Strukturelle und molekulare Charakterisierung des Asialoglykoprotein-Rezeptors aus humaner Leber

Der Asialoglykoprotein-Rezeptor (ASGPR) vermittelt als integraler Bestandteil der Leberzellmembran die Endozytose von zirkulierenden Asialoglykoproteinen. Ziele dieser Arbeit waren proteinchemische Untersuchungen von funktionellem ASGPR aus humaner Leber aufgrund einer verbesserten Präparationsmethode und die rekombinante Darstellung der beiden Untereinheiten H1 und H2. In der denaturierenden SDS-PAGE erschienen H1 und H2 überwiegend als Monomere bei 46 und 50kD; nach Deglykosylierung ergaben sich Banden bei 34 und 32kD, wonach der Glykosidanteil etwa 28% beträgt. In der nicht-denaturierenden Größenausschluß-Chromatographie wurden im nativen ASGPR ausschließlich Trimere und Dimere gefunden. In Gegenwart von 2-Mercaptoethanol konnten funktionell eine aktive von einer nicht-aktiven Fraktion getrennt werden, wobei H2 in der nicht-aktiven Fraktion angereichert war, während sich H1 zu etwa gleichen Teilen in beiden Fraktionen befand. Durch zweidimensionale Auftrennung des deglykosylierten Rezeptors wurden auf Proteinebene vier Isoformen von H1 und zwei von H2 mit unterschiedlichen pI-Werten identifiziert. Der Vergleich von funktionellem ASGPR aus normaler Leber und den hepatischen Tumorzellinien HepG2 und Huh7 in der SDS-PAGE brachte Größenunterschiede von etwa sechs und vier Kilodalton hervor. Bei H1 konnte dies auf einen höheren Glykosylierungsgrad zurückgeführt werden, während H2 auch nach Behandlung mit N-GlykosidaseF ein größeres Molekulargewicht aufwies. Ein Antikörper gegen das Insertionspeptid im cytoplasmatischen Bereich einer Splice-Variante von H2 zeigte eine deutlich erhöhte Expression von H2 mit Insertion in Huh7-Zellen gegenüber natürlichem ASGPR. Da bisherige Kenntnisse über den humanen ASGPR vorwiegend aus kultivierten Hepatomzelllinien stammen, scheinen sie nicht ohne weiteres auf die Situation in normaler Leber übertragbar. Die Präparation von funktionellem H1 aus transfizierten cos7- und 293-Zellen führte zum gleichen Bandenmuster wie beim natürlichen ASGPR. Mit einem Enzymimmunoassay wurde die Eignung von rekombinantem H1 zur Detektion von Antikörpern gegen ASGPR in 177 von 178 Patientenseren gezeigt. Da durch Präinkubation mit rekombinantem Antigen die Reaktivität mit natürlichem Rezeptor inhibiert werden konnte, trägt H1 hauptsächlich die antigenen Stellen des ASGPR.

Development of a highly potent bispecific antibody format targeting the novel tumor-specific antigen CLDN18.2

Due to multiple immune evasion mechanisms of cancer cells, novel therapy approaches are required to overcome the limitations of existing immunotherapies. Bispecific antibodies are potent anti-cancer drugs, which redirect effector T cells for specific tumor cell lysis, thus enabling the patient’s immune system to fight cancer cells. The antibody format used in this proof of concept study–bispecific ideal monoclonal antibodies termed BiMAB–is a tailor-made recombinant protein, which consists of two fused scFv antibodies recognizing different antigens. Both are arranged in tandem on a single peptide chain and the individual variable binding domains are separated by special non-immunogenic linkers. The format is comprised of a scFv targeting CLDN18.2–a gastric cancer tumor associated antigen (TAA) –while the second specificity binds the CD3 epsilon (CD3ε) subunit of the T cell receptor (TCR) on T cells. For the first time, we compared in our IMAB362-based BiMAB setting, four different anti-CD3-scFvs, respectively derived from the mAbs TR66, CLB-T3, as well as the humanized and the murine variant of UCHT1. In addition, we investigated the impact of an N- versus a C-terminal location of the IMAB362-derived scFv and the anti-CD3-scFvs. Thus, nine CLDN18.2 specific BiMAB proteins were generated, of which all showed a remarkably high cytotoxicity towards CLDN18.2-positive tumor cells. Because of its promising effectiveness, 1BiMAB emerged as the BiMAB prototype. The selectivity of 1BiMAB for its TAA and CD3ε, with affinities in the nanomolar range, has been confirmed by in vitro assays. Its dual binding depends on the design of an N-terminally positioned IMAB362 scFv and the consecutive C-terminally positioned TR66 scFv. 1BiMAB provoked a concentration and target cell dependent T cell activation, proliferation, and upregulation of the cytolytic protein Granzyme B, as well as the consequent elimination of target cells. Our results demonstrate that 1BiMAB is able to activate T cells independent of elements that are usually involved in the T cell recognition program, like antigen presentation, MHC restriction, and co-stimulatory effector molecules. In the first in vivo studies using a subcutaneous xenogeneic tumor mouse model in immune incompetent NSG mice, we could prove a significant therapeutic effect of 1BiMAB with partial or complete tumor elimination. The initial in vitro RIBOMAB experiments correspondingly showed encouraging results. The electroporation of 1BiMAB IVT-RNA into target or effector cells was feasible, while the functionality of translated 1BiMAB was proven by induced T cell activation and target cell lysis. Accordingly, we could show that the in vitro RIBOMAB approach was applicable for all nine BiMABs, which proves the RIBOMAB concept. Thus, the CLDN18.2-BiMAB strategy offers great potential for the treatment of cancer. In the future, administered either as protein or as IVT-RNA, the BiMAB format will contribute towards finding solutions to raise and sustain tumor-specific cellular responses elicited by engaged and activated endogenous T cells. This will potentially enable us to overcome immune evasion mechanisms of tumor cells, consequently supporting current solid gastric cancer therapies.

