Regulation und funktionelle Bedeutung der zellulären und humoralen Immunantwort in der Pathogenese der chronischen Hepatitis C Virusinfektion

Patienten mit akuter, selbstlimitierender HCV-Infektion und solche mit IFN-a Therapieresponse (SCR) zeigten eine hochregulierte NS3-spezifische T-Helferzellantwort.Über die funktionelle Bedeutung der T-Helferzellantwort und der Antikörpersynthese besteht jedoch noch Unklarheit.In dieser Studie wurde die proliferative Antwort der PBMC von Patienten mit anhaltender Therapieresponse (SCR; n=8), Non-Respondern (NR; n=13) und unbehandelten HCV-Patienten(UTR; n=10) sowie gesunden Kontrollen (HC; n=5) auf die rekombinanten HCV-Antigene Core, Helicase, NS3, NS4 und NS5-4 bestimmt und ihre Sekretion von IFN-.

Therapeutic vaccination for chronic hepatitis B in the Trimera mouse model

Therapeutic vaccination for chronic hepatitis B in the Trimera mouse modelrnRaja Vuyyuru and Wulf O. BöcherrnHepatitis B is a liver disease caused by Hepatitis B virus (HBV). It ranges in severity from a mild illness, lasting a few weeks (acute), to a serious long-term (chronic) illness that can lead either to liver disease or liver cancer. Acute infection is self limiting in most adults, resulting in clearance of virus from blood and liver and the development of lasting immunity. However 5% of acutely infected patients do not resolve primary HBV infection, leading to chronic infection with persistent viral replication in the liver. The strength of the initial antiviral immune response elicited to Hepatitis B determines the subsequent clinical outcome. A strong and broad T cell response leads to spontaneous resolution. Conversely, a weak T cell response favours viral persistence and establishment of chronic disease. While treatments using interferon-alpha or nucleos(t)ide analogues can reduce disease progression, they rarely lead to complete recovery. The lack of a suitable small animal model hampered efforts to understand the mechanisms responsible for immune failure in these chronic patients.rnIn current study we used Trimera mice to study the efficacy of potential vaccine candidates using HBV loaded dendritic cells in HBV chronic infection in vivo. The Trimera mouse model is based on Balb/c mice implanted with SCID mouse bone marrow and human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from HBV patients, and thus contains the immune system of the donor including their HBV associated T cell defect.rnIn our present study, strong HBV specific CD4+ and CD8+ T cell responses were enhanced by therapeutic vaccination in chronic HBV patients. These T cell responses occurred independently of either the course of the disease or the strength of their underlying HBV specific T cell failure. These findings indicate that the Trimera mouse model represents a novel experimental tool for evaluating potential anti-HBV immunotherapeutic agents. This in vivo data indicated that both the HBV specific CD4+ cell and CD8+ responses were elicited in the periphery. These HBV specific T cells proliferated and secreted cytokines upon restimulation in Trimera mice. The observation that these HBV specific T cells are not detectable directly ex vivo indicates that they must be immune tolerant or present at a very low frequency in situ. HBV specific T cell responses were suppressed in Trimera mice under viremic conditions, suggesting that viral factors might be directly involved in tolerizing or silencing antiviral T cell responses. Thus, combination of an effective vaccine with antiviral treatment to reduce viremia might be a more effective therapeutic strategy for the future. Such approaches should be tested in Trimera mice generated in HBV or HBs expressing transgenic mice before conducting clinical trials.rn

Wirkmechanismen der trifunktionalen Antikörper catumaxomab und ertumaxomab in humanen Tumorsphäroid-Kokulturen

