Transgenic mice as a tool for depression research: examples from the endocannabinoid and the corticotropin-releasing hormone system

Major depression belongs to the most serious and widespread psychiatric disorders in today’s society. There is a great need for the delineation of the underlying molecular mechanisms as well as for the identification of novel targets for its treatment. In this thesis, transgenic mice of the endocannabinoid and the corticotropin-releasing hormone (CRH) system were investigated to determine the putative role of these systems for depression-like phenotypes in mice. In the first part of the thesis, we found that the endocannabinoid system was prominently involved in a brain region-specific and temporally controlled manner in acute as well as in chronic stress processing. Genetic deletion in combination with pharmacological intervention revealed the importance of a fully functional endocannabinoid system for efficient neuroendocrine and behavioral stress coping. Accordingly, cannabinoid type 1 (CB1) receptor-deficient mice displayed several depression-like symptoms and molecular alterations, including “behavioral despair”, stress hormone hypersecretion and decreased glucocorticoid receptor and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus. However, the endocannabinoid system was dispensable for the efficacy of currently used antidepressant drugs. To facilitate future endocannabinoid research, a transgenic mouse was generated, which overexpressed the CB1 receptor protein fused to a fluorescent protein. In the second part of the thesis, conditional brain region-specific CRH overexpressing mice were evaluated as a model for pathological chronic CRH hyperactivation. Mutant mice showed aberrant neuroendocrine and behavioral stress coping and hyperarousal due to CRH-induced activation of the noradrenergic system in the brain. Mutant mice appeared to share similarities with naturally occurring endogenous CRH activation in wild-type mice and were sensitive to acute pharmacological blockade of CRH receptor type 1 (CRH-R1). Thus, CRH overexpressing mice serve as an ideal in vivo tool to evaluate the efficacy of novel CRH-R1 antagonists. Together, these findings highlight the potential of transgenic mice for the understanding of certain endo-phenotypes (isolated symptoms) of depression and their molecular correlates.

Die Interaktion von VHL und PTEN bei der Tumorinitiation und Progression

Das VHL-Syndrom umfasst Erkrankungen, die mit einem Funktionsverlust von VHL einhergehen. Das Tumorspektrum umfasst retinale und zerebrale Hämangioblastome, Nierenzysten und klarzellige Nierenkarzinome, Zysten und Tumore des Pankreas, Phäochromocytome, Adenome der Hoden und Tumore des Mittelohrs. Obwohl aufgrund klinischer Studien bekannt ist, welche VHL-Mutation mit welchen Neoplasien assoziiert werden können, konnte bisher kein VHL-Mausmodell das Krankheitsbild des VHL-Syndroms widerspiegeln. Daher ist vermutlich eine zusätzliche Fehlregulation weiterer Gene nötig ist, um die Tumorgenese in den verschiedenen Geweben zu induzieren. In mehreren klarzelligen Nierenkarzinomen konnte bereits eine PTEN-Defizienz nachgewiesen werden, der Verlust von PTEN wird außerdem auch mit der Tumorgenese von Phäochromocytomen assoziiert. Möglicherweise wirken VHL und PTEN also in der Tumorsuppression in der Niere und der Nebenniere zusammen.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals eine VHL-vermittelte Stabilisierung der PTEN-Konzentration sowohl in embryonalen als auch in Tumor-Zellen der Niere nachgewiesen werden. Die Analyse des Regulationsmechanismus ergab erstens eine Hypoxie-abhängige Abnahme der Transkription von PTEN. Des Weiteren konnte eine VHL-vermittelte Ubiquitinylierung von NEDD4-1, welches als E3-Ligase von PTEN dessen Degradation und Kerntransport reguliert, ermittelt werden. rnIn Nierenkarzinom-Zellen wurde weiterhin eine VHL- bzw. PTEN-Restitution induziert, um die Auswirkungen der beiden Tumorsuppressoren auf das Zellverhalten in vitro und in vivo zu untersuchen. Sowohl VHL als auch PTEN hatten dieselben Effekte lediglich in unterschiedlicher Intensität auf das Verhalten der Zellen. So konnte VHL- und PTEN-abhängig eine Verstärkung der Adhäsion, eine Inhibierung der Migration und eine Verminderung der Überlebens- und Metastasierungsfähigkeit nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden Mausmodelle mit einem ubiquitären, heterozygoten Pten-Verlust generiert, die teilweise eine zusätzliche Haploinsuffizienz von Vhl bzw. eine heterozygote VHL Typ II-Mutation (V2B oder V2C) trugen. Sporadisch entwickelten diese Mäuse Vhl-abhängig Lebertumore und Pten-abhängig Lymphome und Ovarialkarzinome. Einige Mäuse mit einer kombinierten Vhl- und Pten-Defizienz bildeten zusätzlich Nierenzysten aus, die teilweise das gesamte Volumen der Niere einnahmen. Besonders häufig entstanden in Pten-haploinsuffizienten Mäusen Phäochromocytome, die durch eine zusätzliche V2B- oder V2C-Mutation in gleichaltrigen Mäusen deutlich weiterentwickelt waren. Demnach induziert erst der gemeinsame Verlust von Vhl und Pten die Bildung von Nierenzysten und Phäochromocytomen, welche dem Krankheitsbild des VHL-Syndroms zugeordnet werden.rnDie Untersuchungen innerhalb dieser Arbeit zeigen erstmalig die Interaktion und Kooperation von VHL und PTEN in der Tumorsuppression. Die Resultate bieten außerdem die Grundlage für weitere Analysen der Auswirkung der VHL-vermittelten PTEN-Stabilisierung und für detailliertere Untersuchungen der durch die kombinierte Vhl- und Pten-Defizienz induzierten Neoplasien der Niere und der Nebennieren-Tumore in in vivo Mausmodellen.rn