Charakterisierung von T-Zell-Antworten gegen humane Nierenzellkarzinome sowie Identifizierung von HLA-G als tumorassoziiertes Antigen und Immunevasionsmechanismus des Nierenzellkarzinoms

Humane Nierenzellkarzinom-(NZK)-Zelllinien wurden etabliert, um sie zur Generierung von autologen zytotoxischen T-Zelllinien einzusetzen. Erst nach Modifikation mit dem kostimulierenden B7-1-Molekül wurden mit der NZK-Zelllinie MZ1257RC autologe, tumorspezifische T-Zelllinien generiert und charakterisiert. Die Aufklärung eines T-Zell-definierten TAA eines autologen, zytotoxischen T Zellklons wurde mittels Expressionsklonierung einer hergestellten cDNS-Expressionsbank begonnen. Nach in vitro-Sensibilisierung von peripheren Blutmonozyten mit der autologen NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde die HLA-Klasse I-restringierte T Zelllinie XIE6 generiert, die die autologe und verschiedene allogene NZK- sowie Zervixkarzinom-Zelllinien, jedoch nicht autologe Nierenzellen lysiert. Die T Zellen exprimieren TZR Vβ13.6-Ketten und sezernieren GM-CSF und IL-10 nach Antigenstimulation. Jedoch ist die NZK-Zelllinie MZ2733RC wenig sensitiv gegenüber autologen und allogenen Effektorzellen. Erst die Blockade ihrer HLA Klasse I-Moleküle auf der Zelloberfläche erhöht ihre Sensitivität gegenüber allogenen lymphokin-aktivierten Killer-Zellen. Verantwortlich dafür können nicht-klassische HLA Klasse Ib-Moleküle, insbesondere HLA-G sein, dessen Transkripte in der RNS der NZK-Zellen, jedoch nicht in Nierenzellen detektiert wurden. In einer detaillierten Studie wurden HLA-G-Transkripte in NZK-Zelllinien (58%), in NZK-Biopsien (80%), und nur in wenigen Nierenepithelbiopsien (10%) nachgewiesen. In der NZK-Zelllinie MZ2733RC wurde eine konstitutive HLA-G1-Proteinexpression beobachtet, die durch eine IFN-γ-Behandlung induzierbar ist.

Recombinant expression of molluscan hemocyanin (KLH) substructures in a prokaryotic system: E. coli

The recombinant expression of 19 different substructures of KLH in the prokaryotic sys-tem E. coli has been successfully achieved: each one of the eight single FUs a to h of both isoforms, KLH1 and KLH2, two substructures consisting of two consecutive FUs (KLH1-bc and KLH1-gh) as well as a cDNA encompassing KLH1-abc. All recombinant proteins, fused to an N-terminal 6xHis tag, have successfully been detected by immuno precipitation using monoclonal α-His-antibodies and polyclonal α-KLH1- and α-KLH2-antibodies. One exception remained: SP-KLH2-a, which was not detected by the α-His-antibodies. This allows speculations as to whether the coexpressed signal peptide can lead, at one hand, to the secretion of the recombinant protein, and on the other to the simultaneous cut-off of the leader peptide, which results in the splitting off of even more N-terminal 6xHis tag, leading to failed recognition by the appropriate antibodies. The comparison of native KLH with recombinantly expressed prokaryotic (E. coli) and eukaryotic (Sf9 insect cells) KLH was done using FU-1h. The weak detection by the polyclonal α-KLH1-antibodies of both recombinantly expressed proteins showed that the native protein was the best recognized. For the prokaryotic one, both the denaturation applied for solubilisation of the bacterial inclusion bodies and the inability of bacterial cells to add N-linked glycosylation, are the reason for the poor hybridization. In contrast, KLH1-h expressed in eukaryotic insect cells is likely to be glycosylated. The incubation with the α-KLH1-antibodies resulting in the same weak detection, however, revealed that the linked carbohydrate side chains are not those expected. The establishment of SOE-PCR, together with further improvement, has enabled the generation of a clone encompassing the complete subunit KLH1-abcdefgh. The se-quence analysis compared to the original KLH1 sequence showed, however, that the resulting recombinant protein is defective in two histidines, required for the copper bind-ing sites in FU-1b and FU-1d and in three disulfide bridges (FU-1a, FU-1b and FU 1g). This is due to polymerase-related nucleotide exchanges, resulting in a changed amino acid sequence. Nevertheless, all eight potential N-glycosylation sites are present, leading to the speculation that the recombinant protein can in theory be fully glycosylated, which is the most important aspect for the clinical applicability of recombinant KLH as an im-munotherapeutic agent. The improvement of this method elaborated during the present work indicates bright prospects for the future generation of a correct cDNA sequence encoding for the complete KLH2 subunit.