Ein neuer Ansatz der immunologischen Krebstherapie ist die Verwendung der bispezifischen, trifunktionalen Antikörper catumaxomab (anti-EpCAM x anti-CD3) und ertumaxomab (anti-Her2/neu x anti-CD3). Die Bispezifität besteht in der Bindung eines Tumor-assoziierten Antigens (EpCAM bzw. Her2/neu) und des CD3 Moleküls auf der Oberfläche von T-Zellen. Darüber hinaus stellt die Interaktion des Fc-Teils mit FcγRI/IIa/III positiven akzessorischen Immunzellen die dritte Funktion der Antikörper dar. Diese einzigartige Kombination ermöglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes. In klinischen Studien konnte bereits die Wirksamkeit beider Antikörper nachgewiesen werden. Die eigentlichen Wirkmechanismen der trifunktionalen Antikörper jedoch sind noch nicht ausreichend bekannt. Um die Wechselwirkung zwischen den stark EpCAM- und schwach Her2/neu-positive FaDu- sowie den stabil mit humanem Her2/neu transfizierten FaDu E593-Tumorzellen, peripheren Blutmonozyten (PBMC) und trifunktionalen Antikörpern systematisch zu untersuchen wurde ein 3D-Tumormodell, die so genannten multizellulären Tumorsphäroide (MCTS), angewandt. Als Endpunkte zur Beurteilung der Therapieeffizienz dienten das Volumenwachstum der Sphäroide, sowie die Klonogenität und die Zellvitalität. Zur Beurteilung der PBMC-Penetration in die Sphäroide erfolgten immunhistochemische Färbungen und molekularbiologische Nachweise der Abwehrzellantigene. Entsprechend wurden in den Sphäroiden die Proliferationsrate über eine Ki67-Färbung sowie die Apoptoserate über eine FragEL-Markierung identifiziert. Die Aktivität der PBMC wurde durch die Bestimmung ausgewählter Zytokine (ELISA) und der Zellzahl aus den Medienüberständen charakterisiert. Die an den FaDu- und E593-Sphäroiden erzielten Ergebnisse zeigten, dass catumaxomab und ertumaxomab eine konzentrations- und zeitabhängige Abnahme des Sphäroidvolumens bewirkten. Die Schrumpfung der Tumorsphäroide ging mit einer Reduktion des proliferativen und mit einer Steigerung des apoptotischen Tumorzellanteils einher. Die histologischen Befunde weisen darauf hin, dass die Volumenreduktion durch eine gesteigerte Anzahl infiltrierender Leukozyten bedingt ist. Auf verschiedenen Methoden basierende Analysen der Immunzellsubtypen zeigten eine dominierende Infiltration von zytotoxischen T-Zellen in die Tumorsphäroide. Der Aktivitätsnachweis der T-Zellen wurde über die Detektion der IL-2 mRNA und des sekretierten Zytokins erbracht. Einen zusätzlichen Hinweis auf eine zelluläre Immunantwort liefert das Zytokinmuster mit hohen Konzentrationen an IFN-γ. Der direkte Vergleich beider Antikörper zeigte, dass der anti-tumorale Effekt abhängig von der Antigenexpression auf den Tumorzellen war. Die Analyse von Medienüberständen wies auf eine mehrheitlich höhere Zytokinausschüttung in Gegenwart des Tumorantigens hin. Sphäroid-Kokulturen, die mit dem parentalen anti-EpCAM Antikörper behandelt wurden, zeigten keine Volumenreduktion. Im Gegensatz dazu führte der parentale CD3-Antikörper, das CD3- und Tumorzell-bindende catumaxomab F(ab')2 Fragment oder eine Kombination beider parentaler Antikörper zu einer anti-tumoralen Wirkung, die jedoch nicht so stark war wie die des trifunktionalen Antikörpers catumaxomab. Demnach ist für catumaxomab gezeigt, dass für die Effektivität des Antikörpers die Trifunktionalität unabdingbar ist. Daraus leitet sich ab, dass die Aktivierung der Abwehrzellen durch kostimulatorische Signale notwendig ist und über die Tumorantigenbindung Mechanismen wie ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) zum Tragen kommen. Die Experimente mit gleichzeitiger Gabe von trifunktionalen Antikörpern und Immunsuppressiva haben gezeigt, dass eine Kombination beider Agenzien möglich ist. Die Konzentrationen sind jedoch sorgfältig derart zu wählen, dass die Zytokinausschüttung und die damit verbundenen Nebenwirkungen reduziert sind, ohne dass die anti-tumorale Wirkung der Antikörper maßgeblich beeinflusst wird. T-Zellen bedienen sich nach Aktivierung für die rasche Proliferation einer gesteigerten aeroben Glykolyse. Unter Behandlung der Kokulturen mit catumaxomab konnte im Vergleich zu anderen immunstimulatorischen Agenzien die größte Steigerung der Laktatproduktion bzw. der Azidifizierungs- und Sauerstoffverbrauchsrate detektiert werden. Diese Effekte weisen auf eine metabolische Aktivierung der PBMC durch catumaxomab hin. Das von den Tumorzellen abgegebene Laktat kann die Immunzellen jedoch inhibieren. Daher wäre die Kombination mit Glykolyseinhibitoren ein möglicher Ansatz, um die Therapieeffizienz weiter zu steigern. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Komedikation der trifunktionalen Antikörper mit Chemotherapeutika zu einer gesteigerter Wirkung führte. Insgesamt liegt die Zukunft der Immuntherapien wohl in der Kombination mit anderen Wirkstoffklassen, die anti-tumorale Effekte verstärken oder immunsupprimierende Mechanismen inhibieren.

Entwicklung eines pharmakologischen Modells zur Prüfung immuntherapeutischer Antikörper mit dreidimensionalen Tumorzellkulturen in vitro

