Regulation und funktionelle Bedeutung der zellulären und humoralen Immunantwort in der Pathogenese der chronischen Hepatitis C Virusinfektion

Patienten mit akuter, selbstlimitierender HCV-Infektion und solche mit IFN-a Therapieresponse (SCR) zeigten eine hochregulierte NS3-spezifische T-Helferzellantwort.Über die funktionelle Bedeutung der T-Helferzellantwort und der Antikörpersynthese besteht jedoch noch Unklarheit.In dieser Studie wurde die proliferative Antwort der PBMC von Patienten mit anhaltender Therapieresponse (SCR; n=8), Non-Respondern (NR; n=13) und unbehandelten HCV-Patienten(UTR; n=10) sowie gesunden Kontrollen (HC; n=5) auf die rekombinanten HCV-Antigene Core, Helicase, NS3, NS4 und NS5-4 bestimmt und ihre Sekretion von IFN-.

Untersuchungen zur Pathogenese der "Bypass graft disease"

Untersuchung zur Pathogenese der 'Bypass graft disease' Histomorphologische Untersuchungen und in vitro Zellkulturanalysen bilden die Grundlage für Fortschritte im Verständnis der pathologischen Mechanismen der aortokoronaren 'Bypass graft disease'. In der vorliegenden Arbeit wurde die pathomorphologische Veränderung der Gefäßanatomie im Verlauf der 'Bypass graft disease' an Hand histologischer Präparate explantierter humaner venöser Bypass-Läsionen analysiert. Erstmalig wurde ein histomorphologisches Klassifizierungsschema (Typ I - Typ III) beschrieben. Morphometrische Analysen zeigten, dass die Fläche der Neointima und Media im Verlauf der pathologischen Umgestaltung der Bypass-Architektur (Typ I zu Typ III) deutlich zunimmt. Bestimmungen der Zelldichte dokumentierten eine deutlich größere Zellzahl in allen Gefäßwandschichten der Bypass-Läsionen bei der Gegenüberstellung mit einer Kontrollgruppe nativer Venen, wobei im Verlauf der 'Bypass graft disease' (Typ I zu Typ III) eine Abnahme der Zelldichte zu beobachten war. Erstmalig durchgeführte Untersuchungen zur Proliferationsaktivität in aortokoronaren Bypass-Läsionen im Vergleich zu nativen Gefäßen präsentierten eine deutlich höhere zelluläre Proliferation in den Bypass-Präparaten. Diese war am stärksten in Typ III Läsionen ausgeprägt. Expressionsstudien im in vitro Zellkulturmodellsystem identifiziereten die homodimeren Isotypen (AA / BB) des Wachstumsfaktors PDGF als Stimulatoren der Transkriptionsfaktoren c-fos und c-myc in primärkultivierten humanen Muskelzellen der Aorta.

Beeinflussung der menschlichen allergischen Immunantwort durch Allergen-DNA-transfizierte dendritische Zellen

Immunreaktionen gegen Antigene können eine zelluläre Immunantwort, eingeleitet durch TH1-Zellen induzieren oder aber eine antikörpervermittelte humorale Immunantwort induzieren, die von Zellen des TH2-Typs bestimmt sind. Diese unterschiedlichen Immunreaktionen regulieren sich gegenseitig, indem sie sich wechselseitig unterdrücken. Dadurch stellt sich ein Gleichgewicht zwischen den TH1- und TH2-Immunantworten ein. Die Allergie vom Soforttyp ist TH2-dominiert und wird ausgelöst durch die Produktion spezifischer IgE-Antikörper gegen eigentlich harmlose Antigene. Durch die frühe Ausschüttung des Zytokins IL-4 von T-Zellen differenzieren naive allergenspezifische T-Zellen zu TH2-Zellen aus. Diese sezernieren dann ebenfalls IL-4 und auch IL-13, was die B-Zellen zu einer vermehrten Produktion von IgE-Molekülen stimuliert. IgE bindet an den hochaffinen IgE-Rezeptor auf Mastzellen, Basophilen und Eosinophilen. Bei weiterem Allergenkontakt kommt es durch Kreuzvernetzung der Fc-Rezeptoren zur Ausschüttung vo

Untersuchungen zur Lymphozytotoxizität gegen Tumoren in Nierenzellkarzinom-Patienten und HLA-kompatiblen gesunden Spendern

