Untersuchungen von intrazellulären Signalwegen bei neuraler Determinierung und Differenzierung in vitro: Einfluß von GAP-43 und Bcl-2

Die PCC7-Mz1-Zellinie stellt ein geeignetes Modell dar, um frühe neurale Determinierungs- und Differenzierungsprozesse unter kontrollierten Bedingungen in vitro zu untersuchen. Aus pluripotenten Stammzellen entwickelt sich nach Behandlung mit dem Morphogen Retinsäure (RA) ein stabiles Muster aus Neuronen, Fibroblasten und Astroglia-Zellen. Parallel stirbt ein reproduzierbarer Anteil der Kultur apoptotisch. Zur näheren Aufklärung der molekularen Vorgänge während der neuralen Entwicklung wurde der Einfluß von zwei Schlüsselmolekülen - dem Proteinkinase C Substrat (PKC) GAP-43 sowie dem antiapoptotischen Bcl-2 Protein - auf die neurale Differenzierung und die damit assoziierten Apoptoseereignisse der PCC7-Mz1-Zellen untersucht. Dazu wurden stabile Zellinien, die eine Überexpression von GAP-43 bzw. von Bcl-2 aufwiesen, hergestellt. GAP-43In PCC7-Mz1-Zellen wurde die Expression von GAP-43 sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene innerhalb von 24 Stunden nach Zugabe von RA hochreguliert. GAP-43 war bereits in noch proliferierenden neuronalen Vorläuferzellen als Substrat für PKC und als Interaktionspartner von Calmodulin funktionell. Die Überexpression von GAP-43 in PCC7-Mz1-Zellen förderte die Ausprägung des neuronalen Phänotyps. Das Differenzierungspotential der Mz-GAP-43 Klone war eingeschränkt, da sich nach Induktion mit RA aus den Stammzellen nur noch Neurone, aber keine Fibroblasten und Astroglia-Zellen mehr entwickelten. Die Determinierung für das neuronale Entwicklungsschicksal war in den Mz-GAP-43 Klonen stärker fortgeschritten als in MzN-Klonen, die durch Subklonierung aus PCC7-Mz1-Zellen generiert wurden, da die GAP-43 überexprimierenden Zellen durch Wachstum auf Laminin nicht in den pluripotenten Phänotyp revertiert werden konnten. Aufgrund der Interaktion zwischen GAP-43 und Calmodulin in Stammzellen der Mz-GAP-43 Klone kann man vermuten, daß die neuronalen Determinierungsprozesse über Ca2+/Calmodulin-abhängige Signalwege verlaufen. Da das Gen für den Transkriptionsfaktor NCNF (

Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium

'Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium: Klonierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von Apoptose-Regulatoren der Porifera'. Auf der Suche nach der molekularbiologischen Grundlage der Apoptose in den Porifera, dem phylogenetisch ältesten Metazoen-Tierstamm, wurden Mitglieder der apoptoseregulatorischen Bcl?2 Familie unter Anwendung diverser Techniken im Schwamm G. cydonium identifiziert: GCBHP1 und GCBHP2. Detaillierte Analysen offenbarten Bcl-2-charakteristische Signaturen sowie eine durch apoptotische Stimuli induzierbare Expression. Die parallele HSP70-Induktion zeugte von der GCBHP2-Expression als Teil einer antiapoptotischen Streßantwort zum Schutz des Organismus'. Die kontinuierliche Transkription des im Rahmen dieser Arbeit gleichfalls klonierten Proliferationsmarkers SEP1 veranschaulichte zudem die Effektivität dieser Streßreaktion. Mit der Herstellung eines rekombinanten Proteins und der Gewinnung eines Antiserums konnte auch die streßinduzierte Proteinexpression des GCBHP2 verfolgt werden. Zum Zweck der Funktionsstudie wurden Säugetierzellen (HEK-293, NIH/3T3) mit einem GCBHP2-Konstrukt stabil transfiziert und auf die Expression des Schwammproteins untersucht. Diese Zellen unterschieden sich bereits phänotypisch von mock-transfizierten Zellen. Immunzytochemische Untersuchungen enthüllten eine für antiapoptotische Bcl-2 Proteine charakteristische Assoziation mit Mitochondrien. Unter dem Einfluß zweier apoptotischer Stimuli wurde für GCBHP2-transfizierte Zellen eine vierzehn-/sechsmal höhere Vitalität und eine reduzierte Aktivierung der Caspase-Kaskade registriert (im Vergleich zu mock-transfizierten Kontrollen). Somit wurde der antiapoptotische Charakter des GCBHP2 und die Existenz apoptotischer Mechanismen in den Porifera bestätigt.