RNA-basierte Impfstoffe zur Induktion optimaler Immunantworten

Antigen-kodierende RNA wird als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptid-, Protein-, rekombinanten viralen oder DNA basierten Impfstoffen betrachtet. Der endgültige klinische Nutzen RNA-basierter Impfstoffe wird von der Optimierung verschiedener Parameter abhängig sein, die zur Induktion und effizienten Expansion der humoralen und zellvermittelten Immunantwort beitragen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Etablierung pharmakologischer und immunologischer Parameter für die Generierung effektiver Immunantworten durch RNA-Impfstoffe sowie deren Wirksamkeit in vitro und im Mausmodell unter Nutzung von Modellantigenen zu testen. Zur Untersuchung und Optimierung der RNA-Pharmakokinetik, als einem Schlüsselaspekt der klinischen Medikamentenentwicklung, wurde der Einfluss von strukturellen Modifikationen auf die Transkriptstabilität und Translationseffizienz von Reporter-Proteinen in einer zeitabhängigen Kinetik evaluiert. Es wurde gezeigt, dass ein poly(A) Schwanz von 120 Adenosinen, verglichen mit einem kürzeren, ein freies 3´ poly(A) Ende, verglichen mit einem verdeckten und eine doppelte β-globin 3´ UTR, unabhängig voneinander zu einer Erhöhung der IVT-RNA Stabilität und zu einer Verbesserung der Translationseffizienz beitrugen und dadurch insgesamt zu einer erhöhten Proteinexpression führten. Antigen-kodierende IVT-RNA mit diesen molekularen Merkmalen in Kombination führte, im Vergleich zur Standard IVT-RNA, zu einer erhöhten Dichte und Stabilität von Peptid/MHC-Komplexen auf der Zelloberfläche transfizierter DCs und dadurch zu einer verbesserten Stimulation von CD4+ und CD8+ T-Zellen im murinen und humanen System. Mit dem Ziel, die RNA kodierte Antigenform für die Induktion einer verstärkten Antikörperantwort zu modifizieren, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein Antigen-IgM Fusionskonstrukt hergestellt und hinsichtlich seiner Eignung als neues Impfstoff-Format untersucht. Die Ausgangshypothese, dass die RNA kodierten Antigen-IgM Fusionsproteine polymerisieren, von transfizierten Zellen sezerniert werden und aufgrund der repetitiven Antigenstruktur im Vergleich mit dem monomeren Antigen zu einer Verstärkung der Antikörperantwort führen, wurde in vitro und in vivo im Mausmodell bestätigt. Die Entwicklung und Evaluierung von Zytokinfusionsproteinen zur selektiven Verstärkung der antigenspezifischen Immunantworten bildeten den dritten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Zur weiteren Verstärkung der Antikörperantwort wurde basierend auf den Resultaten aus dem zweiten Teil ein IL2-IgM Fusionskonstrukt hergestellt. Die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2-IgM kodierender IVT-RNA führte zu einer signifikant stärkeren Antikörperantwort als die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2. Für die Initiierung einer erfolgreichen anti-Tumor-Immunantwort ist das Priming antigenspezifischer T-Zellen essentiell. Um die Effizienz dieses Prozesses zu steigern, wurde ein bifunktionelles IL2-mCD40L Fusionskonstrukt hergestellt und sein Einfluss auf die Effektorfunktion von DCs in vitro und in vivo untersucht. Es wurde gezeigt, dass ein RNA kodiertes IL2-mCD40L Fusionsprotein als genetisches Adjuvanz zu einer Effizienzsteigerung des Priming zytotoxischer T-Zellen führt. Somit wurden in dieser Arbeit durch die Optimierung der Pharmakokinetik, die Modifikation der Antigenform und die Herstellung und Evaluierung von Zytokinfusionskonstrukten als genetische Adjuvantien, RNA-basierte Impfstoffe für eine optimierte Induktion von antigenspezifischen Immunantworten weiter verbessert.