Die kutane murine Mastzelle als Initiator angeborener und adaptiver Immunreaktionen der Haut

Für lange Zeit wurde die Mastzelle nur als Effektorzelle im Rahmen von Erkrankungen des atopischen Formenkreises gesehen. Erst lange Zeit nach ihrer ersten Beschreibung konnte gezeigt werden, dass die Mastzelle einen wichtigen Beitrag zur Abwehr von Pathogenen leistet. Dies wird vor allem durch Wege der alternativen Mastzellaktivierung, z.B. über Toll- like Rezeptoren, ermöglicht. In dieser Arbeit sollte daher zunächst die mögliche Funktion der Mastzelle bei der durch den synthetischen TLR7- Liganden Imiquimod induzierten Entzündungsreaktion der Haut und der Auswanderung von Langerhans Zellen in einem Mausmodell untersucht werden. Beide Reaktion waren dabei von Mastzellen abhängig sind. Für die frühe und schnelle Induktion der Entzündungsreaktion zeigten sich vor allem die Mastzellcytokine IL-1 und TNF-α verantwortlich. Bei der Auswanderung der Langerhans Zellen hingegen spielt das Mastzell-IL1 eine entscheidende Rolle. Imiquimod wurde in Form der Creme Aldara bereits erfolgreich zur transkutanen Immunisierung (TCI) in Mausversuchen verwendet. Da die oben beschriebenen Reaktionen, welche durch Imiquimod vermittelt werden, eine deutliche Abhängigkeit von Mastzellen zeigten, sollte nun auch die Funktion der Mastzelle bei der Entstehung einer adaptiven Immunantwort am Modell der transkutanen Immunisierung untersucht werden. Der Immunisierungserfolg und damit die Entstehung einer adaptiven Immunantwort konnte auch hier auf die Anwesenheit von Mastzellen zurückgeführt werden. Mastzellen können somit als ein weiteres wichtiges Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunität gesehen werden und können so einen entscheidenden Einfluß auf die Entstehung einer adaptiven Immunantwort nehmen.

Strategies to identify and further characterize novel and known genes involved in regulation of skeletogenesis

372 osteochondrodysplasias and genetically determined dysostoses were reported in 2007 [Superti-Furga and Unger, 2007]. For 215 of these conditions, an association with one or more genes can be stated, while the molecular changes for the remaining syndromes remain illusive to date. Thus, the present dissertation aims at the identification of novel genes involved in processes regarding cartilage/ bone formation, growth, differentiation and homeostasis, which may serve as candidate genes for the above mentioned conditions. Two different approaches were undertaken. Firstly, a high throughput EST sequencing project from a human fetal cartilage library was performed to identify novel genes in early skeletal development (20th week of gestation until 2nd year of life) that could be investigated as potential candidate genes. 5000 EST sequences were generated and analyzed representing 1573 individual transcripts, corresponding to known (1400) and to novel, yet uncharacterized genes (173). About 7% of the proteins were already described in cartilage/ bone development or homeostasis, showing that the generated library is tissue specific. The remaining profile of this library was compared to previously published libraries from different time points (8th–12th, 18th–20th week and adult human cartilage) that also showed a similar distribution, reflecting the quality of the presented library analyzed. Furthermore, three potential candidate genes (LRRC59, CRELD2, ZNF577) were further investigated and their potential involvement in skeletogenesis was discussed. Secondly, a disease-orientated approach was undertaken to identify downstream targets of LMX1B, the gene causing Nail-Patella syndrome (NPS), and to investigate similar conditions. Like NPS, Genitopatellar syndrome (GPS) is characterized by aplasia or hypoplasia of the patella and renal anomalies. Therefore, six GPS patients were enrolled in a study to investigate the molecular changes responsible for this relatively rare disease. A 3.07 Mb deletion including LMX1B and NR5A1 (SF1) was found in one female patient that showed features of both NPS and GPS and investigations revealed a 46,XY karyotype and ovotestes indicating true hermaphroditism. The microdeletion was not seen in any of the five other patients with GPS features only, but a potential regulatory element between the two genes cannot be ruled out yet. Since Lmx1b is expressed in the dorsal limb bud and in podocytes, proteomic approaches and expression profiling were performed with murine material of the limbs and the kidneys to identify its downstream targets. After 2D-gel electrophoresis with protein extracts from E13.5 fore limb buds and newborn kidneys of Lmx1b wild type and knock-out mice and mass spectrometry analysis, only two proteins, agrin and carbonic anhydrase 2, remained of interest, but further analysis of the two genes did not show a transcriptional down regulation by Lmx1b. The focus was switched to expression profiles and RNA from newborn Lmx1b wild type and knock-out kidneys was compared by microarray analysis. Potential Lmx1b targets were almost impossible to study, because of the early death of Lmx1b deficient mice, when the glomeruli, containing podocytes, are still immature. Because Lmx1b is also expressed during limb development, RNA from wild type and knock-out Lmx1b E11.5 fore limb buds was investigated by microarray, revealing four potential Lmx1b downstream targets: neuropilin 2, single-stranded DNA binding protein 2, peroxisome proliferative activated receptor, gamma, co-activator 1 alpha, and short stature homeobox 2. Whole mount in situ hybridization strengthened a potential down regulation of neuropilin 2 by Lmx1b, but further investigations including in situ hybridization and protein-protein interaction studies will be needed.