In den letzten Jahren hat die Tumorbehandlung mit immunologischen Präparaten an Bedeutung gewonnen. Der allgemeine Ablauf der Testung eines Arzneimittelkandidaten sieht vor, zunächst in Zellkulturversuchen und Tierversuchen Wirkweise und Sicherheit, sowie voraussichtliche Abbauwege und mögliche Gefahren so beurteilen zu können, dass sie für einen Einsatz im Menschen in Frage kommen. Zur präklinischen in vitro-Testung werden dabei in der Regel Monolayer-Zellkulturen oder Einzelzellsuspensionen eingesetzt. Der Einsatz von 3D-Zellkulturmodellen, welche den Aufbau von Mikrometastasen oder intervaskuläre Areale in Tumoren exakter widerspiegeln, führt zu wesentlich besseren Voraussagen bezüglich der klinischen Wirksamkeit neuer Präparate. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung und Anwendung eines neuen 3D-Zellkulturbasierten Systems zur Testung trifunktionaler bispezifischer Antikörper für die Tumorbehandlung, welches sich auch auf andere vergleichbare Präparate übertragen lässt.rnIn meiner Arbeit konnte ich mehrere humane Tumorzelllinien definieren, mit denen es gelang, stabile Co-Kulturen von Multi Cellular Tumour Spheroids (MCTS) mit Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) in miniaturisierten Spinner-Flaschen zu etablieren. Spinner-Flaschen, in denen die im Kulturmedium befindlichen Immunzellen, MCTS und Therapeutika ständig frei zirkulieren, sind besonders für eine wirklichkeitsnahe Nachbildung der in vivo-Simulation mit disseminierten Tumorzellen oder mit malignem Aszites geeignet. Diese Art der Kultivierung erlaubte Beobachtungszeiten von ≥20 Tagen für eine große Bandbreite Analysemethoden. Zu den mit dem erstellten Protokoll standardmäßig durchführbaren Analysemethoden zählen unter anderem immunhistochemische Färbungen an Sphäroid-Gefrierschnitten, Vitalitätstest, Untersuchung der Plattierungs-Effizienz, Bestimmung der Sphäroidvolumina, Zytokinbestimmungen aus dem Medienüberstand mit Cytokine Bead Arrays, PCR-Analysen immunzellspezifischer Antigene, sowie durchflusszytometrische Analysen. Diese Methodenkombination erlaubt einen sehr detaillierten Einblick in die Wirkweise und Effizienz neuer Immuntherapeutika aus verschiedensten Blickwinkeln und stellt ein reproduzierbares Testsystem zur präklinischen Testung von Immuntherapeutika dar, das zukünftig als Bindeglied zwischen Monolayer-Zellkulturen und klinischen Prüfungen einen festen Platz einnehmen könnte.rnMit dem beschriebenen 3D-Zellkultur-System wurden in der vorliegenden Arbeit die trifunktionalen bispezifischen Antikörper catumaxomab (unter dem Handelsnamen Removab® für die Behandlung maligner Ascites zugelassen) und ertumaxomab (derzeit in klinischen Prüfungen) hinsichtlich ihrer Wirkweise untersucht. Die Antikörper besitzen im Gegensatz zu herkömmlichen monoklonalen Antikörpern zwei verschiedene Bindungsarme, einer gegen CD3 auf T-Zellen, der zweite gegen EpCAM respektive Her2/neu - beides weit verbreitete Tumorantigene - gerichtet. An ihrem Fc-Teil besitzen sie eine dritte Bindungskapazität, über welche sie an Fcγ RI, -IIa und -III positive akzessorische Zellen binden. Diese Kombination ermöglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes aus T-Zelle, Tumorzelle und akzessorischer Zelle. Dies stellt eine wirkungsvolle Therapieoption unter Ausnutzung der körpereigenen, immunologischen Abwehr dar. rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass beide Antikörper eine Größenreduktion der Sphäroide mit den entsprechenden Tumorantigenen in gleichem Maße bewirkten und die Plattierungseffizienz durch ertumaxomab dosisabhängig reduziert wurde. Mit dem erstellten Testsystem konnte der Wirkmechanismus von catumaxomab auf Sphäroide der Zelllinie FaDu (Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom) detaillierter gezeigt werden: catumaxomab wirkte dosisabhängig auf die Reduktion der Sphäroidvolumina und die zunehmende Infiltration von CD45+ Zellen, die als T-, NK- und/oder dendritische Zellen identifiziert wurden. Des Weiteren rief die catumaxomab-Gabe eine verstärkte Ausschüttung der Zytokine IL-2, IFN-γ und TNF-α hervor. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass catumaxomab die zelluläre Immunantwort aktiviert.rnDie Standard-Tumorbehandlung beinhaltet die Gabe von Chemotherapeutika. Oft werden dafür Zytostatika mit dem unerwünschten Nebeneffekt auch gesunde proliferierende Zellen anzugreifen verwendet. Dies kann prinzipiell auch die Wirksamkeit der Antikörper-Therapie beeinflussen. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit zusätzlich vergleichende Kombinations-Versuche mit catumaxomab und einem gängigen Zytostatikum - Cisplatin - durchgeführt. Mit Untersuchungen der Sphäroidvolumina, Vitalitätstests und Plattierungseffizienz konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von catumaxomab bei gleichzeitiger Anwendung beider Therapeutika aufrecht erhalten bleibt und diese sogar additiv verstärkt wird. Eine Kombinationstherapie im Menschen ist daher denkbar.rnrn

Mass spectrometric identification of Varicella-Zoster Virus (VZV) proteins recognized by human T cells