Analysis of the influence of epitope flanking regions on MHC class I restricted antigen presentation

Peptides presented by MHC class I molecules for CTL recognition are derived mainly from cytosolic proteins. For antigen presentation on the cell surface, epitopes require correct processing by cytosolic and ER proteases, efficient TAP transport and MHC class I binding affinity. The efficiency of epitope generation depends not only on the epitope itself, but also on its flanking regions. In this project, the influence of the C-terminal region of the model epitope SIINFEKL (S8L) from chicken ovalbumin (aa 257-264) on antigen processing has been investigated. S8L is a well characterized epitope presented on the murine MHC class I molecule, H-2Kb. The Flp-In 293Kb cell line was transfected with different constructs each enabling the expression of the S8L sequence with different defined C-terminal flanking regions. The constructs differed at the two first C-terminal positions after the S8L epitope, so called P1’ and P2’. At these sites, all 20 amino acids were exchanged consecutively and tested for their influence on H-2Kb/S8L presentation on the cell surface of the Flp-In 293Kb cells. The detection of this complex was performed by immunostaining and flow cytometry. The prevailing assumption is that proteasomal cleavages are exclusively responsible for the generation of the final C-termini of CTL epitopes. Nevertheless, recent publications showed that TPPII (tripeptidyl peptidase II) is required for the generation of the correct C-terminus of the HLA-A3-restricted HIV epitope Nef(73-82). With this background, the dependence of the S8L generation on proteasomal cleavage of the designed constructs was characterized using proteasomal inhibitors. The results obtained indicate that it is crucial for proteasomal cleavage, which amino acid is flanking the C-terminus of an epitope. Furthermore, partially proteasome independent S8L generation from specific S8L-precursor peptides was observed. Hence, the possibility of other existing endo- or carboxy-peptidases in the cytosol that could be involved in the correct trimming of the C-terminus of antigenic peptides for MHC class I presentation was investigated, performing specific knockdowns and using inhibitors against the target peptidases. In parallel, a purification strategy to identify the novel peptidase was established. The purified peaks showing an endopeptidase activity were further analyzed by mass spectrometry and some potential peptidases (like e.g. Lon) were identified, which have to be further characterized.

Antigen-dependent induction of a CD40 signal in peripheral B cells

Monoclonal antibodies have emerged as one of the most promising therapeutics in oncology over the last decades. The generation of fully human tumorantigen-specific antibodies suitable for anti-tumor therapy is laborious and difficult to achieve. Autoreactive B cells expressing those antibodies are detectable in cancer patients and represent a suitable source for human antibodies. However, the isolation and cultivation of this cell type is challenging. A novel method was established to identify antigen-specific B cells. The method is based on the conversion of the antigen independent CD40 signal into an antigen-specific one. For that, the artificial fusion proteins ABCos1 and ABCos2 (Antigen-specific B cell co-stimulator) were generated, which consist of an extracellular association-domain derived from the constant region of the human immunoglobulin (Ig) G1, a transmembrane fragment and an intracellular signal transducer domain derived of the cytoplasmic domain of the human CD40 receptor. By the association with endogenous Ig molecules the heterodimeric complex allows the antigen-specific stimulation of both the BCR and CD40. In this work the ability of the ABCos constructs to associate with endogenous IgG molecules was shown. Moreover, crosslinking of ABCos stimulates the activation of NF-κB in HEK293-lucNifty and induces proliferation in B cells. The stimulation of ABCos in transfected B cells results in an activation pattern different from that induced by the conventional CD40 signal. ABCos activated B cells show a mainly IgG isotype specific activation of memory B cells and are characterized by high proliferation and the differentiation into plasma cells. To validate the approach a model system was conducted: B cells were transfected with IVT-RNA encoding for anti-Plac1 B cell receptor (antigen-specific BCR), ABCos or both. The stimulation with the BCR specific Plac1 peptide induces proliferation only in the cotransfected B cell population. Moreover, we tested the method in human IgG+ memory B cells from CMV infected blood donors, in which the stimulation of ABCos transfected B cells with a CMV peptide induces antigen-specific expansion. These findings show that challenging ABCos transfected B cells with a specific antigen results in the activation and expansion of antigen-specific B cells and not only allows the identification but also cultivation of these B cells. The described method will help to identify antigen-specific B cells and can be used to characterize (tumor) autoantigen-specific B cells and allows the generation of fully human antibodies that can be used as diagnostic tool as well as in cancer therapy.