The role of EBI-3 in a murine model of lung metastases of melanoma

In dieser Arbeit wurde die Rolle des Epstein-Barr Virus induzierten Gens 3 in einem Mausmodel des durch B16-F10 Zellen hervorgerufenen metastasierenden Melanoms untersucht. Das von aktivierten antigenpräsentierenden Zellen exprimierte EBI-3 gehört zur Familie der löslichen Typ 1 Zytokinrezeptoren, weist eine hohe Homologie zur p40 Untereinheit des IL-12 auf und bildet zusammen mit p28 das IL-27. Die intravenöse Injektion der B16-F10 Zelllinie führte zu einer signifikanten Erniedrigung der Tumormetastasen in den EBI-3 defizienten Lungen sowie zu einer höheren Lebenserwartung dieser Mäuse im Vergleich zu den B6 Wildtypen. Darüber hinaus habe ich in den EBI-3 defizienten Mäusen eine verminderte VCAM-1 Expression auf den Endothelzellen der Lunge gefunden während Änderungen in der VEGF Expression nicht detektiert wurden. Der immunologische Hintergrund, der diesen therapeutischen Effekt hervorrief, konnte durch die T-Zellaktivierung durch die kürzlich neu beschriebene DC Population, welche Interferon-produzierende Killer Dendritische Zellen genannt werden (IK-DC), die zusätzlich von aktivierten und maturierten klassischen DCs unterstützt wurden, erklärt werden. IK-DCs von EBI-3 defizienten Mäusen produzierten höhere Mengen an IFN-g während die klassischen DCs MHC und co-stimulatorische Moleküle exprimierten, welche die Sekretion von IL-12 initiierten. Das Zusammenspiel der genannten Faktoren induzierte eine verstärkte CD4 und CD8 T-Zellantwort in den Lungen dieser Mäuse. Dies wiederum resultierte im TNF- und TRAIL abhängigen programmierten Zelltod der B16-F10 Melanomzellen in den Lungen der EBI-3 defizienten Mäuse, wohingegen sowohl weitere anti-apoptotische Mechanismen als auch T regulatorische Zellen keinen Einfluss auf die in den EBI-3 defizienten Mäusen beobachtete Tumorabwehr zu spielen scheint. Schlussendlich konnten EBI-3 defiziente CD8+ T-Zellen, welche zuvor mit Tumorantigen geprimed wurden, adoptiv in B6 Wildtypmäuse transferiert werden, was zeigte, dass diese Zellen in der Lage sind, die Tumormasse in den Empfängermäusen signifikant zu verringern. Zusammengefasst, demonstrieren diese Daten, dass das Blockieren von EBI-3 im metastasierenden Melanom ein vielversprechender Angriffspunkt in der Tumortherapie darstellt.

Funktionelle Bedeutung von P-Glykoprotein für Wirkungen und Nebenwirkungen von Antipsychotika

Therapeutisches Drug Monitoring (TDM) ist eine Maßnahme, bei der durch Messung der Medikamentenspiegel im Blut die Dosis ermittelt wird, bei der mit höchster Wahrscheinlichkeit mit Therapieansprechen gerechnet werden kann. Dabei wird angenommen, dass die Konzentrationen im Blut mit denen im Wirkkompartiment korrelieren. Für Antipsychotika wurde gezeigt, dass die Konzentrationen im Blut direkt mit denen im Gehirn korrelieren, die Verteilung zwischen den beiden Kompartimenten ist jedoch für die verschiedenen Antipsychotika sehr unterschiedlich. Die Distribution von Arzneistoffen zwischen Blut und Gehirn wird durch Effluxtransporter in der Blut-Hirn-Schranke kontrolliert. Welche Rolle dabei P-Glykoprotein (P-gp) für die Verteilung von atypischen Antipsychotika spielt und wie die Pharmakokinetik und –dynamik durch diesen Transporter beeinflusst werden, sollte in dieser Arbeit untersucht werden. Für die Messung des neu eingeführten Antipsychotikums Aripiprazol, sowie für seinen aktiven Metaboliten Dehydroaripiprazol, wurde eine hochleistungsflüssigchromatographische (HPLC) Methode mit Säulenschaltung und spektrophotometrischer Detektion etabliert. Die Methode wurde für die Messung von Serumproben schizophrener Patienten eingesetzt, um einen therapeutischen Bereich für Aripiprazol zu ermitteln. Aus der Analyse von 523 Patientenproben wurde herausgefunden, dass Aripiprazol-Serumkonzentrationen von 150 bis 300 ng/ml mit gutem klinischen Ansprechen und einem geringen Risiko für Nebenwirkungen einhergingen. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Serumspiegel bei gleichzeitiger Gabe von Inhibitoren und Induktoren der Cytochrom P450 (CYP) Isoenzyme CYP2D6 und CYP3A4 erhöht bzw. gesenkt wurden. Am Modell der P-gp Knockout Maus im Vergleich zu FVB Wildtyp Mäusen wurden Konzentrationsverläufe von Antipsychotika nach i.p. Gabe von Amisulprid, Aripiprazol, Dehydroaripiprazol, Clozapin, Desmethylclozapin, Haloperidol, Olanzapin, Quetiapin, Risperidon und 9-Hydroxyrisperidon sowie der Kontrollsubstanz Domperidon im Gehirn und Blut über 24 Stunden mittels HPLC-Methoden gemessen. Welchen Einfluss eine verminderte Expression von P-gp auf die Pharmakodynamik hat, wurde in zwei Verhaltenstests untersucht. Mit Hilfe des Rotarods wurden motorische Effekte der Arzneistoffe erfasst und mittels Radial Arm Water Maze kognitive Fähigkeiten. Risperidon und sein aktiver Metabolit 9-Hydroxyrisperidon waren die stärksten Substrate von P-gp. 10-fach höhere Konzentrationen im Gehirn der P-gp Knockout Mäuse führten zu 10-fach stärkeren Beeinträchtigungen in den pharmakodynamischen Untersuchungen im Vergleich zu Wildtyp Tieren. Amisulprid, Aripiprazol, Dehydroaripiprazol, Desmethylclozapin und Quetiapin konnten ebenfalls als Substrate von P-gp identifiziert werden. Olanzapin, Haloperidol und Clozapin wurden durch P-gp wenig bzw. nicht in ihrer Pharmakokinetik und –dynamik beeinflusst. Da P-gp von Nagern und Menschen nach derzeitiger Kenntnis in ihren Substrateigenschaften weitgehend übereinstimmen, muss bei einer Behandlung von schizophrenen Patienten mit Antipsychotika, die als Substrate von P-gp identifiziert wurden, davon ausgegangen werden, dass eine Veränderung der Expression oder Aktivität von P-gp, genetisch verursacht oder durch Medikamente bedingt, für das Therapieansprechen oder das Auftreten von Nebenwirkungen bedeutsam sind.