Primary varicella-zoster virus (VZV) infection during childhood leads to varicella commonly known as chickenpox. After primary infection has occurred VZV establishes latency in the host. During subsequent lifetime the virus can cause reactivated infection clinically known as herpes zoster or shingles. In immunodeficient patients’ dissemination of the virus can lead to life-threatening disease. Withdrawal of acyclovir drug prophylaxis puts allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation (HSCT) patients at increased risk for herpes zoster as long as VZV-specific cellular immunity is impaired. Although an efficient live attenuated VZV vaccine for zoster prophylaxis exists, it is not approved in immunocompromised patients due to safety reasons. Knowledge of immunogenic VZV proteins would allow designing a noninfectious nonhazardous subunit vaccine suitable for patients with immunodeficiencies. The objective of this study was to identify T cell defined virus proteins of a VZV-infected Vero cell extract that we have recently described as a reliable antigen format for interferon-gamma (IFN-γ) enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assays (Distler et al. 2008). We first separated the VZV-infected/-uninfected Vero cell extracts by size filtration and reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). The collected fractions were screened for VZV reactivity with peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of VZV-seropositive healthy individuals in the sensitive IFN-γ ELISpot assay. Using this strategy, we successfully identified bioactive fractions that contained immunogenic VZV material. VZV immune reactivity was mediated by CD4+ memory T lymphocytes (T cells) of VZV-seropositive healthy individuals as demonstrated in experiments with HLA blockade antibodies and T cell subpopulations already published by Distler et al. We next analyzed the bioactive fractions with electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) techniques and identified the sequences of three VZV-derived proteins: glycoprotein E (gE); glycoprotein B (gB), and immediate early protein 62 (IE62). Complementary DNA of these identified proteins was used to generate in vitro transcribed RNA for effective expression in PBMCs by electroporation. We thereby established a reliable and convenient IFN-γ ELISPOT approach to screen PBMCs of healthy donors and HSCT patients for T cell reactivity to single full-length VZV proteins. Application in 10 VZV seropositive healthy donors demonstrated much stronger recognition of glycoproteins gE and gB compared to IE62. In addition, monitoring experiments with ex vivo PBMCs of 3 allo-HSCT patients detected strongly increased CD4+ T cell responses to gE and gB for several weeks to months after zoster onset, while IE62 reactivity remained moderate. Overall our results show for the first time that VZV glycoproteins gE and gB are major targets of the post-transplant anti-zoster CD4+ T cell response. The screening approach introduced herein may help to select VZV proteins recognized by memory CD4+ T cells for inclusion in a subunit vaccine, which can be safely used for zoster prophylaxis in immunocompromised HSCT patients.

Evaluation eines humanisierten Mausmodells der allergischen Atemwegsentzündung

Aus der zunehmenden Prävalenz allergischer Erkrankungen vor allem in den Industrienationen ergibt sich ein erhöhter Bedarf an Grundlagenforschung im Bereich von Allergie und Asthma sowie der Entwicklung innovativer Therapiestrategien. In der vorliegenden Dissertation wurden die immundefizienten Mausstämme NOD-Scid und NOD-Scid gc als vielversprechender translationaler Schritt zwischen dem reinen Tiermodell und der Erprobung neuer Therapieansätze an Probanden in klinischen Studien beleuchtet. Im experimentellen Verlauf der Arbeit wurde ein humanisiertes Mausmodell der allergischen Atemwegsentzündung zunächst in immundefizienten NOD-Scid und darauffolgend in NOD-Scid gc Mäusen etabliert. Diese Mausstämme zeichnen sich durch das Nichtvorhandensein von B- und T-Zellen aus. Im NOD-Scid gc Stamm resultiert aus einer zusätzlichen Mutation des Gens für die gamma-Kette des IL-2 Rezeptors der Verlust von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), was die Immunität in diesem Stamm weiter herabsetzt und eine Humanisierung erleichtert. Die Humanisierung der Mäuse erfolgte durch die intraperitoneale Injektion von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die unter Anwendung der Ficoll-Dichtezentrifugation aus dem Blut von Probanden isoliert wurden. Für die Gewinnung der PBMCs wurden zum einen Asthma-Patienten mit einer hochgradigen Sensibilisierung gegen Birkenpollen herangezogen. Zum anderen wurden in Kontrollexperimenten PBMCs nicht-allergischer Probanden verwendet. Während sich für den NOD-Scid Stamm 80 Millionen PBMCs als angemessene Transferzahl erwiesen, reichten für die Rekonstitution des NOD-Scid gc Stammes 5 Millionen PBMCs aus. Eine Analyse der Tiere erfolgte 24 Tage nach Injektion der humanen Zellen. Der Transfer der PBMCs allergischer Asthmatiker führte besonders nach additiver Applikation des Birkenallergens sowie des humanen rekombinanten Zytokins IL-4 und darauffolgender nasaler allergener Provokation zu einer starken pulmonalen Entzündung in den Mäusen. Die nasale Allergenprovokation an den Tagen 20-22 nach PBMC-Transfer erwies sich für das Aufkommen der Inflammation als unbedingt erforderlich. Die nasale Provokation mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mündete in einer herabgesetzten Inflammation ohne Ausprägung einer Atemwegsüberempfindlichkeit (AHR), reduzierten Zellzahlen in der bronchoalveolären Lavage (BAL) sowie verminderten Frequenzen humaner Zellen in den Lungen von Versuchstieren, die mit atopischen PBMCs supplementiert mit Birkenallergen und IL-4 rekonstituiert wurden. Die Allergenabhängigkeit des etablierten Modells wurde anhand von Experimenten untermauert, die verdeutlichten, dass ein Transfer von PBMCs nicht-allergischer Probanden trotz Zugabe des Allergens und humanem IL-4 keine Atemwegsinflammation auslöste. Bei den humanen Zellen, die an Tag 24 nach Rekonstitution in den Mäusen detektiert werden konnten, handelte es sich hauptsächlich um T-Zellen. Innerhalb dieser CD3+ T-Zellen konnten CD4+ und CD8+ T-Zellen differenziert werden. Depletionsexperimente, in denen nach Gewinnung der PBMCs aus dem Blut der Probanden verschiedene T-Zellsubpopulationen (CD3+, CD4+, CD8+) eliminiert wurden, führten zu dem Befund, dass die allergische Atemwegsentzündung in dem System von humanen CD4+ T-Zellen abhängig war. Nach der Etablierung des humanisierten Mausmodells der allergischen Atemwegsentzündung wurde das System zur Analyse des suppressionsfördernden Potentials des HIV-1 - Hüllproteins gp120 genutzt. Die Applikation von gp120 führte zu einer Reduktion der Atemwegsinflammation. Dies äußerte sich in einer Aufhebung der AHR, verminderten Zellzahlen in der BAL sowie dem reduzierten Einstrom humaner T-Zellen in die Lungen der rekonstituierten Tiere. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die anti-inflammatorische Wirkung des gp120 strikt von der Anwesenheit regulatorischer T-Zellen (Tregs) innerhalb der für die Humanisierung genutzten PBMCs abhängig war. Eine Depletion der Tregs vor Transfer in die Mäuse führte zum Verlust der anti-inflammatorischen Effekte des gp120. Diese Ergebnisse sprechen für die Modulation regulatorischer T-Zellen als hoffnungsvolle Maßnahme in der Behandlung allergischer Erkrankungen. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse eröffnen innovative Ansätze zur Analyse neuer Therapiestrategien in einem Testsystem, dass die Erforschung humaner Zellinteraktionen sowie die Wirkung potentieller Arzneistoffe auf humane Zellen unter in vivo Bedingungen erlaubt.