Die Isolierung und Aufreinigung der Metalloendopeptidase LysN und die Evaluierung der Spezifität der LysN E157D-Mutante und ihr Einsatz in der Proteomik und die Mechanismen der Bildung von “dendritic cell aggresome- like induced structures“ (DALIS)

Der proteolytische Verdau von Proteinen in Peptide ist ein wichtiger Schritt in der Tandem-Massenspektrometrie. Dabei werden Peptide fragmentiert und die sich ergebenden Fragmentionen geben Aufschluss über die Aminosäuresequenz des zu untersuchenden Proteins. Dabei sind für die Fragmentierung sowohl Länge und Sequenz, als auch der Ladungszustand des Peptids ungemein wichtig. Diese Parameter bedingen sich durch Endoproteasen, die für den proteolytischen Verdau eingesetzt werden. Eine Voraussetzung hierfür ist die Spezifität der Protease. Trypsin ist bei weitem die gebräuchlichste Protease zur massenspektrometrischen Probenvorbereitung. Allerdings bietet Trypsin keine Komplettlösung. Je nach Fragestellung und Applikation müssen weitere Proteasen eingesetzt werden, um eine komplette Sequenzabdeckung zu gewährleisten und möglichst alle posttranslationalen Modifikationen nachzuweisen, oder bestimmte Proteomklassen (z.B Phosphoproteom

Towards antibody-mediated targeting of dendritic cells for cancer immunotherapy with multivalent polymer-antigen conjugates

Der Fokus dieser Arbeit lag auf der definierten Synthese multifunktioneller Polymer-Konjugate zur Anwendung in der Krebs-Immunotherapie. Durch gezielte Variation der Kon-jugationsbedingungen wurde Zusammensetzung, Größe und Aggregationsverhalten in Zell-medium sowie in humanem Serum untersucht. Nach definierter physikalisch-chemischer Charakterisierung wurde dann die induzierte Antigen-Präsentation zur Aktivierung der T-Zellproliferation analysiert.rnDafür wurden zwei verschiedene polymere Carrier-Systeme gewählt, lineares Poly-L-lysin und eine Polylysinbürste (PLL-Bürste). Es wird vermutet, dass die PLL-Bürste aufgrund der anisotropen Form eine bessere Verteilung im Körper und eine verlängerte Zirkulationsdauer zeigen wird. Die zu konjugierenden biologisch aktiven Komponenten waren der antiDEC205-Antikörper (aDEC205) für die gezielte Adressierung CD8-positiver dendritischer Zellen (DC), ein Ovalbumin (OVA)-spezifisches Antigen mit der Kernsequenz SIINFEKL für die Spezifität der Immunantwort gegen Krebszellen, die dieses Antigen tragen, und ein immunaktivieren-der TLR9-Ligand, CpG1826. Die Effizienz dieses Konjugates dendritische Zellen zu aktivieren, welche wiederum eine Immunantwort gegen OVA-exprimierende Krebszellen induzieren, wurde durch die Konjugation aller Komponenten am identischen Trägermolekül deutlich höher erwartet.rnLineares Poly-L-lysin diente als Modellsystem um die Konjugationschemie zu etablieren und dann auf die zylindrische Polylysinbürste zu übertragen. Anhand dieser polymeren Träger wurde das Verhalten der verschiedenen Topologien des Knäuels und der Bürste im Hinblick auf den Einfluss struktureller Unterschiede sowohl auf Konjugationsreaktionen als auch auf das in situ und in vitro Verhalten untersucht.rnFluoreszenzmarkiertes Antigen und der CpG Aktivator konnten jeweils aufgrund einer Thiol-Modifizierung an die Thiol-reaktive Maleimidgruppe des heterobifunktionellen Linkers Sulfo-SMCC an PLL-AlexaFluor48 konjugiert werden. Anschließend wurde aDEC205-AlexaFluor647 an PLL gekoppelt, entweder durch Schiff Base-Reaktion des oxidierten Antikörpers mit PLL und anschließender Reduzierung oder durch Click-Reaktion des PEG-Azids modifizierten An-tikörpers mit Dicyclobenzylcyclooctin (DIBO)-funktionalisiertem PLL. Die Konjugation der biologisch aktiven Komponenten wurde mit Durchflusszytometrie (FACS) und konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) untersucht und die Zusammensetzung des Konjugatesrnmittels UV/Vis-Spektroskopie bestimmt. Die PLL-Bürste alleine zeigte eine hohe Zytotoxizität bei HeLa und JAWS II Zelllinien, wohingegen lineares PLL und PLL-Konjugate sowie die PLL Bürsten-Konjugate keine ausgeprägte Zytotoxizität aufwiesen. Die Polymer-Konjugate wie-sen keine Aggregation in Zellmedium oder humanem Serum auf, was mittels winkelabhängi-ger dynamischer Lichtstreuung bestimmt wurde. CLSM Aufnahmen zeigten Kolokalisation der an die einzelnen Komponenten gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe in dendritischen Zel-len, was die erfolgreiche Konjugation und Internalisierung der Konjugate in die Zellen bele-gen konnte. FACS Messungen ergaben eine geringfügig erhöhte Aufnahme des adressierten PLL-Antigen-Antikörper-Konjugates verglichen mit dem PLL-Antigen-Konjugat. Experimente mit dem „Specific Hybridization Internalization Sensor“ (SHIP) zeigten jedoch nur Aufnahme der PLL-Konjugate in CD8+ unreife DC, nicht in reife DC, die nicht mehr unspezifisch, sondern nur noch über Rezeptoren internalisieren. Dies bewies die unspezifische Aufnahme des Kon-jugates, da Antikörper-Konjugation keine Rezeptor-vermittelte Endozytose in reife DC indu-zieren konnte. T-Zell-Proliferationsassays ergaben eine Aktivierung von CD8+ T-Zellen indu-ziert durch Antigen-tragende Konjugate, wohingegen Konjugate ohne Antigen als Negativ-kontrollen dienten und keine T-Zell-Proliferation erzielten. Es konnte jedoch kein Unter-schied zwischen adressierten und nicht adressierten Konjugaten aufgrund der unspezifischen Aufnahme durch das Polymer beobachtet werden. Lösliches SIINFEKL alleine bewirkte schon bei geringeren Konzentrationen eine T-Zell-Proliferation.rnEs war somit möglich, drei biologischen Komponenten an einen polymeren Träger zu konju-gieren und diese Konjugate im Hinblick auf Zusammensetzung, Größe, Internalisierung in dendritische Zellen und Aktivierung der T-Zell-Proliferation zu untersuchen. Außerdem wur-de die Konjugationschemie erfolgreich von dem Modellsystem des linearen PLL auf die PLL-Bürste übertragen. Die Polymer-Konjugate werde unspezifisch in DC aufgenommen und in-duzieren T-Zellproliferation, die mit Antigen-Präsentationsassays nachgewiesen wird. Es konnte jedoch durch Konjugation des Antikörpers keine Rezeptor-vermittelte Aufnahme in CD8+ DC erzielt werden.rnDiese Studien stellen einen erfolgsversprechenden ersten Schritt zur Entwicklung neuer Na-nomaterialien für die Anwendung in Krebs-Immuntherapie dar.