Zelluläre Kontrolle adulter Neurogenese - Expression und Funktion des VEGF-Rezeptor-1 (Flt-1) im adulten Säugerhirn

Neurale Stammzellen sind im adulten Säugerhirn in der Subventrikulären Zone (SVZ) der Lateralventrikel und dem Hippokampus lokalisiert. In der SVZ entstandene neurale Zellen migrieren entlang eines von Astrozyten umgebenen Pfades, dem Rostralmigratorischen Strom (RMS), zum Olfaktorischen Bulbus (OB), wo sie zu olfaktorischen Interneuronen differenzieren. Vaskuläre Wachstumsfaktoren, wie VEGF-A beeinflussen die adulte Neurogenese. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmalig detailliert die spezifische Expression des VEGF-Rezeptor-1 (VEGFR-1) in den Regionen olfaktorischer und hippokampaler Neurogenese des adulten ZNS. Die Ergebnisse zeigen, dass VEGFR-1 im adulten Hirn hauptsächlich in GFAP-positiven Zellen in der SVZ, dem RMS, dem OB, dem Corpus callosum und dem Hippokampus exprimiert ist. In vivo-Analysen transgener Mäuse (Flt-1TK-/-), denen die Signaltransduktionsdomäne des VEGFR-1 fehlt, demonstrieren hier erstmals eine Rolle des VEGFR-1 in adulter Neurogenese. Flt-1TK-/- weisen eine erhöhte Proliferation neuronaler Vorläuferzellen der SVZ auf. Im RMS ist jedoch 6 Tage nach BrdU-Administration die Anzahl markierter Zellen im Vergleich zum Wildtyp (wt) um 47,97% reduziert, ohne dass es zu einer Akkumulation in der SVZ kommt. Zusammen mit der in Kulturversuchen stark erhöhten Migrationsgeschwindigkeit von Neuroblasten der Flt-1TK-/- und einer verminderten Abwanderung von Zellen aus dem RMS ins Corpus callosum der Flt-1Tk-/-, weist dies auf eine gesteigerte Migration zum OB hin. Tatsächlich war der OB der Flt-1TK-/-, vor allem die Plexiform- und Periglomerulärzellschicht (PGL), signifikant vergrößert. Im OB der transgenen Tiere migrieren zudem signifikant mehr BrdU-markierte Zellen in die PGL. Dort differenzieren signifikant mehr Neurone als im wt. Subtypisierungen zeigen, zudem eine erhöhte Differenzierung in dopaminerge Interneurone in der PGL der Flt-1TK-/-. Im Gehirn Flt-1TK-/- war die Konzentration von VEGF-A erhöht. Intrazerebroventrikuläre Infusion von VEGF-A in wt-Tiere erbrachte den eindeutigen Nachweis, dass die Erhöhung der VEGF-A-Konzentration im Gehirn der Flt-1TK-/- ursächlich für die in diesen Tieren beobachtete Reduktion der BrdU-positiven Zellen im RMS ist. Dies ist gleichzeitig der erste Nachweis einer Wirkung von VEGF-A auf Neuroblasten im RMS in vivo unter physiologischen Bedingungen. Die erhöhte VEGF-A-Konzentration könnte auch den anderen hier dargelegten Effekten zugrunde liegen. VEGFR-1 ist somit ein regulatorischer Faktor für die adulte olfaktorische Neurogenese und spielt eine potentielle Rolle in der Differenzierung dopaminerger Interneurone.

Genetische und funktionelle Analyse von Vesikelmembranprotein-Mutanten in Maus und Caenorhabditis elegans

Tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) sind konservierte, ubiquitär vorkommende Membranproteine synaptischer Vesikel und zytoplasmatischer Transportvesikel. Bei Säugetieren lassen sie sich in die Physine, Gyrine und SCAMPs (secretory carrier-associated membrane proteins) unterteilen, die im Nematoden C. elegans jeweils nur durch ein einzelnes Polypeptid vertreten sind (Synaptophysin-1 [SPH-1], Synaptogyrin-1 [SNG-1] und SCAMP-1 [SCM-1]). Obwohl den TVPs eine Beteiligung bei der Regulation des Vesikelzyklus zugesprochen wurde, sind Synaptophysin-1-Knockout-Mäuse und vollständig TVP-defiziente Würmer gesund und weisen nur geringgradige Veränderungen auf. In dieser Arbeit sollten daher zum einen genomweite komparative Transkriptomanalysen durchgeführt werden, um mögliche Kompensationsmechanismen in der Maus und C. elegans zu finden, zum anderen sollten mit Hilfe pharmakologischer Stressassays und genetischer Verfahren Schwachstellen und Redundanzen identifiziert werden. Erstaunlicherweise konnten durch Affymetrix GeneChip-Analysen der RNA in der Retina von Synaptophysin-1-/--Mäusen keine differenziell exprimierten Gene gefunden werden. Bei der Untersuchung der C. elegans-TVP-Dreifachmutante wurden hingegen 17 Gene mit erhöhter und 3 mit erniedrigter Transkription identifiziert. Die Befunde für 12 hochregulierte Gene wurden durch quantitative Real-Time RT-PCR bestätigt. Das am stärksten hochregulierte Gen arf-1.1 kodiert für eine GTPase, die vermutlich an der Regulation der Vesikelbildung beteiligt ist. Von den ebenso identifizierten Genen cdr-2, cdr-4 und pgp-9 ist bekannt, dass sie in Stresssituationen, z. B. in Gegenwart von Cadmium, verstärkt transkribiert werden. ugt-62 und ugt-19 kodieren für Glucuronosyltransferasen. Für arf-1.1, cdr-2, ugt-62 sowie für das Gen T16G1.6, das für eine coiled-coil-Domäne kodiert, wurden im Folgenden fluoreszierende Promoterkonstrukte hergestellt, um Koexpressionsmuster mit TVPs zu bestimmen. Es stellte sich heraus, dass alle vier Promoterkonstrukte im Darm zusammen mit SPH-1 und SCM-1 im Darm transkribiert werden. Mit fluoreszierenden Translationschimären konnte weiterhin gezeigt werden, dass ARF-1.1 und CDR-2 mit den Darm-spezifischen TVPs im apikalen Bereich der Darmzellen kolokalisieren. Um mehr über die Funktion von TVPs im Vesikelzyklus zu erfahren, wurden pharmakologische und genetische Analysen von Würmern durchgeführt, in denen die Expression des Neuronen-spezifischen SNG-1 verändert ist. Deletion oder Überexpression führte zu einer Resistenz gegenüber dem Acetylcholinesterase-Inhibitor Aldicarb und zu erhöhter Empfindlichkeit gegenüber dem GABA-Rezeptor-Antagonisten Pentylentetrazol. Auf genetischer Ebene zeigte sich, dass sng-1 synthetisch mit den Genen für Synaptotagmin-1, Endophilin A sowie Synaptojanin wirkt. Die beobachteten Effekte weisen auf alternative Funktionen in der synaptischen Übertragung hin und unterstützen zugleich die Hypothese, dass SNG-1 im synaptischen Vesikelzyklus eine wichtige Funktion erfüllt, die möglicherweise einem noch unbekannten redundanten Kompartiment-spezifischen Signalweg der synaptischen Transmission zuzuordnen ist.

Elektrophysiologische, molekularbiologische und verhaltensbiologische Untersuchungen zur Funktion von N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren bei Gehirnentwicklung und Lernvorgängen

Im Zentralnervensystem der Säuger steuern N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren viele neuronale Prozesse, insbesondere während der Ontogenese sowie bei Lern- und Gedächtnisvorgängen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung dieser Rezeptoren während der Kortexentwicklung und bei Lernvorgängen mittels elektrophysiologischer, molekularbiologischer, pharmakologischer, histologischer, genetischer und verhaltensbiologischer Methoden an der Maus untersucht. Oszillatorische Netzwerkaktivität ist für die gesunde Entwicklung des Kortex essentiell. Mittels gepaarter patch-clamp Experimente an neonatalen Subplattenzellen wurde festgestellt, dass diese Neurone elektrisch gekoppelt sind. Damit könnten sie einen wichtigen Beitrag zur Entstehung bzw. Verstärkung von Netzwerkoszillationen leisten. Subplattenzellen erhalten afferenten Eingang aus dem Thalamus sowie von benachbarten Subplattenzellen. Die funktionellen und molekularen Eigenschaften dieser Synapsen differierten in eingangsspezifischer Weise. Subplatteninterne Verbindungen besaßen Integrations- und Summationsfähigkeiten, wenig synaptische Ermüdung, Paarpulsfazilitierung und einen erhöhten NR2D-Anteil in ihren NMDA-Rezeptoren. CA1-Pyramidenzellen des adulten Hippocampus zeigten eine den Subplattenzellen vergleichbare eingangsspezifische Verteilung der NMDA-Rezeptor-Untereinheiten. Synapsen von Schaffer-Kollateralen besaßen einen höheren NR2B-Anteil als temporo-ammonische Verbindungen. Die Aktivierung von Dopamin-Rezeptoren potenzierte NR2B-vermittelte synaptische Ströme in CA1-Neuronen. Bei komplexen Lernvorgängen, wie der Extinktion einer traumatischen Erinnerung, spielten NMDA-Rezeptoren von hippocampalen CA1-Zellen eine entscheidende Rolle. CA1-NMDA-Rezeptor-ko-Mäuse zeigten erhebliche Extinktionsdefizite nach Angstkonditionierung. Zudem entwickelten diese Mäuse erhöhte Ängstlichkeit und Hyperaktivität. Das sind beim Menschen Symptome für psychiatrische Angststörungen. Daher könnten CA1-NMDA-Rezeptor-ko-Mäuse als neues Tiermodell für solche Störungen dienen, die durch ein traumatisches Erlebnis ausgelöst werden, wie beim Posttraumatischen Stresssyndrom (PTSD).

