Regulation der Zeaxanthin- und der Diatoxanthin-Epoxidase in Chlorophyll a/b- und Fucoxanthin-Chlorophyll a/c-haltigen Pflanzen

In der vorliegenden Arbeit wird der Vx-Zyklus und der Ddx-Zyklus unterschiedlicher Pflanzen hinsichtlich ihrer Regulation untersucht. Es konnte an Hand von in vivo Messungen gezeigt werden, dass bei zwei Kieselalgen unterschiedlicher Ordnung (Pennales bzw. Centrales) und einer Haptophyte mit Ddx-Zyklus die Dtx-Epoxidase delta-pH-reguliert ist. Im Gegensatz dazu steht die nicht-regulierte Zx-Epoxidase des Vx-Zyklus einer Raphidophyceae, einer Grünalge und einer aquatischen Höheren Pflanze. Es konnte gezeigt werden, dass der Grund für diese unterschiedliche Regulation der beiden Epoxidasen die verschiedenen Quench-Eigenschaften der Pigmente Dtx bzw. Zx ist. Durch parallele Messungen des NPQ und des De-Epoxidierungsgrads wurde deutlich, dass Zx zum Aufbau eines Quenching direkt den im Licht aufgebauten delta-pH benötigt, während Dtx alleine ausreichend ist, um ein Quenching zu verursachen. Bei diesen in vivo Messungen wurde außerdem deutlich, dass die Aktivitäten der untersuchten Epoxidasen große Unterschiede aufweisen. Diese sind abhängig von der entsprechenden Pigmentierung des jeweiligen Lichtsammelsystems, stehen also in Zusammenhang mit den Carotinoidbiosynthesen. Es konnte gezeigt werden, dass bei allen untersuchten Organismen, die eine Xanthophyll-dominierte Antenne mit Fx als Massenpigment enthielten, die Umsatzraten der Epoxidase sehr hoch waren, im Gegensatz zu Chl-dominierten Antennen. Nach diesen Erkenntnissen wurde die Dtx-Epoxidase weiter untersucht und so erstmalig durch Western-Blotting identifiziert. Es ergaben sich, allerdings erst nach zusätzlicher Proteinstabilisierung, zwei Signale, eins bei 60 kDa, das andere bei 57 kDa. Hierbei ist nach wie vor unklar, warum das Antiserum zwei Signale lieferte und ob es sich dabei um Isoformen, um anderweitige Modifizierungen, oder um eine Kreuzreaktion handelt. Auch der Mechanismus der delta-pH-Regulation der Dtx-Epoxidase konnte trotz in vivo und in vitro durchgeführter Studien nicht endgültig geklärt werden. Allerdings konnten verschiedene Mechanismen, wie z.B. eine direkte pH-Abhängigkeit des Enzyms, eine Regulation durch Reduktion und Oxidation oder durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung, auf Grund der Daten falsifiziert werden. Es konnte schließlich die Regulation mit Hilfe eines transmembranen Rezeptors als das einzige, mit allen Daten konsistente Regulationsmodell vorgeschlagen werden.

Elektrophysiologische Charakterisierung und PKC-vermittelte Regulation des humanen Transporters für basische Aminosäuren hCAT-1

ZusammenfassungDer humane kationische Aminosäure-Transporter hCAT-1 (CAT für cationic amino acid transporter) gehört zur Familie der Na+- und pH-unabhängigen Transporter für basische Aminosäuren (BAS). Die vorliegende Arbeit befasst sich mit unterschiedlichen Aspekten des hCAT-1-vermittelten Transportes, die in zwei Teilabschnitten behandelt werden. Im ersten Abschnitt wurden die Transporteigenschaften von hCAT-1-exprimierenden X. laevis-Oozyten mit Hilfe von elektrophysiologischen Methoden untersucht und mit denen der Isoformen hCAT-2A und -2B verglichen. Dabei zeigte sich, dass es durch die Expression von hCAT-2A und -2B in Oozyten zur Bildung eines BAS-Potentiales kommt, jedoch nicht durch die Expression von hCAT-1. Hierfür dürfte die hohe Transstimulierbarkeit des hCAT-1-Proteins verantwortlich sein. Obwohl das Membranpotential einer Zelle die Akkumulation von BAS durch die hCAT-Proteine beeinflusst, war bei sehr hohen extrazellulären BAS-Konzentrationen die Akkumulation durch hCAT-1 und -2B im Gegensatz zu hCAT-2A nicht vom Membranpotential abhängig, da unter diesen Bedingungen der Efflux limitierend wirkte. Mit Hilfe der voltage clamp-Methode wurden die L-Arginin-induzierten Maximalströme (Vmax) und die Leitfähigkeiten der hCAT-Proteine bestimmt. Die so ermittelten Vmax-Werte sind nur halb so groß wie die durch Flux-Studien bestimmten. Daher muss von einem Gegentransport an positiver Ladung (Substrat) ausgegangen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die hCAT-Isoformen zwei unterschiedliche Leitfähigkeitszustände für BAS besitzen, die von der intrazellulären BAS-Konzentration abhängig sind. Eine Leitfähigkeitszunahme durch Zugabe von extrazellulärem L-Arginin konnte bei allen hCAT-Isoformen in depletierten Oozyten beobachtet werden. In BAS-beladenen Oozyten führte die Zugabe von L-Arginin dagegen zu keiner (hCAT-1 und hCAT-2B) bzw. zu einer geringen (hCAT-2A) Zunahme der Leitfähigkeit der Transporter. Im Substratgleichgewicht jedoch nahm die Leitfähigkeit der drei untersuchten hCAT-Isoformen in Abhängigkeit von der Substratkonzentration zu. Überraschenderweise wurden für die untersuchten hCAT-Isoformen Leck-Ströme in Abwesenheit von BAS nachgewiesen. An hCAT-2B-exprimierenden Oozyten wurde eine erhöhte Leitfähigkeit für K+-Ionen gezeigt. Die physiologische Bedeutung dieser Kanalfunktion ist jedoch noch völlig ungeklärt. Im zweiten Abschnitt wurde der Mechanismus der Proteinkinase C (PKC)-vermittelten Inhibition der hCAT-1-Transportaktivität untersucht. Hierfür wurden hCAT-1.EGFP-Konstrukte in Oozyten und in U373MG Glioblastom-Zellen exprimiert. Mit Hilfe konfokaler Mikroskopie und Western-Blot-Analysen von biotinylierten Zelloberflächen-Proteinen wurde gezeigt, dass die PKC-vermittelte Reduktion der hCAT-1-Transportaktivität auf einer Reduktion der hCAT-Expression an der Zelloberfläche beruht. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit dem endogen in humanen DLD-1 Kolonkarzinom-Zellen exprimierten hCAT-1 erzielt. Der PKC-Effekt war auch noch nach Entfernung der putativen PKC-Erkennungsstellen am hCAT-1-Protein vorhanden. Daher reguliert die PKC die hCAT-1-Transportaktivität vermutlich über einen indirekten Mechanismus, d. h. nicht über eine direkte Phosphorylierung des hCAT-1-Proteins. Die Veränderung der Zelloberflächenexpression stellt einen neuen Regulationsmechanismus für die CAT-Proteine dar, der erklären kann, warum sich Modifikationen in der CAT-Proteinexpression oft nicht in entsprechenden Veränderungen der Transportaktivität widerspiegeln.