Study of 3 Lambda H and 4 Lambda H in the reaction of 6 Li + 12 C at 2 A GeV

Die Produktion von Hyperkernen wurde in peripheren Schwerionenreaktionen untersucht, bei denen eine Kohlenstofffolie mit $^6$Li Projektilen mit einer Strahlenergie von $2 A$~GeV bestrahlt wurde. Es konnten klare Signale f{"{u}}r $Lambda$, $^3_{Lambda}$H, $^4_{Lambda}$H in deren jeweiligen invarianten Massenverteilungen aus Mesonenzerfall beobachtet werden.rnrnIn dieser Arbeit wird eine unabh{"{a}}ngige Datenauswertung vorgelegt, die eine Verifizierung fr"{u}herer Ergebnisse der HypHI Kollaboration zum Ziel hatte. Zu diesem Zweck wurde eine neue Track-Rekonstruktion, basierend auf einem Kalman-Filter-Ansatz, und zwei unterschiedliche Algorithmen zur Rekonstruktion sekund"{a}rer Vertices entwickelt.rn%-Rekonstruktionsalgorithmen .rnrnDie invarianten Massen des $Lambda$-Hyperon und der $^3_{Lambda}$H- und $^4_{Lambda}$H-Hyperkerne wurden mit $1109.6 pm 0.4$, $2981.0 pm 0.3$ und $3898.1 pm 0.7$~MeV$/c^2$ und statistischen Signifikanzen von $9.8sigma$, $12.8sigma$ beziehungsweise $7.3sigma$ bestimmt. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse stimmen mit der fr{"{u}}heren Auswertung {"{u}}berein.rnrnDas Ausbeutenverh{"{a}}ltnis der beiden Hyperkerne wurde als $N(^3_{Lambda}$H)/$N(^4_{Lambda}$H)$ sim 3$ bestimmt. Das deutet darauf hin, dass der Produktionsmechanismus f{"{u}}r Hyperkerne in Schwerionen-induzierten Reaktionen im Projektil-Rapidit{"{a}}tsbereich nicht allein durch einen Koaleszenzmechanismus beschrieben werden kann, sondern dass auch sekund{"{a}}re Pion-/Kaon-induzierte Reaktionen und Fermi-Aufbruch involviert sind.rn

DNA-Doppelstrangbrüche als zentrales Ereignis alkylierungsinduzierter Zytotoxizität