Mechanismen der Antigenpräsentation bei der Induktion der CD8-T-Zellantwort gegen das murine Cytomegalovirus

Die Kontrolle der Cytomegalovirus(CMV)-Infektion durch CD8 T-Zellen ist abhängig von der effizienten MHC-Klasse-I-Präsentation viraler Peptide auf der Zelloberfläche. Um die Erkennung infizierter Zellen zu unterdrücken, interferieren während der Early (E)-Phase der murinen CMV (mCMV)-Infektion virale Immunevasine mit dem intrazellulären Transport von Peptid-MHC-I (pMHC-I) Komplexen. Den Immunevasinen gelingt es allerdings nicht, ein Priming mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen zu verhindern. Daher wurde angenommen, dass die Initiation der antiviralen CD8 T-Zellantwort primär auf der Cross-Präsentation viraler Peptide auf nicht-infizierten, professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (profAPC) beruht und damit unabhängig von viralen Immunevasionsmechanismen ist.rnIm Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mittels BAC-Mutagenese eine mCMV-Rekombinante generiert, um die direkte Präsentation viraler Peptide durch die zusätzliche Expression des zentralen Immunevasins m152 bereits in der Immediate Early (IE)-Phase verstärkt zu unterdrücken. Wie erwartet reduzierte die verstärkte m152-Expression sowohl in der IE- als auch in der E-Phase die pMHC-I-Präsentation in vitro. Dies führte überraschenderweise nach Infektion immunkompetenter BALB/c-Mäuse (Haplotyp H-2d) zu einer verminderten CD8 T-Zellantwort und damit zur Verschlechterung der Kontrolle der Infektion im drainierenden Lymphknoten. Diese Beobachtungen weisen erstmals auf einen wichtigen Beitrag der direkten Antigenpräsentation bei der Initiation der mCMV-spezifischen CD8 T-Zellantwort im immunkompetenten Wirt hin. Zusätzlich konnte auch nach mCMV-Infektion von Cross-Präsentations-defizienten Mäusen (Haplotyp H-2b) eine antivirale CD8 T-Zellantwort initiiert werden. Diese Beobachtung bestätigt, dass durch direkte Antigenpräsentation auf infizierten profAPC trotz viraler Immunevasionsmechanismen eine CD8 T-Zellantwort induziert werden kann. Allerdings wurde weder die antivirale CD8 T-Zellantwort noch die Kontrolle der Infektion im Haplotyp H-2b durch die verstärkte m152-Expression moduliert.rnIn einem weiteren Teil der Arbeit konnte im klinisch relevanten Modellsystem der mCMV-Infektion von Knochenmarktransplantations (KMT)-Rezipienten (Haplotyp H-2d) gezeigt werden, dass die verstärkte m152-Expression die Rekrutierung IE1-spezifischer CD8 T-Zellen in die infizierte Lunge unterdrückt. Dies konnte sowohl früh nach Infektion, als auch während der viralen Latenz nachgewiesen werden. Zusätzlich war die Rekrutierung IE1-spezifischer CD8 T-Zellen in die Lunge deutlich vermindert in Ld--Rezipienten von Ld+-hämatopoetischen Zellen, die das IE1-präsentierende MHC-I-Molekül Ld nicht auf den nicht-hämatopoetischen Gewebszellen exprimieren. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Rekrutierung antiviraler CD8 T-Zellen in ein peripheres Organ von der direkten Antigenpräsentation auf nicht-hämatopoetischen, infizierten Gewebszellen bestimmt wird.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, dass trotz viraler Immunevasionsmechanismen nach mCMV-Infektion des immunkompetenten Wirtes und des KMT-Rezipienten die antivirale CD8 T-Zellantwort von der direkten Antigenpräsentation bestimmt wird.