Der Transkriptionsfaktor NFATc2 ist essentiell für die Funktion von Mastzellen in vivo

Neueste Arbeiten zeigen, dass Mastzellen wichtige Funktionen innerhalb des angeborenen und erworbenen Immunsystems ausüben. Von zentraler Bedeutung ist hierbei die Fähigkeit der Mastzelle, auf IgE-unabhängige Signale zu reagieren und ein breites Spektrum an Cytokinen und Chemokinen zu produzieren. Transkriptionsfaktoren der NFAT-Familie sind wichtige Regulatoren der Immunhomöostase und Cytokinproduktion. In Mausmodellen führt die Defizienz des NFATc2 zu überschießenden Immunreaktionen, was ursächlich auf die Hyperreaktivität NFATc2-defizienter T-Zellen zurückgeführt wird. Demgegenüber zeigten unsere eigenen in vitro durchgeführten Arbeiten, dass die Produktion wichtiger entzündungsfördernder Cytokine in Mastzellen abhängig ist von NFATc2. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Bedeutung von NFATc2 in einem Mastzell-abhängigen Modell der transkutanen Immunisierung mit einem TLR7-Liganden als Adjuvans zu untersuchen. Experimente an NFATc2-defizienten Mäusen ergaben zunächst, dass die Schlüsselprozesse Entzündung, Auswanderung antigenpräsen-tierender Zellen, Lymphknotenhypertrophie sowie Expansion und Funktion spezifischer T-Zellen in Abwesenheit des Transkriptionsfaktors NFATc2 extrem beeinträchtigt sind. Dieser experimentell induzierte Phänotyp gleicht somit dem mastzellloser Mäuse in dieser Immunisierungsstudie. Rekonstitutionsexperimente erlaubten es, in vitro generierte Mastzellen aus NFATc2-defizienten und NFATc2-kompetenten Spendern in mastzelllose Mäuse zu transferieren und deren Reaktivität in dem angewandten TLR7-abhängigen Entzündungsmodell in vivo zu vergleichen. Hierbei zeigte sich, dass die in NFATc2-defizienten Mäusen nach transkutaner Immunisierung zu beobachtenden Beeinträchtigungen gänzlich auf die Abwesenheit des NFATc2 in Mastzellen zurückzuführen sind. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen somit, dass der Transkriptionsfaktor NFATc2 für die Funktion der Mastzelle in vivo eine bedeutsame Rolle spielt. Dies betrifft sowohl Reaktionen des angeborenen als auch des erworbenen Immunsystems. Darüber hinaus könnte NFATc2 ein wichtiges Ziel bei therapeutischen Maßnahmen gegen mastzellabhängige Krankheiten darstellen.

Transkriptionelle Kontrolle der Entwicklung und Funktion natürlich vorkommender CD4 + CD25 + regulatorischer T-Zellen

CD4+CD25+ natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen (nTregs) repräsentieren in Menschen und Mäusen etwa 5-10% aller peripheren CD4+ T-Zellen und besitzen eine wichtige Aufgabe im Immunsystem. nTregs sind entscheidend an der peripheren Toleranz beteiligt, da sie potenziell autoaggressive T-Zellen in ihrer Cytokinproduktion und Proliferation hemmen. Trotzdem ist der molekulare Mechanismus der nTreg-vermittelten Suppression und der Entwicklung dieser nTregs noch weitestgehend unbekannt. Vor einigen Jahren wurde der Transkriptionsfaktor FoxP3 (Forkhead Box P3) als der „Hauptregulator“ für die Entwicklung und Funktion von nTregs identifiziert. Um die suppressiven Fähigkeiten von nTregs optimal für therapeutische Zwecke einsetzen zu können, ist es daher von großer Notwendigkeit den zugrundeliegenden molekularen Mechanismus zu verstehen und Moleküle zu identifizieren, die an der Regulation des nTreg-spezifischen Faktors FoxP3 beteiligt sind. Ein Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der microRNA155 (miR155) bei der nTreg-vermittelten Suppression. Es konnte gezeigt werden, dass die ektopische Expression der miR155 in konventionellen CD4+ T-Zellen zu einer Erhöhung der IL-2 Produktion führte, so dass die Zellen resistenter gegenüber der nTreg-vermittelten Suppression wurden. Die transiente Aufhebung der Suppression durch die miR155 bietet somit einen möglichen therapeutischen Einsatz bei der Behandlung von Tumorerkrankungen. Weiterhin konnte in dieser Arbeit demonstriert werden, dass der Transkriptionsfaktor HELIOS, oder vielmehr seine lange Isoform, HELIOS_long, eine entscheidende Rolle bei der Regulation der FoxP3 Expression einnimmt. Im Vergleich zu konventionellen CD4+ T-Zellen exprimieren nTregs hohe Mengen an HELIOS. In in vitro Studien zeigte sich, dass endogenes HELIOS in nTregs an den FoxP3 Promotor binden und diesen aktivieren kann. Die ektopische Expression von HELIOS_long führte in konventionellen CD4+ T-Zellen (HELIOSlowFoxP3-) nur in Gegenwart der Cytokine IL-2 und TGF-β zu einer gesteigerten FoxP3 Promotor Aktivität. Neben der Aktivierung konnte auch eine gesteigerte FoxP3 Protein Expression detektiert werden. Diese in vitro Daten konnten auch in einem in vivo Mausmodell verifiziert werden. Der adoptive Transfer HELIOS_long transfizierter CD4+ T-Zellen (HELIOSlowFoxP3-) in T-Zell-defiziente Mäuse führte zu der Induktion FoxP3+ T-Zellen mit suppressiven Fähigkeiten sowohl ex vivo als auch in vivo. Zusammengefasst zeigte sich, dass der Transkriptionsfaktor HELIOS einen stark fördernden Einfluss auf die Expression von FoxP3 besitzt. Diese Beobachtung bietet eine Möglichkeit für die Induktion stabiler regulatorischer T-Zellen als therapeutischen Einsatz für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen.