Untersuchung von T-Zell-vermittelten Immunantworten in der murinen und humanen kutanen Leishmaniasis

Für die Ausheilung von L. major-Infektionen ist eine effektive Th1-/Tc1-Antwort unerlässlich. Dennoch sind bis heute nicht alle Mechanismen der schützenden Immunabwehr beim Menschen und in der Maus endgültig geklärt. Deshalb bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit darin, Th1-/Tc1-Antworten und damit die Schnittstelle zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem eingehender zu untersuchen. Für diesen Ansatz wurde zunächst der Einfluss des genetischen Hintergrundes auf den Verlauf der Infektion anhand von BALB/c- und C57BL/6-Zellen analysiert. Als entscheidender Faktor für Heilung und Suszeptibilität wurde mit Hilfe von Knochenmarkschimären die Herkunft der T und/oder B Zellen identifiziert. Erst die Aktivierung durch Th1-/Tc1-Zellen versetzt L. major-infizierte Makrophagen in die Lage, die intrazellulären Parasiten abzutöten. In diesem Aktivierungsprozess spielt die TNF-induzierte Signalweiterleitung über den TNF-Rezeptor 1 (TNF-R1) eine wichtige Rolle. TNF-R1 ist mit dem Signalmolekül FAN assoziiert. In dieser Arbeit konnte anhand von Mäusen, denen FAN fehlt, die Involvierung dieses Moleküls in der Induktion eines Th1-Zytokinsprofils und in der Kontrolle der Parasitenzahl sowie der lokalen Begrenzung der Infektion gezeigt werden. Weiterhin wurde unter Verwendung immundefizienter Mäuse die Realisierbarkeit eines PBMC-Transfermodells geprüft. Ein solches wird zur Validierung an Mäusen gewonnener Erkenntnisse und als präklinisches Testsystem der humanen kutanen Leishmaniasis dringend benötigt. In allen getesteten Stämmen ließ sich durch den Transfer humaner PBMC die L. major-Infektion beeinflussen. Humane CD4+ und CD8+ T-Zellen waren an den Infektionsstellen präsent und es konnten antigenspezifische Immunreaktionen nnachgewiesen werden. Das PBMC-Transfermodell konnte durch die Transplantation humaner Haut auf immundefiziente Mäuse zusätzlich entscheidend verbessert werden. In diesen Transplantaten ließen sich L. major-Infektionen etablieren und durch zusätzlichen Transfer von PBMC die Zahl humaner CD45+ Zellen an der Infektionsstelle deutlich steigern. In ihrer Gesamtheit trägt die vorliegende Arbeit wesentlich zum Verständnis der Determinanten von Heilung und Suszeptibilität der kutanen Leishmaniasis bei und zeigt neue Ansatzpunkte für eine Beeinflussung des Krankheitsverlaufes auf. Die Etablierung eines präklinischen Testmodells der humanen Leishmaniasis ist entscheidend, um das Wissen über die murine Leishmaniasis auf die humane Erkrankung zu übertragen. So kann dem dauerhaften Problem der Entwicklung von Vakzinen an Mäusen, die keine Wirksamkeit gegen die humane Erkrankung zeigen, begegnet werden. Ein vollständig etabliertes Modell wird es ermöglichen, der humanen Erkrankung zugrundeliegende Mechanismen zu untersuchen und Patienten-spezifisch aber auch allgemeingültig Vakzinierungs-Ansätze und Therapien unter experimentellen Bedingungen zu testen.