In der vorliegenden Arbeit wurden Blutlymphozyten, die aus allogenen, serologisch HLA (humanes Leukozytenantigen)-identischen gesunden Geschwisterspendern von Nierenzellkarzinom (RCC, engl. renal cell carcinoma)-Patienten isoliert wurden, auf ihre antitumorale Reaktivität in vitro untersucht. Dazu war die vorangehende Generierung von stabil in vitro wachsenden Tumorzelllinien der Patienten zwingende Voraussetzung. Insgesamt wurden aus primärem Tumorgewebe von 65 Nierenzellkarzinom-Patienten Tumorzellen isoliert und daraus Zellkulturen angelegt. In 28 % der Fälle gelang es, eine konstant in Zellkultur wachsende Tumorzelllinie zu etablieren. Daneben wurden aus 56 Tumorpatienten auch die aus dem angrenzenden Nierengewebe gewonnenen nicht-malignen Nierenzellen über wenige Zellkultur-Passagen expandiert. In vier Patienten mit stabil in vitro wachsender Tumorzelllinie war ein allogener HLA-identischer Geschwisterspender verfügbar. In diesen Modellsystemen wurden in gemischten Lymphozyten-Tumorzell-Kulturen (MLTCs, engl. mixed lymphocyte tumor cell cultures) die Blutlymphozyten der Patienten und der gesunden Geschwisterspender mit der jeweiligen Nierenzellkarzinom-Zelllinie stimuliert und tumorreaktive CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs, engl. cytotoxic T-lymphocytes) generiert. Wenn möglich wurden aus den so gewonnenen „Responder“-Massenkulturen CD8+ T-Zellklone isoliert und hinsichtlich ihrer Funktionalität in IFN-γ-ELISpot-Assays und 51Chrom-Zytotoxizitätstests untersucht. Durch Blockade der HLA-Moleküle mit monoklonalen Antikörpern wurden die HLA-Restriktionselemente sowie weitere an der Erkennung beteiligte Oberflächenmoleküle analysiert. Kreuzreaktivitätsuntersuchungen mit einem breiten Zielzell-„Panel“ gaben Aufschluss über die Reaktivität der CTLs gegen RCC, nicht-maligne Nierenzellen, hämatopoetische Zielzellen von Patient und Geschwisterspender und weitere Tumorzelllinien aus Nierenzellkarzinomen und anderen Tumorentitäten. Interessanterweise zeigten die Geschwister-MLTC-„Responder“-Lymphozyten im Vergleich zu den autologen MLTC-„Responder“-Lymphozyten eine stärkere Proliferation und Zytotoxizität nach Stimulation mit Tumorzellen. Die allogenen tumorreaktiven „Responder“-Lymphozyten entstammten der CD8+ CD62L(high)+ Subpopulation, die naive Vorläufer- und „central memory“-T-Zellen enthält. Im Gegensatz zu autologen MLTC-Lymphozyten und tumorinfiltrierenden Lymphozyten konnte aus nahezu allen allogenen MLTCs mithilfe des Grenzverdünnungsverfahrens ein breites Spektrum an tumorreaktiven CTL-Klonen expandiert werden. Diese lysierten entweder ausschließlich die autologe RCC-Zelllinie oder kreuzreagierten mit autologen nicht-malignen Nierenzellen. Eine Minderheit der CTL-Klone erkannte außerdem hämatopoetische Zellen des Patienten oder allogene Tumorzellen. Als HLA-Restriktionselemente der allogenen tumorreaktiven CD8+ CTL-Klone wurden HLA-A2, -A3, -A11, -A24 und -B7 identifiziert. Weiterhin wurden in einem Modellsystem bisher unbekannte, stark proliferierende CD3+ CD16+ CD57+ CTL-Klone mit nicht-HLA-restringierter Tumorreaktivität isoliert. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit erstmals, dass allogene Blutlymphozyten von HLA-identischen gesunden Geschwistern eine Vielfalt von tumorreaktiven CD8+ CTL-Klonen enthalten. Im direkten Vergleich mit autologen Blutlymphozyten der betroffenen Patienten besitzen allogene Blutlymphozyten der Geschwister eine stärkere proliferative und zytotoxische Tumorreaktivität. Die Ergebnisse dieser Arbeit ermutigen weitere Bemühungen, tumorreaktive T-Zellen aus dem Blut von HLA-identischen gesunden Geschwisterspendern in vitro zu generieren. Solche T-Zellen wären in zweierlei Hinsicht von Interesse: Zum einen ermöglichen sie die Identifizierung der Zielantigene, die von T-Zellen aus gesunden Individuen auf Tumoren erkannt werden und als Zielstrukturen von antigenspezifischen Immuntherapien (z. B. Vakzination) dienen könnten. Zum anderen könnten diese T-Zellen möglicherweise für eine adoptive Immuntherapie der betroffenen Tumorpatienten verwendet werden.

Strategies to identify and further characterize novel and known genes involved in regulation of skeletogenesis

372 osteochondrodysplasias and genetically determined dysostoses were reported in 2007 [Superti-Furga and Unger, 2007]. For 215 of these conditions, an association with one or more genes can be stated, while the molecular changes for the remaining syndromes remain illusive to date. Thus, the present dissertation aims at the identification of novel genes involved in processes regarding cartilage/ bone formation, growth, differentiation and homeostasis, which may serve as candidate genes for the above mentioned conditions. Two different approaches were undertaken. Firstly, a high throughput EST sequencing project from a human fetal cartilage library was performed to identify novel genes in early skeletal development (20th week of gestation until 2nd year of life) that could be investigated as potential candidate genes. 5000 EST sequences were generated and analyzed representing 1573 individual transcripts, corresponding to known (1400) and to novel, yet uncharacterized genes (173). About 7% of the proteins were already described in cartilage/ bone development or homeostasis, showing that the generated library is tissue specific. The remaining profile of this library was compared to previously published libraries from different time points (8th–12th, 18th–20th week and adult human cartilage) that also showed a similar distribution, reflecting the quality of the presented library analyzed. Furthermore, three potential candidate genes (LRRC59, CRELD2, ZNF577) were further investigated and their potential involvement in skeletogenesis was discussed. Secondly, a disease-orientated approach was undertaken to identify downstream targets of LMX1B, the gene causing Nail-Patella syndrome (NPS), and to investigate similar conditions. Like NPS, Genitopatellar syndrome (GPS) is characterized by aplasia or hypoplasia of the patella and renal anomalies. Therefore, six GPS patients were enrolled in a study to investigate the molecular changes responsible for this relatively rare disease. A 3.07 Mb deletion including LMX1B and NR5A1 (SF1) was found in one female patient that showed features of both NPS and GPS and investigations revealed a 46,XY karyotype and ovotestes indicating true hermaphroditism. The microdeletion was not seen in any of the five other patients with GPS features only, but a potential regulatory element between the two genes cannot be ruled out yet. Since Lmx1b is expressed in the dorsal limb bud and in podocytes, proteomic approaches and expression profiling were performed with murine material of the limbs and the kidneys to identify its downstream targets. After 2D-gel electrophoresis with protein extracts from E13.5 fore limb buds and newborn kidneys of Lmx1b wild type and knock-out mice and mass spectrometry analysis, only two proteins, agrin and carbonic anhydrase 2, remained of interest, but further analysis of the two genes did not show a transcriptional down regulation by Lmx1b. The focus was switched to expression profiles and RNA from newborn Lmx1b wild type and knock-out kidneys was compared by microarray analysis. Potential Lmx1b targets were almost impossible to study, because of the early death of Lmx1b deficient mice, when the glomeruli, containing podocytes, are still immature. Because Lmx1b is also expressed during limb development, RNA from wild type and knock-out Lmx1b E11.5 fore limb buds was investigated by microarray, revealing four potential Lmx1b downstream targets: neuropilin 2, single-stranded DNA binding protein 2, peroxisome proliferative activated receptor, gamma, co-activator 1 alpha, and short stature homeobox 2. Whole mount in situ hybridization strengthened a potential down regulation of neuropilin 2 by Lmx1b, but further investigations including in situ hybridization and protein-protein interaction studies will be needed.