Funktionelle Charakterisierung des TRPM5-Gens

In der vorliegenden Promotionsarbeit wurde der zur TRP (transient receptor potential)-Familie gehörende TRPM5-Kanal funktionell charakterisiert. Elektrophysiologische Analysen TRPM5-überexprimierender HEK 293-Zellen zeigten, dass TRPM5 einen Ca2+-aktivierbaren, nicht-selektiven Kationenkanal darstellt, der monovalente Ionen leitet. Die Aktivierung des TRPM5-Kanals hängt insbesondere von der Geschwindigkeit des intrazellulären Ca2+-Anstiegs ab. Somit stellt TRPM5 eine Komponente der zellulären Signaltransduktionskaskaden dar: Nach Rezeptoraktivierung induziert TRPM5 einen raschen, transienten Kationeneinstrom, der zur Depolarisation der Zellmembran führt. Die Expression der beiden humanen TRPM5-Spleißformen als TRPM5/EGFP-Fusionsproteine in HEK 293-Zellen zeigte eine vorwiegende Lokalisation in der Zellmembran. In elektrophysiologischen Analysen wurde nachgewiesen, dass TRPM5-short als TRPM5-Kanalblocker funktioniert. Für die funktionelle in vivo-Charakterisierung des TRPM5-Kanals wurde ein auf RNAi (RNA interference) basierendes, transgenes Trpm5-knock down-Mausmodell hergestellt. Obwohl in drei der vier etablierten Knock down-Mauslinien eine Trpm5-Herunterregulation in der Leber und/oder in der Zunge nachgewiesen werden konnte, zeigten alle Mäuse einen wildtyp-ähnlichen Phänotyp. Weiterführende Untersuchungen an den von Zhang et al. (Cell, 2003) hergestellten Trpm5-knock out-Mäusen offenbarten, dass Trpm5 für eine geregelte Glukosetoleranz essentiell ist. Insulinsekretionsanalysen mit isolierten Langerhans’schen Inseln dieser Mäuse zeigten, dass ohne Trpm5 eine beeinträchtigte Insulinsekretionskinetik in den pankreatischen Betazellen vorliegt. Somit stellt TRPM5 einen neuen Kandidaten für Erkrankungen wie Diabetes Typ 2 dar, die durch eine Fehlregulation der Insulinsekretion gekennzeichnet sind.

Die Rolle der Ubiquitin-Ligase Smurf2 in T-Lymphozyten bei der Entwicklung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

TGF-beta ist ein Schlüsselmolekül zellvermittelter Immuntoleranz. So spielt es neben seiner pleiotropen Rolle in Immunzellen auch bei der Tumorentwicklung eine große Rolle. Das TGF-beta hat bei der Tumorentwicklung eine duale Rolle. So dient es in frühen Phasen als Tumorsuppressor, währenddessen es in späten Phasen der Entwicklung als Tumorpromotor wirkt. Eine strikte Regulation des TGF-beta Signalweges ist daher für ein funktionierendes Immunsystem von essentieller Bedeutung. Die Ubiquitin Ligase Smurf2 ist dabei ein wichtiger negativ Regulator des TGF-beta Signalweges.In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Spleißform des Smurf2 (dE2Smurf2) aus murinen CD4+ T-Zellen isoliert werden, deren Funktion in vitro und in vivo in T-Lymphozyten untersucht worden ist. Für diese Spleißform konnte zudem eine humane Relevanz nachgewiesen werden. Mit Hilfe von Überexpressionen in Cos7 Zellen konnte eine veränderte Lokalisation der Smurf2 Spleißformen (WT und dE2) festgestellt werden. Dabei konnten lysosomale und endosomale Kompartimente bei der Kolokalisation mit dem dE2Smurf2 Konstrukt beobachtet werden. Das Spleißen des Exons2 führte dabei zu Änderungen der Topologie der N-terminalen C2-Domäne, wodurch sich eine veränderte Lokalisation in der Zelle beschreiben ließ. Mit der veränderten intrazellulären Verteilung erfuhr auch die Funktion der dE2Smurf2 Ubiquitin Ligase eine Änderung. So konnte überraschenderweise eine positive Signalinduktion des TGF-beta Signalweges beobachtet werden, was im Gegensatz zum beschriebenen WTSmurf2 stand. Durch eine Überexpression des dE2Smurf2 Proteins in T-Lymphozyten wurde der TGF-beta Signalweg in CD4+ und CD8+ Zellen positiv reguliert, dabei wurde der TGFbetaRII vermehrt exprimiert und gleichzeitig fand eine verstärkte Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3 nach TGF-beta Stimulation statt. Die transgenen T-Lymphozyten waren somit sensitiver gegenüber TGF-beta. Dies führte zur Hypothese, die durch Western Blot Analyse bestätigt werden konnte, daß das dE2Smurf2 nach Überexpression seine WT-Form bindet und dadurch degradiert. Die Degradation der Ubiquitin Ligase war dabei Smad7 abhängig. Zur Analyse des Einflusses der Ubiquitin Ligase dE2Smurf2 auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, sowie ihre Rolle bei der T-Zell Proliferation, konnte gezeigt werden, daß durch die höhere Sensitivität gegenüber TGF-beta naive T-Zellen unter Einfluß von TGF-beta und IL6 vermehrt in TH17 Zellen differenzierten. Zudem konnte gezeigt werden, daß die Proliferationsrate transgener naiver CD4+ T-Zellen bei geringen Mengen von TGF-beta starkt vermindert war. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß bei einer Differenzierung der naiven CD4+ T-Zellen in TH1 Zellen, diese signifkant weniger das proinflammatorische Zytokin INFγ produzierten.So zeigten in vivo Versuche, daß die transgenen Tiere in der Entwicklung von Kolorektalen Karzinomen protektiert waren. Sowohl im kolitisassiziierten Tumor Modell als auch bei der spontanen Entwicklung von Tumoren im APCmin Modell. Dies konnte zum einen auf eine deutlich verminderte Entzündung (geringere Produktion an Zytokinen durch verminderte Proliferation) des Darms und zum anderen durch eine stärkere Produktion an zytotoxischen Genen, wie Perforin, INFγ und Granzym B erklärt werden. Interessanterweise konnte jedoch im Transfer Kolitis Modell eher eine proinflammatorische Wirkung des dE2Smurf2 Proteins nachgewiesen werden. So wiesen die immundefizienten Mäuse, in denen die transgenen T-Zellen injiziert wurden, eine signifikant stärkere Kolitis auf als die Kontrollen. Dies konnte mit einer Überproduktion an IL17 sezernierenden T-Zellen erklärt werden. Klonierungsexperimente führten zudem zur Identifikation einer bisher nicht beschriebenen nicht kodierenden RNA. Diese zeigte in Kombination mit dem dE2Smurf2 Protein in einer Reportergen Analyse eine Hyperaktivierung des Smad3 Promotors. Diese Daten liefern zum einen ein genaueres Modell über die Regulation des TGF-beta Signalweges sowie wichtige Erkenntnisse zur Pathophysiologie chronisch entzündlicher Darmerkrankung und daraus resultierende Tumorerkrankungen. So entwickelt sich das dE2Smurf2, Teil des TGF-beta Signalweges, als attraktives Zielprotein für die Modulation von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und (kolitisassoziierte) Kolonkarzinomen.