HLA class II mismatch alleles as targets of the alloreactive CD4 T-cell response

In allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT), alloreactive T lymphocytes of donor origin mediate the beneficial graft-versus-leukemia effect but also induce graft-versus-host disease (GvHD). Since human leukocyte antigens (HLA) mismatch alleles represent major targets of alloreactive T lymphocytes, patient and donor are usually matched for the class I molecules A, B, C, and for the class II molecules DRB1 and DQB1, in order do reduce the risk of GvHD. The HLA-DPB1 locus, however, is still ignored in donor selection. Interestingly, clinical studies have demonstrated that disparities at HLA-DQB1 alleles as well as distinct HLA DPB1 mismatch constellations do not adversely affect the outcome of allo-HSCT. It has also been shown that HLA class II is predominantly expressed on hematopoietic cells under non-inflammatory conditions. Therefore, this PhD thesis focused on the application of CD4 T cells in adoptive immunotherapy of leukemias.rnIn the first part of this thesis we developed a rapid screening approach to detect T-cell reactivity of donors to single HLA class II mismatch alleles. Allo-HLA reactivity was measured in naive, memory, and entire CD4 T cells isolated from PBMC of healthy donors by flow cytometric cell sorting according to expression of the differentiation markers CD45RA, CD45RO, CD62L, and CCR7. T-cell populations were defined by a single marker to facilitate translation into a clinical-grade allo-depletion procedure. Alloreactivity to single HLA-DR/-DQ mismatch alleles was analyzed in short-term mixed lymphocyte reactions (MLR) in vitro. As standard antigen-presenting cells, we used the HLA-deficient cell line K562 upon electroporation with single HLA-DR/-DQ allele mRNA. We observed in IFN-γ ELISpot assays that allo-HLA-reactivity preferentially derived from subsets enriched for naive compared to memory T cells in healthy donors, irrespective of the HLA mismatch allele. This separation was most efficient if CD62L (P=0.008) or CD45RA (P=0.011) were used as marker. Median numbers of allo-HLA-reactive effector cells were 3.5-fold and 16.6-fold lower in CD62Lneg and CD45RAneg memory CD4 T cells than in entire CD4 T cells, respectively. In allele-specific analysis, alloreactivity to single HLA-DR alleles clearly exceeded that to HLA-DQ alleles. In terms of alloproliferation no significant difference could be observed between individual CD4 T-cell subsets. rnThe second part of this thesis dealed with the generation of allo-HLA-DQ/-DP specific CD4 T cells. Naive CD45RApos CD4 T cells isolated from healthy donor PBMC by flow cytometric cell sorting were stimulated in MLR against single allo-HLA-DQ/-DP alleles transfected into autologous mature monocyte-derived dendritic cells by mRNA electroporation. Rapidly expanding HLA-DQ/-DP mismatch reactive T cells significantly recognized and cytolysed primary acute myeloid leukemia (AML) blasts, fibroblasts (FB) and keratinocytes (KC) in IFN-γ ELISpot and 51chromium release assays if the targets carried the HLA DQ/ DP allele used for T cell priming. While AML blasts were recognized independent of pre-incubating them with IFN-γ, recognition of FB and KC required IFN-γ pre treatment. We further investigated HLA class II expression on hematopoietic and non-hematopoietic cells by flow cytometry. HLA class II was not detected on primary FB, KC, and non-malignant kidney cells, but was expressed at significant levels on primary AML blasts and B-LCL. Up-regulation of HLA class II expression was observed on all cell types after pre-incubation with IFN-γ.rnIn summary, the novel K562-HLA based MLR approach revealed that naive-depleted CD4 T-cell subsets of healthy individuals contain decreased allo-HLA reactivity in vitro. We propose the application of CD45RAneg naive-depleted CD4 T cells as memory T cell therapy, which might be beneficial for HLA-mismatched patients at high-risk of GvHD and low-risk of leukemia relapse. Memory T cells might also provide important post-transplant immune functions against infectious agents. Additionally, the screening approach could be employed as test system to detect donors which have low risks for the emergence of GvHD after allo-HSCT. In the second part of this thesis we developed a protocol for the generation of allo-HLA-DQ/-DP specific CD4 T cell lines, which could be applied in situations in which patient and donor are matched in all HLA alleles but one HLA-DQ/-DP allele with low GvHD potential. These T cells showed lytic activity to leukemia cells while presumably sparing non-hematopoietic tissues under non-inflammatory conditions. Therefore, they might be advantageous for allo-HSCT patients with advanced stage AML after reduced-intensity conditioning and T-cell depletion for the replenishment of anti-leukemic reactivity if the risk for disease relapse is high. rn

Untersuchungen zur Regulation von T-Effektorzellen im peripheren Blut von MS-Patienten und humanisierten Mäusen mit einer induzierten autoimmunen Enzephalitis