Molekulare Mechanismen der Kontaktinhibition: Identifizierung neuer Tumorsuppressorgene

Die Zellen eines Organismus unterliegen ständig den Einflüssen wachstumsfördernder und –hemmender Signale. Die korrekte Verarbeitung dieser Signale ist essentiell für die Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase. Wachstumsfördernde Signale sind z. B. Wachstumsfaktoren und –hormone. Diese Substanzen sowie ihre Rezeptoren und Signalwege sind relativ gut erforscht. Dagegen ist über die wachstumshemmenden Signalwege vergleichsweise wenig bekannt. Wichtige wachstumshemmende Signale werden einerseits über lösliche Faktoren, wie z. B. TGF-β, und andererseits über Zell-Zell-Kontakte vermittelt. Den Zell-Zell-Kontakt vermittelten Wachstumsstopp bezeichnet man auch als Kontaktinhibition. Die Kontaktinhibition ist ein wichtiges Merkmal nicht-transformierter Zellen. Im Gegensatz dazu zeichnen sich transformierte Zellen durch den Verlust der Kontaktinhibition aus, der einhergeht mit unkontrolliertem Wachstum der Zellen und Tumorbildung. Genauere Kenntnisse der molekularen Ursachen der Kontaktinhibition bzw. ihres Verlustes während der Tumorentstehung werden neue Ansatzpunkte für die Krebstherapie liefern. Diese können bei der Entwicklung neuer, nebenwirkungsärmerer Krebsmedikamente und einer verbesserten Diagnostik helfen. In der vorliegenden Arbeit sollten daher die molekularen Mechanismen der Kontaktinhibition in Fibroblasten aus der Maus näher untersucht werden. Dazu wurden differentielle Genexpressionsanalysen mittels genomweiter Microarrays durchgeführt. Weiterhin wurde der Einfluss der Kontaktinhibition auf die Regulation der Signalkaskaden der MAP-Kinasen ERK und p38 untersucht. Durch die Genexpressionsanalyse konnte gezeigt werden, dass viele Schlüsselgene des Zellzyklus und der DNA-Synthese in der Kontaktinhibition eine Rolle spielen, so zum Beispiel Skp2, Foxm1 und einige Komponenten des MCM-Komplexes. Weiterhin haben wir gezeigt, dass durch Kontaktinhibition selektiv die EGF-induzierte Signalkaskade über die MAP-Kinasen gehemmt wird.

Wirkmechanismen der trifunktionalen Antikörper catumaxomab und ertumaxomab in humanen Tumorsphäroid-Kokulturen

Ein neuer Ansatz der immunologischen Krebstherapie ist die Verwendung der bispezifischen, trifunktionalen Antikörper catumaxomab (anti-EpCAM x anti-CD3) und ertumaxomab (anti-Her2/neu x anti-CD3). Die Bispezifität besteht in der Bindung eines Tumor-assoziierten Antigens (EpCAM bzw. Her2/neu) und des CD3 Moleküls auf der Oberfläche von T-Zellen. Darüber hinaus stellt die Interaktion des Fc-Teils mit FcγRI/IIa/III positiven akzessorischen Immunzellen die dritte Funktion der Antikörper dar. Diese einzigartige Kombination ermöglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes. In klinischen Studien konnte bereits die Wirksamkeit beider Antikörper nachgewiesen werden. Die eigentlichen Wirkmechanismen der trifunktionalen Antikörper jedoch sind noch nicht ausreichend bekannt. Um die Wechselwirkung zwischen den stark EpCAM- und schwach Her2/neu-positive FaDu- sowie den stabil mit humanem Her2/neu transfizierten FaDu E593-Tumorzellen, peripheren Blutmonozyten (PBMC) und trifunktionalen Antikörpern systematisch zu untersuchen wurde ein 3D-Tumormodell, die so genannten multizellulären Tumorsphäroide (MCTS), angewandt. Als Endpunkte zur Beurteilung der Therapieeffizienz dienten das Volumenwachstum der Sphäroide, sowie die Klonogenität und die Zellvitalität. Zur Beurteilung der PBMC-Penetration in die Sphäroide erfolgten immunhistochemische Färbungen und molekularbiologische Nachweise der Abwehrzellantigene. Entsprechend wurden in den Sphäroiden die Proliferationsrate über eine Ki67-Färbung sowie die Apoptoserate über eine FragEL-Markierung identifiziert. Die Aktivität der PBMC wurde durch die Bestimmung ausgewählter Zytokine (ELISA) und der Zellzahl aus den Medienüberständen charakterisiert. Die an den FaDu- und E593-Sphäroiden erzielten Ergebnisse zeigten, dass catumaxomab und ertumaxomab eine konzentrations- und zeitabhängige Abnahme des Sphäroidvolumens bewirkten. Die Schrumpfung der Tumorsphäroide ging mit einer Reduktion des proliferativen und mit einer Steigerung des apoptotischen Tumorzellanteils einher. Die histologischen Befunde weisen darauf hin, dass die Volumenreduktion durch eine gesteigerte Anzahl infiltrierender Leukozyten bedingt ist. Auf verschiedenen Methoden basierende Analysen der Immunzellsubtypen zeigten eine dominierende Infiltration von zytotoxischen T-Zellen in die Tumorsphäroide. Der Aktivitätsnachweis der T-Zellen wurde über die Detektion der IL-2 mRNA und des sekretierten Zytokins erbracht. Einen zusätzlichen Hinweis auf eine zelluläre Immunantwort liefert das Zytokinmuster mit hohen Konzentrationen an IFN-γ. Der direkte Vergleich beider Antikörper zeigte, dass der anti-tumorale Effekt abhängig von der Antigenexpression auf den Tumorzellen war. Die Analyse von Medienüberständen wies auf eine mehrheitlich höhere Zytokinausschüttung in Gegenwart des Tumorantigens hin. Sphäroid-Kokulturen, die mit dem parentalen anti-EpCAM Antikörper behandelt wurden, zeigten keine Volumenreduktion. Im Gegensatz dazu führte der parentale CD3-Antikörper, das CD3- und Tumorzell-bindende catumaxomab F(ab')2 Fragment oder eine Kombination beider parentaler Antikörper zu einer anti-tumoralen Wirkung, die jedoch nicht so stark war wie die des trifunktionalen Antikörpers catumaxomab. Demnach ist für catumaxomab gezeigt, dass für die Effektivität des Antikörpers die Trifunktionalität unabdingbar ist. Daraus leitet sich ab, dass die Aktivierung der Abwehrzellen durch kostimulatorische Signale notwendig ist und über die Tumorantigenbindung Mechanismen wie ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) zum Tragen kommen. Die Experimente mit gleichzeitiger Gabe von trifunktionalen Antikörpern und Immunsuppressiva haben gezeigt, dass eine Kombination beider Agenzien möglich ist. Die Konzentrationen sind jedoch sorgfältig derart zu wählen, dass die Zytokinausschüttung und die damit verbundenen Nebenwirkungen reduziert sind, ohne dass die anti-tumorale Wirkung der Antikörper maßgeblich beeinflusst wird. T-Zellen bedienen sich nach Aktivierung für die rasche Proliferation einer gesteigerten aeroben Glykolyse. Unter Behandlung der Kokulturen mit catumaxomab konnte im Vergleich zu anderen immunstimulatorischen Agenzien die größte Steigerung der Laktatproduktion bzw. der Azidifizierungs- und Sauerstoffverbrauchsrate detektiert werden. Diese Effekte weisen auf eine metabolische Aktivierung der PBMC durch catumaxomab hin. Das von den Tumorzellen abgegebene Laktat kann die Immunzellen jedoch inhibieren. Daher wäre die Kombination mit Glykolyseinhibitoren ein möglicher Ansatz, um die Therapieeffizienz weiter zu steigern. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Komedikation der trifunktionalen Antikörper mit Chemotherapeutika zu einer gesteigerter Wirkung führte. Insgesamt liegt die Zukunft der Immuntherapien wohl in der Kombination mit anderen Wirkstoffklassen, die anti-tumorale Effekte verstärken oder immunsupprimierende Mechanismen inhibieren.

