen or establishing a biochemical screen. At the 3rd level, enzyme assays or protein affinity studies should show the activity of the compound on the hypothesized target and should associate the in vitro effects with the in vivo profile of the compound.

Charakterisierung der Proteine CEP164 und ppdpf sowie deren Einordnung in den mitotischen Kontext

Eine regelgerechte bipolare Mitose und die fehlerfreie Aufteilung duplizierter DNA ist die Voraussetzung für die Entwicklung aller Lebewesen. Treten Fehler bei diesem grundsätzlichen Prozess auf, ist entweder der Zelltod oder die maligne Entartung der Zelle die Folge. Daher ist es von zentraler Bedeutung, die Vorgänge während der Zellteilung zu verstehen und die Funktion der an diesem Prozess beteiligten Proteine aufzudecken. Im Vorfeld dieser Arbeit wurden im Rahmen eines siRNA-Screens genomweit alle Proteine durch RNA-Interferenz depletiert und die Mitosen nach erfolgter RNAi phänotypisch untersucht. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf der Entwicklung multipolarer Spindeln durch Defekte in der Zentrosomenbündelung. Dadurch wurden unter anderem die Proteine CEP164 und ppdpf identifiziert. Da weder für CEP164 noch für ppdpf mitotische Funktionen bekannt sind, war es Ziel dieser Arbeit, die beiden Proteine eingehender zu charakterisieren und in den Kontext der Mitose einzuordnen. rnIm Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass CEP164 einer komplexen mitotischen Regulation unterliegt. Die in Interphase durchweg zentrosomale Lokalisation von CEP164 geht in der Mitose verloren. Es wird demonstriert, dass CEP164 während der Mitose unter anderem von CDK1 phosphoryliert wird und des Weiteren ubiquitinyliert wird. Als Interaktionspartner wurde das zentrosomale Protein Ninein identifiziert und demonstriert, dass sich CEP164 mit diesem in einem Komplex von ~2MDA befindet. Als weiterer Interaktionspartner wurde das Ninein-like-Protein ermittelt. Im Hinblick auf die Induktion multipolarer Mitosen wurde gezeigt, dass die Depletion von CEP164 nicht dafür verantwortlich ist. Die Induktion multipolarer Spindeln ist stattdessen darin begründet, dass durch die Transfektion einer siRNA gegen CEP164 auch ein für die Ausbildung der mitotischen Spindel elementares Protein, Ch-TOG, depletiert wird.rnIm Gegensatz dazu wurde im Rahmen dieser Arbeit bestätigt, dass das Protein ppdpf eine wichtige mitotische Funktion übernimmt. Zwar führt die Depletion von ppdpf nur zu einer sehr geringen Zunahme multipolarer Mitosen, allerdings steigt die Zahl aberranter Mitosen deutlich an, während die Spannung innerhalb mitotischer Spindeln abnimmt. Desweiteren konnte nachgewiesen werde, dass ppdpf-RNAi die Entwicklung von „lagging chromosomes“ und nachfolgend von Mikrokernen begünstigt. Es wurde gezeigt, dass ppdpf während der Mitose an Spindelmikrotubuli lokalisiert und spezifisch acetyliertes Tubulin bindet. Diese Interaktion hatte allerdings keinen Einfluss auf die Stabilität von Mikrotubuli während der Mitose. Das Protein ppdpf interagiert zudem mit dem Kinesin Eg5, wobei ppdpf-RNAi allerdings nicht zu einer Modulation der Aktivität von Eg5 zu führen scheint. Inwiefern diese Eigenschaften die Entwicklung von „lagging chromosomes“ begünstigen ist derzeit noch offen.

In vitro modulation of epileptiform activity in the hippocampal formation of immature rodents by GABAergic antagonists, dopamine and methylxanthines

Während des frühen Lebens stellen epileptische Anfälle schwere neurologische Zustände dar, weil sie ein großer Risikofaktor für die Manifestation der Epilepsie sind und eine hohe pharmakologische Resistenz zeigen. In meiner Doktorarbeit konzentrierte ich mich auf die Frage, wie verschiedene Neurotransmitter-Systeme und klinisch verwendete Medikamente epileptiforme Entladungen im perinatalen Hippocampus beeinflussen. rnIm ersten Teil meines Projektes untersuchte ich die Wirkung von GABA-Antagonisten und Modulatoren, die zwischen phasischen und tonischen GABAergen Strömen differenzieren, auf Feldpotentialaktivität in Hippocampusschnitten. Diese Experimente zeigten, dass im unreifen Hippocampus synaptische GABAerge Aktivität benötigt wird, um die Erregbarkeit zu begrenzen, während tonische GABAerge Ströme die Erregbarkeit verstärken können. Dies könnte darauf hinweisen, dass Antiepileptika mit einer höheren Spezifität für synaptische GABAA-Rezeptoren wirksamer zur Behandlung von epileptischen Anfällen bei Neugeborenen sein können. rnUm den Einfluss von Dopamin auf die Erregbarkeit des unreifen Hippocampus herauszufinden, untersuchte ich im zweiten Teil meiner Arbeit die Wirkung von verschiedenen Dopaminkonzentrationen und spezifische Agonisten und Antagonisten der Dopamin-Rezeptor-Subtypen auf epileptiforme Entladungen. Diese Experimente zeigten, dass niedrige Dopamin Konzentrationen eine antikonvulsive Wirkung haben, welche vom D2-ähnliche-Rezeptor-Agonisten Quinpirol nachgeahmt werden kann, während höhere Dopamin-Konzentrationen eine prokonvulsive Wirkung über Aktivierung von D1-ähnlichen Rezeptoren hervorrufen. Obwohl unsere Untersuchungen eine mögliche Verwendung von D2-ähnlichen Rezeptor-Agonisten zur Kontrolle epileptischer Anfälle in Neugeborenen nahelegen, müssen mögliche negative Auswirkungen von DAergen Agonisten und Antagonisten auf die neuronale Entwicklung berücksichtigt werden.rnIm dritten Teil meiner Arbeit untersuchte ich welche Konzentrationen von Methylxanthinen epileptische Anfälle in Hippocampuspreparationen auslösen die synaptische Übertragungen verändern können. Diese Experimente zeigten, dass sowohl Theophyllin als auch Koffein in höheren Konzentrationen die basale synaptische Übertragungen in der CA1-Region des Hippocampus modifizieren und epileptiforme Entladungen provozieren. Die Auswirkungen auf die postsynaptischen Antworten und spontanen epileptiformen Entladungen durch Koffein waren weniger ausgeprägt, was darauf hindeutet, dass diese Substanz potentiell vorteilhafter für therapeutische Anwendungen bei Frühgeborenen sein kann. rnZusammenfassend bereichern die Ergebnisse meiner Studie erheblich unser Wissen über die zugrunde liegenden Mechanismen epileptiformer Aktivität im unreifen Hippocampus und den therapeutischen Einsatz von Methylxanthinen und Pharmaka, die auf das GABAerge und DArge System einwirken.rnrn