Molekulare Grundlagen der Immunkontrolle des murinen Cytomegalovirus in Gegenwart viruskodierter Immunevasine

Die Kontrolle der Infektion mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) wird primär durch antivirale CD8 T-Zellen vermittelt. Während der Koevolution zwischen Virus und Wirt wurden Immunevasionsmechanismen entwickelt, die direkt die Expression der Peptid-MHC-Klasse-I-Komplexe an der Zelloberfläche beeinflussen und es dem Virus ermöglichen, der Immunkontrolle des Wirtes zu entkommen. Da HCMV und das murine CMV (mCMV) zum Teil analoge Strategien zur Modulation des MHC-Klasse-I-Antigen-Präsentationswegs entwickelt haben, wurde in der vorliegenden Arbeit auf das experimentelle Modell mit mCMV zurückgegriffen. Die für die Immunevasion verantwortlichen Genprodukte m04/gp34, m06/gp48 und m152/gp40 werden aufgrund ihres regulatorischen Einflusses auf die Antigenpräsentation als vRAPs (viral regulators of antigen presentation) bezeichnet. Diese interferieren mit dem Transport Peptid-beladener MHC-Klasse-I-Moleküle und reduzieren in ihrer konzertierten Wirkung die Präsentation viraler Peptide an der Zelloberfläche.rnDie Transplantation hämatopoietischer Zellen nach Immunoablation stellt eine etablierte Therapieform bei malignen hämatologischen Erkrankungen dar. Zwischen Immunoablation und der Rekonstitution des Immunsystems sind die Empfänger der transferierten Zellen stark immunsupprimiert und anfällig für eine CMV-Erkrankung bei Reaktivierung des Virus. Neben der Gabe antiviraler Medikamente ist der adoptive Transfer antiviraler CD8 T-Zellen eine vielversprechende Therapiemöglichkeit, um reaktivierende CMV zu kontrollieren, bis das körpereigene Immunsystem wieder funktionsfähig ist. Obwohl im murinen Modell sehr wohl etabliert, stellen im humanen System die eingeschränkte Wirkung und die Notwendigkeit der konsequenten Gabe hoher Zellzahlen gewisse logistische Schwierigkeiten dar, welche die Methode bisher von der klinischen Routine ausschließen.rnDas murine Modell sagte eine Rolle von IFN-γ voraus, da Depletion dieses Zytokins zu einer verminderten Schutzwirkung gegen die mCMV-Infektion führt.rnIm ersten Teil dieser Arbeit sollte ein möglicher inhibitorischer Effekt von m04 auf m152 untersucht werden, der bei der Rekombinanten Δm06W beobachtet wurde. Mit neu generierten Viren (Δm06L1+2) konnte dieser Effekt allerdings nicht bestätigt werden. Bei Δm06W fehlte jedoch eine höher N-glykosylierte Isoform des m152-Proteins. Um zu untersuchen, ob die N-Glykosylierung von m152 für seine Funktion notwendig ist, wurde ein rekombinantes Virus generiert, das in Folge einer Deletion aller 3 N-Glykosylierungssequenzen nur eine nicht-glykosylierte Isoform des m152-Proteins bilden kann. In Übereinstimmung mit der zwischenzeitlich publizierten Kristallstruktur das Komplexes von m152 und dem Liganden RAE-1 des aktivierenden NK-Zellrezeptors NKG2D konnte erstmals gezeigt werden, dass die Funktionen von m152 in der adaptiven und in der angeborenen Immunität auch von der nicht N-glykosylierten Isoform wahrgenommen werden können.rnIm zweiten Teil der Arbeit sollte mit Hilfe eines Sets an vRAP Deletionsmutanten der Einfluss von IFN γ auf die einzeln oder in Kombination exprimierten vRAPs untersucht werden. Es zeigte sich, dass Vorbehandlung der Zellen mit IFN-γ die Antigenprozessierung nach Infektion stark erhöht und die vRAPs dann nicht mehr in der Lage sind, die Präsentation aller Peptid-beladener MHC-Klasse-I-Komplexe zu verhindern. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass vorher nicht-schützende CD8 T-Zellen Schutz vermitteln können, wenn das Gewebe der Rezipienten konstitutiv mit IFN-γ versorgt wird. Die zusätzliche Gabe von IFN-γ stellt daher eine vielversprechende Möglichkeit dar, den adoptiven Transfer als Therapie in der klinischen Routine einzusetzen.