Assessing the role of sCYLD and Bcl-3 in immune regulation

CYLD is a deubiquitinating enzyme, which negatively regulates NF-κB signaling by removing Lys63-linked polyubiquitin chains from its substrates. In mice, there are two variants of CYLD: full-length CYLD (FL-CYLD) and its short splice variant sCYLD. sCYLD lacks the NEMO and TRAF2 binding sites and CYLDex7/8 mice, which have been generated in our laboratory, overexpress sCYLD in the absence of the full length transcript. In this thesis, we show that bone marrow-derived macrophages (BMDCs) overexpressing sCYLD display a hyperactive phenotype. They have increased levels of the inflammatory cytokines IL-6 and TNFα, have exaggerated stimulatory capacity and fail to induce tolerance in in vivo experiments. CYLDex7/8 BMDCs have increased levels of nuclear Bcl-3, which we could show to be directly induced by sCYLD expression. NF-κB signaling was markedly upregulated in CYLDex7/8 BMDCs.rnBcl-3 overexpressing BMDCs with normal CYLD expression, however, were not hyperactive, suggesting that Bcl-3 overexpression is not sufficient for causing the observed phenotype. Taken together we propose a model in which the exclusive overexpression of sCYLD with high nuclear levels of Bcl-3 in BMDCs is accompanied by an increased NF-κB activation, resulting in a hyperactive phenotype.rnWe further analyzed macrophages overexpressing sCYLD using the LysMcre CyldFL/FL strain, but could not detect differences in activation marker expression, cytokine secretion or iNOS production. LysMcre CyldFL/FL mice immunized with MOG35-55 peptide showed a more severe course of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), which could not be explained by enhanced levels of MHC class II on CNS-resident macrophages and microglia or increased T cell infiltration.rnMice overexpressing Bcl-3 in T cells develop spontaneous colitis. They have less peripheral memory/effector T cells and less Th1 cells, whereas Th17 numbers are normal. Naïve T cells overexpressing Bcl-3 show defects in in vitro differentiation to the Th1 or Th17 fate. CD4+ T cells overexpressing Bcl-3 show enhanced survival capacity in in vitro culture, but have a defect in proliferative capacity when stimulated in vitro or when adoptively transferred into lymphopenic hosts.

Etablierung eines In-vivo-Modells zur Untersuchung der Rolle epidermaler Langerhanszellen bei der Entstehung der Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung nach allogener Blutstammzelltransplantation