DNA-Doppelstrangbrüche als zentrales Ereignis alkylierungsinduzierter Zytotoxizität Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Entstehung von DNA-Doppelstrangbrüchen durch gentoxische Agenzien sowie den zytotoxischen Auswirkungen, die DNA-Doppelstrangbrüche für die Säuger-Zelle haben. Im ersten Teil der Arbeit wurden die molekularen Mechanismen untersucht, die am O6-Methylguanin (O6-MeG)-DNA-Schaden, hervorgerufen durch alkylierende Agenzien, ablaufen. Dabei konnte gezeigt werden, das O6-Methylguanin DNA-Methyltransferase (MGMT) O6-MeG/C und O6-MeG/T in vitro mit gleicher Effizienz repariert und daß die Reparatur von O6-MeG nach dem ersten Zellzyklus protektive Auswirkung auf das zelluläre Überleben hat. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit stand die Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen durch gentoxische Agenzien in Mausfibroblasten und CHO-Zellen im Mittelpunkt. Mit Hilfe der Einzelzellgelelektrophorese (SCGE, Comet Assay) wurde gezeigt, daß alkylierende Substanzen und die durch Elektroporation in Zellen hineingebrachten Restriktionsenzyme PvuII und EcoRI DNA-Doppelstrangbrüche zu induzieren vermögen. Die Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen nach Elektroporation von PvuII war vom p53-Status der Zellen abhängig, da p53-defiziente Zellen im Gegensatz zu p53-profizienten Zellen höhere DNA-Doppelstrangbruchraten über einen längeren Zeitraum aufwiesen. Im dritten Teil wurden die physiologischen Auswirkungen einer Behandlung von Zellen mit Induktoren von DNA-Doppelstrangbrüchen untersucht. Es wurde gezeigt, daß Alkylanzien in Abhängigkeit vom Vorhandensein von MGMT Apoptose induzieren. Mit PvuII elektroporierte p53-knockout Mausfibroblasten zeigten infolgedessen und im Gegensatz zu p53-wildtyp Zellen hohe Apoptoseraten. Die Induktion der Apoptose nach Behandlung mit PvuII wie auch nach g-Bestrahlung ging einher mit einem Abfall der Proteinmenge des antiapoptotischen Bcl-2. Zusammengenommen weisen die Versuchsergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß nach Behandlung von Zellen mit O6-MeG-generierenden Agenzien wie auch nach g-Bestrahlung DNA-Doppelstrangbrüche das ultimative Signal darstellen können.

Messung des Wirkungsquerschnitts der Reaktion d(e,e'p)n für fehlende Impulse bis 950 MeV/c und Trennung der longitudinalen und transversalen Reaktionsanteile für fehlende Impulse bis 350 MeV/c

Die Dreispektrometeranlage der A1-Kollaboration am MainzerElektronenbeschleuniger MAMI wurde im Rahmen dieser Arbeitverwendet, um die Elektrodisintegration des Deuteronsmit Hilfe der Reaktion d(e,e'p)n zu untersuchen. Im ersten Teil der Untersuchungen wurde die longitudinaleund transversale Strukturfunktion aus denWirkungsquerschnitten extrahiert. Die Zentralwerte derkinematischen Parameter waren dabei wie folgt eingestellt:1) Der Impulsübertrag wurde für alle Messungen auf 450 MeV/c festgelegt.2) Das Proton wurde in Richtung des Impulsübertrags nachgewiesen (parallele Kinematik).3) Vier Einstellungen des Energieübertrags, und damit korrespondierend des fehlenden Impulses, wurden gemessen: Energieübertrag / MeV : 128, 226, 289, 360. Fehlender Impuls / (MeV/c): 50, 200, 275, 350.4) Für jede dieser vier Kinematiken wurden mindestens drei verschiedene Einschußenergien bzw. Elektronenstreuwinkel eingestellt, um die Strukturfunktionen mit Hilfe der Rosenbluth-Separation zu bestimmen. Im zweiten Teil der Untersuchungen wurde derWirkungsquerschnitt für hohe fehlende Impulse bestimmt.Dessen Zentralwerte wurden von 30 MeV/c bis 906 MeV/cvariiert, wobei für die hohen fehlenden Impulse das Protonweit außerhalb der Richtung des Impulsübertragesnachzuweisen war. Der Energieübertrag lag dabei zwischen180 MeV und 600 MeV und der Impulsübertrag zwischen608 MeV/c und 698 MeV/c.

Mechanismus der Apoptose, Gentoxizität und DNA-Reparatur in Herpesvirus-Thymidinkinase-exprimierenden Säugerzellen nach Behandlung mit Antiherpes-Virustatika vom Typ der Nukleosidanaloga