Safety and therapeutic efficacy of adoptive p53-specific T cell antigen receptor (TCR) gene transfer

Immunotherapy with T cells genetically modified by retroviral transfer of tumor-associated antigen (TAA)-specific T cell receptors (TCR) is a promising approach in targeting cancer. Therefore, using a universal TAA to target different tumor entities by only one therapeutic approach was the main criteria for our TAA-specific TCR. Here, an optimized (opt) αβ-chain p53(264-272)-specific and an opt single chain (sc) p53(264-272)-specific TCR were designed, to reduce mispairing reactions of endogenous and introduced TCR α and TCR β-chains, which might lead to off-target autoimmune reactions, similar to Graft-versus-host disease (GvHD). rnIn this study we evaluated the safety issues, which rise by the risk of p53TCR gene transfer-associated on/off-target toxicities as well as the anti-tumor response in vivo in a syngeneic HLA-A*0201 transgenic mouse model. We could successfully demonstrate that opt sc p53-specific TCR-redirected T cells prevent TCR mispairing-mediated lethal off-target autoimmunity in contrast to the parental opt αβ-chain p53-specific TCR. Since the sc p53-specific TCR proofed to be safe, all further studies were performed using sc p53-specific TCR redirected T cells only. Infusion of p53-specific TCR-redirected T cells in Human p53 knock-in (Hupki) mice after lymphodepletion-preconditioning regimen with either sublethal body irradiation (5Gy) or chemotherapy (fludarabine and cyclophosphamide) in combination with vaccination (anti-CD40, CpG1668 and p53(257-282) peptide) did not result in a depletion of hematopoietic cells. Moreover, adoptive transfer of high numbers of p53-specific TCR-redirected T cells in combination with Interleukin 2 (IL-2) also did not lead to toxic on-target reactions. The absence of host tissue damage was confirmed by histology and flow cytometry analysis. Furthermore, p53-specific TCR-redirected T cells were able to lyse p53+A2.1+ tumor cells in vitro. However, in vivo studies revealed the potent suppressive effect of the tumor microenvironment (TME) mediated by tumor-infiltrating myeloid-derived suppressor cells (MDSC). Accordingly, we could improve an insufficient anti-tumor response in vivo after injection of the sc p53-specific TCR-redirected T cells by additional depletion of immunosuppressive cells of the myeloid lineage.rnTogether, these data suggest that the optimized sc p53(264-272)-specific TCR may represent a safe and efficient approach for TCR-based gene therapy. However, combinations of immunotherapeutic strategies are needed to enhance the efficacy of adoptive cell therapy (ACT)-mediated anti-tumor responses.

Preparation and functional characterisation of recombinant silicatein-alpha from the sponge Suberites domuncula

The marine world is an immense source of biodiversity that provides substances with striking potentials in medicinal chemistry and biotechnology. Sponges (Porifera) are marine animals that represent the most impressive example of organisms possessing the ability to metabolise silica through a family of enzymes known as silicateins. Complex skeletal structures (spicules) made of pure biogenic silica (biosilica) are produced under physiological conditions. Biosilica is a natural material comprising inorganic and organic components with unique mechanical, optical, and physico-chemical properties, including promising potential to be used for development of therapeutic agents in regenerative medicine. Unravelling the intimate physiological mechanisms occurring in sponges during the construction of their siliceous spicules is an on-going project, and several questions have been addressed by the studies proposed by our working group. In this doctoral work, the recombinant DNA technology is exploited for functional and structural characterisation of silicatein. Its precursors are produced as fusion proteins with a chaperone tag (named TF-Ps), and a robust method for the overexpression of native soluble proteins in high concentrations has been developed. In addition, it is observed and proven experimentally that the maturation of silicatein is an autocatalytic event that: (i) can be modulated by rational use of protease inhibitors; (ii) is influenced by the temperature of the environment; (iii) only slightly depends on the pH. In the same experimental framework, observations on the dynamics in the maturation of silicateins allow a better understanding of how the axial filaments form during the early stages of spicule construction. In addition, the definition of new distinct properties of silicatein (termed “structure-guiding” and “structure-forming”) is introduced. By homology models and through comparisons with similar proteins (the cathepsins), domains with significant surface hydrophobicity are identified as potential self-assembly mediators. Moreover, a high-throughput screening showed that TF-Ps could generate crystals under certain conditions, becoming promising for further structural studies. With the goal of optimise the properties of the recombinant silicatein, implementation of new production systems are tried for the first time. Success in the expression of silicatein-type proteins in insect and yeast cells, constitute a promising basis for further development, towards the establishment of an efficient method for the production of a high-value pure and soluble protein.