Dendritische Zellen der Haut, wie z.B. die Langerhanszellen (LC) der Epidermis, sind potente antigenpräsentierende Zellen (APC). Nach allogener Blutstammzelltransplantation (engl.: hematopoietic stemm cell transplantation, HSCT) persistieren Empfänger-APC und können Spender-T-Zellen aktivieren. Somit spielen dendritische Zellen eine kritische Rolle bei der Initiierung von akuter Transplantat-Gegen-Wirt-Reaktion (engl.: graft-versus-host-disease, GvHD).rnIn der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem entwickelt, welches humane Haut in einem Xenotransplantationsmodell nutzt, um die Wechselwirkung dieser gewebsständigen APC mit alloreaktiven T-Zellen zu untersuchen. Dafür wurden humane Resthautpräparate von subkutanem Gewebe befreit und intraskaptulär auf immunsupprimierte NOD/LtSz-scid IL2R#-null Mäuse (NSG) transplantiert. Diesen Tieren fehlen funktionale T-, B- und NK-Zellen, und sie tolerieren somit ein xenogenes Transplantat. Im Vergleich zu anderen immundefizienten Stämmen, haben sie eine erhöhte Lebenserwartung und es ist zudem möglich humane Hämatopoese durch Stammzellgabe zu etablieren.rnPublizierte Methoden der Hauttransplantation wurden für diese Arbeit optimiert und weiterentwickelt. So konnte die Erfolgsrate von 44% auf bis zu 95% gesteigert werden. Erste Untersuchungen fokussierten den Einfluss der Wundheilung auf die Verteilung dermaler Zellpopulationen, wie z.B. CD11c positive APC, und die Population der LC in der Epidermis. Während der ersten Wochen der Wundheilung war ein vorübergehendes Verschwinden der LC aus der Epidermis zu beobachten. Im Gegensatz dazu waren CD11c positive dermale Zellen permanent detektierbar. Die zu späteren Zeitpunkten festgestellte Repopulation der Epidermis mit LC unterstützt die Hypothese einer lokalen Vorläuferzelle. Die vorgelegten Daten und die lokale proliferative Aktivität dieser Zellen unterstreichen ihre Unabhängigkeit vom peripheren Blut. Versuche, eine Depletion der LC mittels UVC-Bestrahlung zu erreichen, gelangen nicht. Auch dies spricht für das Vorhandensein eines lokalen Vorläufers.rnZur Induktion von GvHD in der transplantierten Haut wurden in vitro DC des Hautspenders generiert und damit HLA-disparate T-Zellen stimuliert. Auf diese Weise sollte eine maximale Alloreaktivität gegen das Hauttransplantat generiert werden. In allen vorgestellten Systemen ließ sich nach Infusion der T-Lymphozyten in transplantierte Tiere, eine T-Zellinduzierte inflammatorische Reaktion auslösen. Optisch war eine deutliche Rötung des Transplantats feststellbar. Diese war jedoch nur in den Proben besonders deutlich, welche T-Zellen mit vorheriger in vitro Stimulation durch DC des Hautspenders erhalten hatten. Histologisch konnten Anzeichen einer Entzündung nachgewiesen werden. Neben Akanthose und Hyperparakeratose, waren deutliche T-Zellinfiltrate detektierbar. Auch Spaltbildung und Ablösung der Epidermis, sowie vereinzelte Apoptosen der epidermalen Zellen wiesen auf eine GvHD artige Entzündung hin.rnEine weitere Beobachtung nach T-Zellgabe, war die Depletion der LC aus der Epidermis. Auch konnte durch spätere T-Zellgaben keine weitere Hautrötung ausgelöst werden. Dies belegt die Funktion der LC als primäre Zielzelle der alloreaktiven T-Zellen. Unterstrichen wird dies durch Verwendung einer LC defizienten Haut, welche keine Hautrötung oder Anzeichen einer Entzündung entwickelte.rnZusammenfassend wurde für diese Arbeit ein Modellsystem entwickelt, welches es erlaubt Untersuchungen entzündlicher Hautkrankheiten unter Berücksichtigung hautständiger APC durchzuführen. Dabei kann dieses Modell in Zukunft für die Untersuchung von APC modulierenden Agenzien genutzt werden, da präklinische Modelle für spezies-spezifische Therapien bislang fehlten. Das Entstehen einer Entzündung könnte so verhindert oder eine Behandlung ermöglicht werden.

Pathogenetische Bedeutung der Glutathionperoxidase-1 in der arteriellen Gefäßwand

Die antioxidative Aktivität des Enzyms Glutathionperoxidase-1 (GPx-1) schützt vor Atherosklerose und ihren Folgeerkrankungen. In einer Vorstudie konnten wir zeigen, dass der Mangel an GPx-1 die Atheroskleroseentwicklung in Apolipoprotein E defizienten (ApoE-/-) Mäusen beschleunigt und modifiziert. Allerdings sind die Verteilung der GPx-1 in atherosklerotischen Läsionen und die Mechanismen für den erhöhten Makrophagengehalt in der Läsion noch nicht geklärt. Deshalb haben wir (1) die in-situ Expression der GPx-Isoformen in atherosklerotischen Läsionen von GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Mäusen und (2) den Einfluss der GPx-1 Defizienz auf die Schaumzellbildung und Proliferation der Peritonealmakrophagen in ApoE-/- Mäusen untersucht. Die GPx-1-/-ApoE-/- und ApoE-/- Weibchen wurden für 6 und 12 Wochen auf einer atherogenen „Western-type“ Diät gehalten. Die in situ-Hybridisierung zeigte, dass die verschiedenen Isoformen der GPx (GPx-1, GPx-3, GPx-4) vorwiegend in Makrophagen, nicht jedoch in glatten Muskelzellen der atherosklerotischen Läsionen von ApoE-/- Mäusen exprimiert wurden. Für die in vitro Untersuchungen wurden 5 Monate alte, GPx-1 defiziente und Wildtyp-Mäuse, gehalten auf Normaldiät, verwendet. Die Öl-Rot-O Färbung zeigte, dass die GPx-1 Defizienz die OxLDL (oxidiertes LDL) - und E-LDL (enzymatisch modifiziertes LDL) - induzierte Schaumzellbildung förderte. Darüber hinaus war die OxLDL-induzierte Cholesterinakkumulation (zellulärer Cholesterinester/ Cholesterin-Gehalt) in GPx-1 defizienten Makrophagen verstärkt, sodass ein Mangel an GPx-1 die Aufnahme von OxLDL durch Monozyten und damit die Umwandlung in Schaumzellen beschleunigt. Hinsichtlich der Proliferation zeigte sich, dass MCSF (Macrophage Colony-Stimulating Facotr) ein stärkerer Stimulus als OxLDL ist. Ein Mangel an GPx-1 fördert die Proliferation zusätzlich. Daran ist die ERK1/2 (extracellular-signal regulated kinase 1/2) - Kaskade beteiligt, denn es wurde eine schnelle Phosphorylierung der ERK1/2-Kaskade durch MCSF und/oder OxLDL nachgewiesen. Entsprechend reduzieren ERK1/2-Inhibitoren die proliferative Aktivität der Makrophagen. Die Hemmung der p38-MAPK (p38 mitogen-activated protein kinase) führt zur vermehrten Proliferation und bei gleichzeitig verringerter Caspase-3/7 Aktivität der Makrophagen unabhängig von der Expression der GPx-1. Ein Mangel an GPx-1 hat auch keinen Einfluss auf die MCSF-vermittelte Aktivierung der p38-MAPK und JNK (c-Jun N-terminal kinase). Zusammenfassend läßt sich feststellen, dass die GPx-1-Defizienz einen signifikanten Einfluss auf die Schaumzellbildung und Proliferation von Makrophagen hat, was zur Beschleunigung der Atherosklerose und zu vermehrter Zellularität der entstehenden atherosklerotischen Läsionen führt. Die Proliferation wird über den ERK1/2 Signal-transduktionsweg positiv und über den p38-MAPK Weg negativ reguliert, wobei die ERK1/2-Kaskade empfindlich gegenüber oxidativem Stress bei GPx-1-Defizienz ist.