Um Cytotoxizität und Gentoxizität nukleosidischer Antiherpes-Virustatika zu untersuchen, wurden stabile CHO-Klone etabliert, die Thymidinkinase (TK) des Herpes simplex-Virus Typ 1 (HSV-TK) oder des Varicella zoster-Virus (VZV-TK) exprimieren. In HSV-TK-exprimierenden Zellen wurde das Purinanalogon Ganciclovir (GCV) effizient in die genomische DNA eingebaut, worauf in den nächsten Replikationsrunden DNA-Strangbrüche und Aberrationen entstehen und Apoptose ausgelöst wird. GCV-induzierte Apoptose wird hauptsächlich über den mitochondrialen Weg vermittelt, wobei das anti-apoptotische Protein Bcl-2 im Mittelpunkt steht. Nach GCV-Behandlung konnte eine Caspase-9-vermittelte post-translationale Spaltung von Bcl-2 nachgewiesen werden. Das 23 kDa-großes Bcl-2-Fragment wirkt im Gegensatz zum intakten Bcl-2-Protein pro-apoptotisch und verstärkt die Cytochrom C-Freisetzung und damit die Aktivierung der Caspase-9, die Bcl-2 spaltet, was zu einem positiven 'Amplifikationsloop' des mitochondrialen apoptotischen Weges führt. In weiteren Experimenten wurde gezeigt, daß in die DNA inkorporiertes GCV durch Basenexzisionsreparatur repariert wird, wobei die DNA-Polymerase ß eine entscheidende Rolle spielt. Diese Reparatur führte zu einer signifikanten Reduktion der Apoptose und Klastogenität und damit zur Resistenzsteigerung gegenüber GCV. In VZV-TK-exprimierenden Zellen wurde gezeigt, daß Brivudin (BVDU), gleichermaßen Apoptose und Nekrose induzierte. Für die BVDU-induzierte Cytotoxizität konnte die Hemmung der Thymidylatsynthetase als Ursache identifiziert werden. Im Gegensatz zur GCV-induzierten Apoptose war für die BVDU-induzierte Apoptose der Rezeptor (Fas/CD95/APO-1)-vermittelte Weg von vorrangiger Bedeutung.

Präparation, Charakterisierung und elektronische Eigenschaften von dünnen Schichten des Hochtemperatursupraleiters HgReBa 2 Ca n-1 Cu n O y

Ziel dieser Arbeit war die Pr"{a}paration, Charakterisierung und Untersuchung der elektronischen Eigenschaften von d"{u}nnen Schichten des Hochtemperatursupraleiters HgReBa$_{2}$Ca$_{n-1}$Cu$_{n}$O$_{y}$, die mittels gepulster Laser-Deposition hergestellt wurden. Die HgRe1212-Filme zeigen in der AC-Suszeptibilit"{a}t einen scharfen "{U}bergang in die supraleitende Phase bei 124 K mit einer "{U}bergangsbreite von 2 K. Die resistiven "{U}berg"{a}nge der Proben wurden mit zunehmender St"{a}rke des externen Magnetfeldes breiter. Aus der Steigung der Arrheniusplots konnte die Aktivierungsenergie f"{u}r verschiedene Feldst"{a}rken bestimmt werden. Weiterhin wurde die Winkelabh"{a}ngigkeit des Depinning-Feldes $B_{dp}(theta)$ der Filme gemessen. Hieraus wurde ein Anisotropiewert von $gamma$ = 7.7 bei 105 K ermittelt. Dies ist relevant, um den f"{u}r Anwendungen wichtigen Bereich im $T$-$B$-$theta$-Phasenraum des Materials absch"{a}tzen zu k"{o}nnen. Die kritische Stromdichte $J_{c}$ der d"{u}nnen Filme aus HgRe-1212 wurde mit Hilfe eines SQUID-Magnetometers gemessen. Die entsprechenden $M$-$H$ Kurven bzw. das magnetische Moment dieser Filme wurde f"{u}r einen weiten Temperatur- und Feldbereich mit einem magnetischen Feld senkrecht zum Film aufgenommen. F"{u}r einen HgRe-1212-Film konnte bei 5 K eine kritische Stromdichte von 1.2 x 10$^{7}$ A/cm$^{2}$ und etwa 2 x 10$^{6}$ A/cm$^{2}$ bei 77 K ermittelt werden. Es wurde die Magnetfeld- und die Temperaturabh"{a}ngigkeit des Hall-Effekts im normalleitenden und im Mischzustand in Magnetfeldern senkrecht zur $ab$-Ebene bis zu 12 T gemessen. Oberhalb der kritischen Temperatur $T_{c}$ steigt der longitudinale spezifische Widerstand $rho_{xx}$ linear mit der Temperatur, w"{a}hrend der spezifische Hall-Widerstand $rho_{yx}$ sich umgekehrt proportional zur Temperatur "{a}ndert. In der N"{a}he von $T_{c}$ und in Feldern kleiner als 3 T wurde eine doppelte Vorzeichen"{a}nderung des spezifischen Hall-Widerstandes beobachtet. Der Hall-Winkel im Normalzustand, cot $theta_{H}= alpha T^{2} + beta$, folgt einer universellen $textit{T }^{2}$-Abh"{a}ngigkeit in allen magnetischen Feldern. In der N"{a}he des Nullwiderstand-Zustandes h"{a}ngt der spezifische Hall-Widerstand $rho_{yx}$ "{u}ber ein Potenzgesetz mit dem longitudinalen Widerstand $rho_{xx}$ zusammen. Das Skalenverhalten zwischen $rho_{yx}$ und $rho_{xx}$ weist eine starke Feld-Abh"{a}ngigkeit auf. Der Skalenexponent $beta$ in der Gleichung $rho_{yx}$ =A $rho_{xx}^{beta}$ steigt von 1.0 bis 1.7, w"{a}hrend das Feld von 1.0 bis 12 T zunimmt.