Die Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunkrankheit des zentralen Nervensystems, bei der sich autoreaktive T-Effektorzellen der Kontrolle durch regulatorische T-Zellen (Treg) entziehen. Innerhalb dieser Arbeit wurde gezeigt, dass T-Effektorzellen von MS-Patienten insensitiv gegenüber der Suppression durch Treg sind. Hervorgerufen wird diese Treg-Resistenz durch Interleukin-6 (IL-6). Die Inhibition des IL-6-Signalweges stellt die Treg-vermittelte Suppression der T-Effektorzellen wieder her. Es zeigte sich, dass die Bildung von IL-6 und die Expression des IL-6-Rezeptors in MS-Patienten in einer positiven Rückkopplungsschleife von IL-6 selbst induziert werden.rnZur Analyse humaner Immunantworten in vivo und deren Modulation durch humanspezifische Therapeutika wurden humanisierte Mausmodelle etabliert. Der adoptive Transfer humaner Immunzellen in immundefiziente Mäuse erlaubte die Untersuchung von T-Lymphozyten, die aus dem Blut von MS-Patienten isoliert wurden. Es zeigte sich, dass Treg-resistente T-Effektorzellen aus den MS-Patienten in den Tieren eine letale Graft-versus-Host-Erkrankung auslösten, die nicht durch aktivierte Treg therapiert werden konnte. Erst eine Behandlung mit dem humanspezifischen anti-IL-6-Antikörper Tocilizumab in vivo konnte die Erkrankung der Tiere deutlich abmildern.rnIm zweiten Modell wurden immundefiziente Mäuse mit humanen CD34+ Blutstammzellen immunologisch rekonstituiert. Diese Tiere entwickelten ein nahezu vollständig humanes Immunsystem. Die Immunisierung mit dem murinen Myelin-Oligodenrozyten-Glykoprotein löste in den humanisierten Mäusen eine MS-ähnliche Autoimmunität aus. Die Neuroinflammation wurde durch humane T- und B-Zellen vermittelt, korrelierte mit erhöhter IL-17-Produktion und führte zu einer IL-6-abhängigen Treg-Resistenz der T-Effektorzellen. Somit eignen sich die etablierten Modelle, um zukünftig die Wirksamkeit neuer Therapeutika zur Behandlung der MS präklinisch zu testen.rn

Untersuchungen zur antitumoralen Wirkungsweise eines bispezifischen MCSP-CD3 Antikörpers in vitro und im humanisierten Tumormausmodell

Humanes MCSP ist ein gut charakterisiertes Tumorantigen, das auf der Mehrzahl aller malignen Melanome hoch exprimiert wird, und stellt somit eine gute Zielstruktur für immuntherapeutische Ansätze dar. rnInnerhalb der vorliegenden Arbeit wurden die Wirkmechanismen eines neuen bispezifischen Antikörpers, der gegen humanes MCSP und CD3 auf T-Zellen gerichtet ist, in vitro und im humanisierten Tumormausmodell in vivo untersucht. In humanen T Zellkokulturen induzierte der bispezifische MCSP-CD3 Antikörper in Gegenwart MCSP-positiver Melanomzellen konzentrationsabhängige T-Zellaktivierung, Sekretion von Zytokinen und effiziente Tumorzelllyse durch CD4- und CD8-positive T-Zellen. Die induzierte Lyse war hierbei unabhängig von der T-Zellrezeptorspezifität sowie kostimulatorischen Molekülen und allein abhängig von der Expression des Tumorantigens sowie CD3 auf den T-Zellen. Wie hier diskutiert, liegt es nahe, dass die Freisetzung lytischer Moleküle (Perforin und Granzym-B) durch CD8- und auch CD4 positiver T-Zellen den Hauptmechanismus in der Lyse der Melanomzellen darstellt. rnUm die Wirksamkeit in vivo testen zu können, wurde ein humanisiertes Tumormausmodell etabliert. Die Injektion humaner hämatopoetischer Stammzellen in neugeborene Rag2-/-gc-/- Mäuse führte zur Entwicklung funktioneller T-Zellen im murinen Thymus, welche lymphatische Organe besiedelten. In vitro induzierten die T-Zellen humanisierter Mäuse in Anwesenheit des bispezifischen MCSP-CD3 Antikörpers ebenfalls konzentrationsabhängige Lyse der Melanomzellen. Wie hier gezeigt, induzierte die Injektion humaner Melanomzellen in humanisierte Mäuse keine messbare Abstoβungsreaktion. Unter Behandlung mit MCSP-CD3 wurde zwar eine erhöhte Anzahl humaner T-Zellen im Tumorgewebe nachgewiesen, jedoch verfügte die verwendete Melanomzelllinie über eine geringe basale T Zellinfiltration, geringe Vaskularisierung und ein noduläres Wachstumsverhalten. Wie innerhalb dieser Arbeit diskutiert, kann durch die Kombination mit Therapien, die eine erhöhte T-Zellinfiltration in das Tumorgewebe ermöglichen, die Wirksamkeit von bispezifischen Antikörpern möglicherweise gesteigert werden. rn

Einfluss des Treg-Aktivierungsmarkers GARP auf die Differenzierung und Funktion von T-Zellen