In vitro characterization of human AML-reactive CTL clones generated from the naive subset of healthy donors and adoptive transfer into leukemia-engrafted NSG mice

Acute myeloid leukemia (AML) is a very aggressive cancer of the hematopoietic system. Chemotherapy and immunotherapeutical approaches including hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and donor lymphocyte infusion (DLI) are the only curative options available. The beneficial graft-versus-leukemia (GVL) effect of cellular immunotherapy is mostly mediated by donor-derived CD8+ T lymphocytes that recognize minor histocompatibility antigens (mHags) and leukemia-associated antigens (LAAs) presented on the surface of AML blasts (Falkenburg et al. 2008; Kolb 2008). A main complication is graft-versus-host disease (GVHD) that can be induced when cytotoxic T lymphocytes (CTLs) recognize broadly expressed antigens. To reduce the risk of GVHD, specific allogeneic T-cell therapy inducing selective GVL responses could be an option (Barrett & Le Blanc 2010; Parmar et al. 2011; Smits et al. 2011). This requires efficient in vitro strategies to generate AML-reactive T cells with an early differentiation phenotype as well as vigorous effector functions and humanized mouse models to analyze the anti-leukemic potential of adoptively transferred T cells in vivo. In this study, AML-reactive CTL clones and oligoclonal T-cell lines could be reliably generated from the naive subset of healthy HLA-class I-identical donors by stimulation with primary AML blasts in mini-mixed-lymphocyte / leukemia cultures (MLLCs) in eight different patient / donor pairs. These CTLs were promising candidates for cellular immunotherapy because of their relatively early differentiation phenotype and strong proliferative and lytic capabilities. The addition of the common γ-chain cytokine IL-21 to the stimulation protocol enabled more precursors to develop into potent leukemia-reactive CTLs, presumably by its beneficial effects on cell survival and antigen-specific proliferation during the first weeks of cultures. It also strengthened the early-stage phenotype. Three long-term cultured CTLs exemplarily transferred into leukemia-engrafted immunodeficient NSG mice mediated a significant reduction of the leukemic burden after a single transfusion. These results demonstrate that CTL clones with reactivity to patient-derived AML blasts can be isolated from the naive compartment of healthy donors and show potent anti-leukemic effects in vivo. The herein described allo-MLLC approach with in vitro “programmed” naive CTL precursors independent of a HSCT setting is a valuable alternative to the conventional method of isolating in vivo primed donor CTLs out of patients after transplantation (Kloosterboer et al. 2004; Warren et al. 2010). This would make leukemia-reactive CTLs already available at the time point of HSCT, when residual leukemia disease is minimal and the chances for complete leukemia eradication are high. Furthermore, leukemia-reactive CTLs effectively expanded by this in vitro protocol can be used as screening populations to identify novel candidate LAAs and mHags for antigen-specific immunotherapy.

Identification of target genes of the T-box proteins in Drosophila melanogaster

In a prior bioinformatic analysis by Hüyseyin Binbas, potential Tbx targets sequences in wing-related genes have been identified. Guided by this information, enhancer trap/reporter lacZ insertions were characterized by X-gal staining first in wildtype and then in l(1)omb imaginal discs.rnIn several lines I observed an increase in reporter expression in a l(1)omb mutant background. Since Omb is assumed to function predominantly as a transcriptional repressor, this may indicate direct regulation. Repression by Omb was observed e.g. for brk and tkv. These genes are negatively regulated by Dpp, while omb is induced by Dpp. Omb which mediates the effects of Dpp on proliferation could, thus, also mediate the Dpp effect on patterning of the wing disc. However, brk and tkv were not completely derepressed in l(1)omb indicating that Dpp represses these genes also by an Omb-independent mechanism.rnMore frequently I observed loss of reporter expression in an l(1)omb mutant background. In these cases, regulation by Omb presumably is indirect. For example, STAT92E-lacZ expression in the wildtype eye was symmetrically expressed at the dorsal and ventral margins. In l(1)omb, ventral expression was selectively lost. Loss of omb is known to cause ventral overproliferation of the eye by activation of the Jak/STAT pathway. STAT92E expression is negatively regulated by Jak/STAT signaling suggesting that loss of omb activates Jak/STAT further upstream in the pathway.rnRegional overproliferation of eye and wing in the l(1)omb mutant background proved a complicating issue in the search for Omb targets. This effect made it difficult to decide whether an expanded reporter expression pattern was due to tissue expansion or reporter gene derepression. For instance hth-lacZ appeared to expand along the ventral eye disc margin in l(1)omb. Without addtional experiments it cannot be concluded whether this is due to de-repression or to activation in association with the proliferative state. Parallel to my experiments, evidence accumulated in our laboratory that loss of omb may attenuate Wg and Hegehog signaling. Since these diffusible proteins are the main patterning molecules in the wing imaginal disc, with dpp being downstream of Hh, many of the observed effects could be secondary to reduced Wg and Hh activity. Examples are ab-lacZ, Dll-lacZ and vgBE-lacZ (reduced expression on the dorso-ventral boundary) and inv-lacZ (late larval expression in the anterior wing disc compartment is lost) or sal-lacZ. Epistasis experiment will be required to clarifiy these issues.rnFurthermore, loss of omb appeared to induce cell fate changes. It was reported previously that in an omb null mutant, the dorsal determinant apterous (ap) is ectopically expressed in the ventral compartment (an effect I did not observe with the strongly hypomorphic l(1)omb15, indicating strong dose dependence). Ventral repression of ap is maintained by epigenetic mechanisms. The patchy and variable nature of ectopic expression of ap or grn-1.1-lacZ points to an effect of omb on epigenetic stability.rnIn the second part of my thesis, an analysis of Omb expression in the Drosophila embryonic ventral nervous system was performed. Omb was found co-expressed with Eve in the medial aCC and RP2 motorneurons as well as the fpCC interneuron and the mediolateral CQ neurons. Additionally, Omb was detected in the Eg positive NB7-3 GW serotonergic motoneuron and the N2-4 neurons. Omb was not found in Repo positive glial cells. During embryonic stage 14, Omb showed some coepression with Dpn or Pros. At the embryonic stage 16, Omb was expressed in minor subset of Mid and Wg positive cells.