Untersuchungen zum Mechanismus der Zytotoxizität von alkylierenden Agenzien in malignen Melanomzellen

Maligne Melanome sind gegenüber Chemotherapeutika relativ resistent. Das methylierende Alkylanz Temozolomid sowie das chlorethylierende und DNA-Interstrand Crosslink (ICL) bildende Alkylanz Fotemustin kommen bei der Behandlung des malignen Melanoms als Mittel erster Wahl zum Einsatz. In der vorliegenden Arbeit konnte das erste Mal nachgewiesen werden, dass die zytotoxische Wirkung von Temozolomid und Fotemustin in Melanomzellen durch Apoptose vermittelt wird. Unter Verwendung klinisch relevanter Dosen der beiden Alkylantien konnte die Induktion von Apoptose durch vier unabhängige Methoden (Bestimmung der SubG1-Fraktion und der Apoptose- / Nekrose-Frequenz, Aktivierung der Effektorcaspasen-3 und -7 sowie Spaltung von PARP-1) nachgewiesen werden. Die Alkylierungen an der O6-Position des Guanins, welche durch beide Agenzien induziert werden, sind auch in Melanomzellen die wichtigsten Zytotoxizität-bewirkenden Läsionen in der DNA, und die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist folglich ein herausragender Resistenzmarker. Eine der verwendeten Zelllinien (D05) exprimierte p53-Wildtypprotein. Diese Zelllinie war resistenter als alle anderen Zelllinien gegenüber Temozolomid und Fotemustin. Dies weist darauf hin, dass p53 nicht die Apoptoseinduktion in Melanomzellen verstärkt. Die Prozessierung des O6MeG erfolgt über die Mismatch-Reparatur (MMR) unter Generierung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs). Die Untersuchung der durch Temozolomid induzierten DSBs, nachgewiesen durch gammaH2AX-Induktion, korrelierte direkt mit der apoptotischen Antwort von Melanomzelllinien und DSBs können somit als eine entscheidende apoptoseauslösende Größe angesehen werden. Eine Resistenz gegenüber dem methylierenden Temozolomid in der Zelllinie MZ7 konnte auf einen Defekt in der MMR-Schadenserkennung auf der Ebene des MutSalpha-Komplexes zurückgeführt werden. Dieser Defekt hatte keinen Einfluss auf die Fotemustin-vermittelte Apoptoseinduktion. Neben MGMT konnte somit die MMR als Resistenzfaktor gegenüber methylierenden Agenzien in Melanomen identifiziert werden. Die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde in Melanomzelllinien im Detail untersucht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass Fotemustin-bedingte ICLs in Zellen einen G2/M-Arrest im Behandlungszyklus induzieren. Wie anhand G1-arretierter Zellen nachgewiesen werden konnte, war das Durchlaufen der DNA-Replikation vor Erreichen des Arrests für die Induktion der Apoptose notwendig. Die Prozessierung von ICLs ist im Vergleich zu Methylierungen der DNA deutlich komplexer. Dies könnte erklären, warum in Melanomzellen die durch gammaH2AX-Induktion repräsentierten DSBs nicht mit der Sensitivität der einzelnen Zelllinien korreliert. Die Untersuchung unterschiedlich sensitiver Zelllinien zeigte ein vergleichbares Schadensniveau an ICLs und eine ebenso vergleichbare initiale Prozessierung derselben unter Generierung von DSBs. Die Prozessierung dieser sekundären Läsionen, welche anhand der Abnahme von gammaH2AX-Foci untersucht wurde, war hingegen in der sensitiveren Melanomzelllinie deutlich weniger effektiv. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass eine uneffektive Prozessierung der sekundären Läsionen einhergeht mit einer verstärkten und länger anhaltenden Aktivierung der in der DSB-Detektion beteiligten Kinase ATM und der Checkpoint Kinase 1. Es wäre daher denkbar, dass eine verstärkte Aktivität dieser Kinasen proapoptotische Signale vermittelt. Unterschiede in der Prozessierung der sekundären Läsionen könnten somit ein wichtiger Marker der ICL-induzierten Apoptose darstellen. Des weitern konnte nachgewiesen werden, dass nach Fotemustingabe die mitochondrial-vermittelte Apoptose einen effektiven Exekutionsweg in Melanomen darstellt. Während Cytochrom C-Freigabe, Bcl-2-Abnahme an den Mitochondrien, Bax-Rekrutierung und Caspase-9 Aktivität nachgewiesen werden konnten, wurden keine Hinweise auf eine Fas-Rezeptor-vermittelte Apoptose gefunden. Die Unfähigkeit, Rezeptor-vermittelte Apoptose zu unterlaufen, könnte die Bedeutungslosigkeit des p53-Gens in Melanomen begründen, da gerade dieser Weg in der Alkylantien-induzierten Apoptose in anderen Zellsystemen eine große Relevanz besitzt. Bei der Suche nach einem alternativen proapoptotischen Signalweg konnten Hinweise für die Beteiligung des Rb/E2F-1-Wegs, welcher über p73 agiert, in einer p53-mutierten Melanomzelllinie gefunden werden. Einen Einfluss der Proteine Survivin und XIAP als Resistenzfaktoren auf die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde hingegen nicht nachgewiesen.

Using sulfur isotope fractionation to understand the atmospheric oxidation of SO 2

Sulfate aerosol plays an important but uncertain role in cloud formation and radiative forcing of the climate, and is also important for acid deposition and human health. The oxidation of SO2 to sulfate is a key reaction in determining the impact of sulfate in the environment through its effect on aerosol size distribution and composition. This thesis presents a laboratory investigation of sulfur isotope fractionation during SO2 oxidation by the most important gas-phase and heterogeneous pathways occurring in the atmosphere. The fractionation factors are then used to examine the role of sulfate formation in cloud processing of aerosol particles during the HCCT campaign in Thuringia, central Germany. The fractionation factor for the oxidation of SO2 by ·OH radicals was measured by reacting SO2 gas, with a known initial isotopic composition, with ·OH radicals generated from the photolysis of water at -25, 0, 19 and 40°C (Chapter 2). The product sulfate and the residual SO2 were collected as BaSO4 and the sulfur isotopic compositions measured with the Cameca NanoSIMS 50. The measured fractionation factor for 34S/32S during gas phase oxidation is αOH = (1.0089 ± 0.0007) − ((4 ± 5) × 10−5 )T (°C). Fractionation during oxidation by major aqueous pathways was measured by bubbling the SO2 gas through a solution of H2 O2