The role of B cells during acute and latent infections with murine cytomegalovirus and Leishmania major

This thesis focuses on the role of B cells in mCMV and Leishmania major infection. B cells are an essential component of the adaptive immune system and play a key role in the humoral immune response. In mCMV infection we analyzed the influence of B cells on the virus-specific CD8 T cell response, in detail the role of B cells as IL-10 secreting cells, as source of immunoglobulin (Ig) and as antigen presenting cells. In Leishmania major infection we investigated the role of Ig in Th1 and Th2 directed disease.rnWe found in mCMV infection that the B cell secreted IL-10 suppresses effectively the acute virus-specific CD8 T cell response, while the IL-10 secreted by dendritic cell has no obvious effect. Ig has no effect in the acute virus-specific CD8 T cell response, but in memory response Ig is essential. If Ig is missing the CD8 T cell population remains high in memory response 135 days post infection. The complete absence of B cells dramatically reduces the acute virus-specific CD8 T cell response, while B cell reconstitution just partially rescues this dramatic reduction. A comparison of this reduction in a B cell free organism to an organism with depleted dendritic cells gave a similar result. To exclude a malfunction of the CD8 T cells in the B cell deficient mice, the decreased virus-specific CD8 T cell population was confirmed in a B cell depletion model. Further, bone marrow chimeras with a B cell compartment deficient for CD40-/- showed a decrease of the virus-specific response and an involvement of CD40 on B cells. Taken together these results suggest a role for B cells in antigen presentation during mCMV infection.rnFurther we took advantage of the altered mCMV specific CD8 T cell memory response in mice without Ig to investigate the memory inflation of CD8 T cells specific for distinct mCMV specifc peptides. Using a SIINFEKL-presenting virus system, we were able to shorten the time until the memory inflation occurs and show that direct presentation stimulates the memory inflation. rnIn Leishmania major infection, Ig of Th2 balanced BALB/c mice has a central role in preventing a systemic infection, although the ear lesions are smaller in IgMi mice without specific Ig. Here the parasite loads of ears and spleen are elevated, and an IMS-reconstitution does not affect the parasite load. In contrast in Th1 balanced C57BL/6 mice, reconstitution of IgMi mice with serum of either untreated or immunized mice decreased the parasite load of spleen and ear, further IMS treatment reduces the size of the spleen and the cytokine-levels of IL-10, IL-4, IL-2 and IFN-γ to a level comparable to wt mice. rn

Die Rolle von Interleukin-22 bei Asthma bronchiale

Interleukin (IL)-22 ist ein Effektorzytokin, das von Zellen des Immunsystems produziert wird und auf Epithelzellen wirkt. Es nimmt eine duale Rolle ein, indem es abhängig vom Gewebe und Zytokinmilieu entweder entzündungsfördernden oder entzündungshemmenden Einfluss ausübt. Über seine Wirkung bei Asthma bronchiale ist bislang noch wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit konnten in einem murinen Modell der allergischen Atemwegsentzündung lymphoide Zellen des angeborenen Immunsystems als Hauptproduzenten für IL-22 detektiert werden, die bislang noch nicht im Zusammenhang mit Asthma bronchiale beschrieben wurden. Es konnte gezeigt werden, dass IL-22- defiziente Mäuse eine verstärkte Atemwegsentzündung entwickelten und sich die IL-22-Defizienz in diesem Modell entzündungsfördernd auf die induzierte Atemwegsentzündung auswirkte. Mit Hilfe einer murinen bronchialen Epithelzelllinie wurden die Mechanismen des IL-22 und die Expression Asthma-relevanter Mediatoren untersucht. Der beobachtete inhibierende IL-22-Effekt ließ sich mit Hilfe seines natürlichen Antagonisten IL-22BP neutralisieren. Diese entzündungshemmende Wirkung des IL-22 konnte ebenfalls in Wildtyp-Mäusen, denen rekombinantes IL-22 intratracheal verabreicht worden war, bestätigt werden.