Detrimental effects of exuberant and restrained immune responses against the central nervous system in the context of multiple sclerosis and glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and most aggressive astrocytic tumor of the central nervous system (CNS) in adults. The standard treatment consisting of surgery, followed by a combinatorial radio- and chemotherapy, is only palliative and prolongs patient median survival to 12 to 15 months. The tumor subpopulation of stem cell-like glioma-initiating cells (GICs) shows resistance against radiation as well as chemotherapy, and has been suggested to be responsible for relapses of more aggressive tumors after therapy. The efficacy of immunotherapies, which exploit the immune system to specifically recognize and eliminate malignant cells, is limited due to strong immunosuppressive activities of the GICs and the generation of a specialized protective microenvironment. The molecular mechanisms underlying the therapy resistance of GICs are largely unknown. rnThe first aim of this study was to identify immune evasion mechanisms in GICs triggered by radiation. A model was used in which patient-derived GICs were treated in vitro with fractionated ionizing radiation (2.5 Gy in 7 consecutive passages) to select for a more radio-resistant phenotype. In the model cell line 1080, this selection process resulted in increased proliferative but diminished migratory capacities in comparison to untreated control GICs. Furthermore, radio-selected GICs downregulated various proteins involved in antigen processing and presentation, resulting in decreased expression of MHC class I molecules on the cellular surface and diminished recognition potential by cytotoxic CD8+ T cells. Thus, sub-lethal fractionated radiation can promote immune evasion and hamper the success of adjuvant immunotherapy. Among several immune-associated proteins, interferon-induced transmembrane protein 3 (IFITM3) was found to be upregulated in radio-selected GICs. While high expression of IFITM3 was associated with a worse overall survival of GBM patients (TCGA database) and increased proliferation and migration of differentiated glioma cell lines, a strong contribution of IFITM3 to proliferation in vitro as well as tumor growth and invasiveness in a xenograft model could not be observed. rnMultiple sclerosis (MS) is the most common autoimmune disease of the CNS in young adults of the Western World, which leads to progressive disability in genetically susceptible individuals, possibly triggered by environmental factors. It is assumed that self-reactive, myelin-specific T helper cell 1 (Th1) and Th17 cells, which have escaped the control mechanisms of the immune system, are critical in the pathogenesis of the human disease and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). It was observed that in vitro differentiated interleukin 17 (IL-17) producing Th17 cells co-expressed the Th1-phenotypic cytokine Interferon-gamma (IFN-γ) in combination with the two respective lineage-associated transcription factors RORγt and T-bet after re-isolation from the CNS of diseased mice. Pathogenic molecular mechanisms that render a CD4+ T cell encephalitogenic have scarcely been investigated up to date. rnIn the second part of the thesis, whole transcriptional changes occurring in in vitro differentiated Th17 cells in the course of EAE were analyzed. Evaluation of signaling networks revealed an overrepresentation of genes involved in communication between the innate and adaptive immune system and metabolic alterations including cholesterol biosynthesis. The transcription factors Cebpa, Fos, Klf4, Nfatc1 and Spi1, associated with thymocyte development and naïve T cells were upregulated in encephalitogenic CNS-isolated CD4+ T cells, proposing a contribution to T cell plasticity. Correlation of the murine T-cell gene expression dataset to putative MS risk genes, which were selected based on their proximity (± 500 kb; ensembl database, release 75) to the MS risk single nucleotide polymorphisms (SNPs) proposed by the most recent multiple sclerosis GWAS in 2011, revealed that 67.3% of the MS risk genes were differentially expressed in EAE. Expression patterns of Bach2, Il2ra, Irf8, Mertk, Odf3b, Plek, Rgs1, Slc30a7, and Thada were confirmed in independent experiments, suggesting a contribution to T cell pathogenicity. Functional analysis of Nfatc1 revealed that Nfatc1-deficient CD4+ T cells were restrained in their ability to induce clinical signs of EAE. Nfatc1-deficiency allowed proper T cell activation, but diminished their potential to fully differentiate into Th17 cells and to express high amounts of lineage cytokines. As the inducible Nfatc1/αA transcript is distinct from the other family members, it could represent an interesting target for therapeutic intervention in MS.rn

Individualisierte Krebstherapie : präklinischer „proof of concept“ einer mutationsspezifischen Immuntherapie

Da nicht-synonyme tumorspezifische Punktmutationen nur in malignen Geweben vorkommen und das veränderte Proteinprodukt vom Immunsystem als „fremd“ erkannt werden kann, stellen diese einen bisher ungenutzten Pool von Zielstrukturen für die Immuntherapie dar. Menschliche Tumore können individuell bis zu tausenden nicht-synonymer Punktmutationen in ihrem Genom tragen, welche nicht der zentralen Immuntoleranz unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Hypothese zu untersuchen, dass das Immunsystem in der Lage sein sollte, mutierte Epitope auf Tumorzellen zu erkennen und zu klären, ob auf dieser Basis eine wirksame mRNA (RNA) basierte anti-tumorale Vakzinierung etabliert werden kann. Hierzu wurde von Ugur Sahin und Kollegen, das gesamte Genom des murinen B16-F10 Melanoms sequenziert und bioinformatisch analysiert. Im Rahmen der NGS Sequenzierung wurden mehr als 500 nicht-synonyme Punktmutationen identifiziert, von welchen 50 Mutationen selektiert und durch Sanger Sequenzierung validiert wurden. rnNach der Etablierung des immunologischen Testsysteme war eine Hauptfragestellung dieser Arbeit, die selektierten nicht-synonyme Punktmutationen in einem in vivo Ansatz systematisch auf Antigenität zu testen. Für diese Studien wurden mutierte Sequenzen in einer Länge von 27 Aminosäuren genutzt, in denen die mutierte Aminosäure zentral positioniert war. Durch die Länge der Peptide können prinzipiell alle möglichen MHC Klasse-I und -II Epitope abgedeckt werden, welche die Mutation enthalten. Eine Grundidee des Projektes Ansatzes ist es, einen auf in vitro transkribierter RNA basierten oligotopen Impfstoff zu entwickeln. Daher wurden die Impfungen naiver Mäuse sowohl mit langen Peptiden, als auch in einem unabhängigen Ansatz mit peptidkodierender RNA durchgeführt. Die Immunphänotypisierung der Impfstoff induzierten T-Zellen zeigte, dass insgesamt 16 der 50 (32%) mutierten Sequenzen eine T-Zellreaktivität induzierten. rnDie Verwendung der vorhergesagten Epitope in therapeutischen Vakzinierungsstudien bestätigten die Hypothese das mutierte Neo-Epitope potente Zielstrukturen einer anti-tumoralen Impftherapie darstellen können. So wurde in therapeutischen Tumorstudien gezeigt, dass auf Basis von RNA 9 von 12 bestätigten Epitopen einen anti-tumoralen Effekt zeigte.rnÜberaschenderweise wurde bei einem MHC Klasse-II restringierten mutiertem Epitop (Mut-30) sowohl in einem subkutanen, als auch in einem unabhängigen therapeutischen Lungenmetastasen Modell ein starker anti-tumoraler Effekt auf B16-F10 beobachtet, der dieses Epitop als neues immundominantes Epitop für das B16-F10 Melanom etabliert. Um den immunologischen Mechanismus hinter diesem Effekt näher zu untersuchen wurde in verschieden Experimenten die Rolle von CD4+, CD8+ sowie NK-Zellen zu verschieden Zeitpunkten der Tumorentwicklung untersucht. Die Analyse des Tumorgewebes ergab, eine signifikante erhöhte Frequenz von NK-Zellen in den mit Mut-30 RNA vakzinierten Tieren. Das NK Zellen in der frühen Phase der Therapie eine entscheidende Rolle spielen wurde anhand von Depletionsstudien bestätigt. Daran anschließend wurde gezeigt, dass im fortgeschrittenen Tumorstadium die NK Zellen keinen weiteren relevanten Beitrag zum anti-tumoralen Effekt der RNA Vakzinierung leisten, sondern die Vakzine induzierte adaptive Immunantwort. Durch die Isolierung von Lymphozyten aus dem Tumorgewebe und deren Einsatz als Effektorzellen im IFN-γ ELISPOT wurde nachgewiesen, dass Mut-30 spezifische T-Zellen das Tumorgewebe infiltrieren und dort u.a. IFN-γ sekretieren. Dass diese spezifische IFN-γ Ausschüttung für den beobachteten antitumoralen Effekt eine zentrale Rolle einnimmt wurde unter der Verwendung von IFN-γ -/- K.O. Mäusen bestätigt.rnDas Konzept der individuellen RNA basierten mutationsspezifischen Vakzine sieht vor, nicht nur mit einem mutations-spezifischen Epitop, sondern mit mehreren RNA-kodierten Mutationen Patienten zu impfen um der Entstehung von „escape“-Mutanten entgegenzuwirken. Da es nur Erfahrung mit der Herstellung und Verabreichung von Monotop-RNA gab, also RNA die für ein Epitop kodiert, war eine wichtige Fragestellungen, inwieweit Oligotope, welche die mutierten Sequenzen sequentiell durch Linker verbunden als Fusionsprotein kodieren, Immunantworten induzieren können. Hierzu wurden Pentatope mit variierender Position des einzelnen Epitopes hinsichtlich ihrer in vivo induzierten T-Zellreaktivitäten charakterisiert. Die Experimente zeigten, dass es möglich ist, unabhängig von der Position im Pentatop eine Immunantwort gegen ein Epitop zu induzieren. Des weiteren wurde beobachtet, dass die induzierten T-Zellfrequenzen nach Pentatop Vakzinierung im Vergleich zur Nutzung von Monotopen signifikant gesteigert werden kann.rnZusammenfassend wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit präklinisch erstmalig nachgewiesen, dass nicht-synonyme Mutationen eine numerisch relevante Quelle von Zielstrukturen für die anti-tumorale Immuntherapie darstellen. Überraschenderweise zeigte sich eine dominante Induktion MHC-II restringierter Immunantworten, welche partiell in der Lage waren massive Tumorabstoßungsreaktionen zu induzieren. Im Sinne einer Translation der gewonnenen Erkenntnisse wurde ein RNA basiertes Oligotop-Format etabliert, welches Eingang in die klinische Testung des Konzeptes fand.rn