CD4+CD25+FoxP3+ regulatorische T-Zellen (Treg) spielen eine essentielle Rolle bei der Unterdrückung von schädlichen Immunreaktionen. Da aktivierte CD4+ T-Helferzellen auch CD25 und FoxP3 exprimieren, können diese nicht als spezifische Marker zur Identifikation von Treg verwendet werden. Die Analyse der Membranproteinexpression beider Populationen führte zur Identifikation von GARP (glycoprotein A repetitions predominant) als spezifischer Marker auf aktivierten Treg. GARP bindet LAP und TGF-beta, welches für die Unterdrückung von entzündlichen T-Zellantworten von Bedeutung ist. Um die Funktion von GARP unabhängig von Treg zu untersuchen, wurde ein lösliches GARP Protein (sGARP) synthetisiert und sein Effekt auf die Aktivierung und Differenzierung von humanen T-Zellen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass sGARP die Proliferation von naiven CD4+ T-Zellen supprimiert und zu einer Phosphorylierung von SMAD2/3 sowie zu der Induktion von FoxP3 führt. Zusätzlich inhibiert sGARP die Produktion von Effektorzytokinen wie IL-2 und IFN-gamma. Die Stimulation von naiven CD4+ T-Zellen mit sGARP induziert die Differenzierung zu Treg, welche in Kokultur die Aktivierung von T-Effektorzellen supprimieren. Die Wirkung war vergleichbar in naiven CD4+ und ruhenden CD4+CD45RA+ T-Zellen, konnte aber in differenzierten CD4+CD45RO+ T-Zellen nicht nachgewiesen werden. Die Induktion von FoxP3 und die Phosphorylierung von SMAD2/3 konnte durch eine Blockade des TGF-beta-Signalweges inhibiert werden. Dies lässt vermuten, dass die Funktion von sGARP zumindest teilweise von TGF-beta abhängig ist. Zusätzlich zu seiner passiven Rolle als TGF-beta-Transporter, induzierte sGARP die TGF-beta-Produktion in naiven T-Zellen und trägt so zum Mechanismus der infektiösen Toleranz bei. Des Weiteren fördert die Stimulation von sGARP in Anwesenheit von IL-6 und IL-23 die Differenzierung zu Th17 Zellen. rnNeben dem Einfluss von sGARP auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, supprimiert sGARP die Proliferation und Granzyme B-Expression in CD8+ T-Zellen. rnFür die Analyse der immunmodulatorischen Funktion von sGARP in vivo wurde ein Modell einer xenogenen GvHD (graft-versus-host disease) verwendet. Der Transfer von humanen PBMC in neugeborene, immundefiziente Rag2-/-gamma-chain-/--Mäuse führt zu einer letalen GvHD, welche durch die Applikation von humanen Treg dosisabhängig unterdrückt werden kann. In diesem Modell konnte die repetitive Gabe von sGARP, ohne zusätzliche Zugabe von Treg, ebenfalls die GvHD unterdrücken. Dies lässt auf einen synergistischen Effekt von sGARP und Treg bei der Suppression inflammatorischer T-Zellantworten schließen. rnZusammengefasst lassen die Ergebnisse auf eine entscheidende Rolle von GARP in der Modulation der peripheren Toleranz folgern und zeigen sGARP als potentes Biological für die Behandlung von unerwünschten inflammatorischen Immunantworten.

Erkennung der alpha-Kette des GM-CSF-Rezeptors (CSF2RA) durch einen HLA-unabhängigen alpha:beta-T-Zellrezeptor

Aus dem tumorreaktiven T-Zellrepertoire der Melanompatientin Ma-Mel-86/INTH, bei der im Verlauf Lymphknotenmetastasen HLA-Klasse I-negativer Tumorzellen auftraten, wurden durch Stimulation mit autologen Tumorzellen CD8+ T-Zellklone isoliert und expandiert, die auf Melanomzellen der Patientin CSF2RA (engl. GM-CSF receptor alpha chain) in HLA-unabhängiger Weise erkannten. Aus einem der T-Zellklone wurde ein CSF2RA-reaktiver α:β-T-Zellrezeptor (TCR, engl. T-cell receptor) kloniert (Bezeichnung: TCR-1A.3/46). Die α-Kette des TCR enthielt die Domänen TRAV14/DV4*01, TRAJ48*01 und TRAC*01, die β-Kette die Domänen TRBV10-3*01, TRBD2*01, TRBJ2-7*01 und TRBC2*01. Durch Austausch der humanen konstanten gegen die homologen murinen Domänen wurde der TCR optimiert (Bezeichnung: cTCR-1A.3/46) und hinsichtlich seiner Expression und Funktionalität nach retroviralem Transfer in humane PBMC (engl. peripheral blood mononuclear cells) im 51Chromfreisetzungstest, im IFN-γ-ELISpot-Assay und in einem Degranulations-Assay validiert. TCR-transgene T-Zellen lysierten nicht nur spezifisch die HLA-defizienten, CSF2RA+ Melanomlinien des Modells Ma-Mel-86, sondern erkannten auch Zelllinien verschiedener Spezies nach Transfektion von CSF2RA sowie Monozyten, Granulozyten, dendritische Zellen und ein breites Spektrum hämatologischer Malignome myeloiden Ursprungs ungeachtet deren HLA-Phänotypen. Lymphatische Zellen sowie CD34+ Blutstammzellen wurden in In vitro-Untersuchungen nicht erkannt. Der Zusatz von GM-CSF zu Zellen, die CSF2RA und CSF2RB exprimierten, inhibierte die Erkennung durch TCR-transgene PBMC, während die Koexpression der α- und der ß-Kette des GM-CSF-Rezeptors alleine keinen negativen Effekt auf die Erkennung hatte. Daraus war zu schließen, dass CSF2RA präferentiell freistehend und weniger nach Integration in den heteromultimerischen GM-CSF-Rezeptor-Komplex erkannt wurde. In der zweidimensionalen Collier-de-Perles-Visualisierung der IMGT-Datenbank (engl. International immunogenetics information system) wies der CSF2RA-reaktive TCR-1A.3/46 im Vergleich zu TCR von konventionellen, HLA-restringierten T-Zellen keine Besonderheiten auf. Darüber hinaus waren auch die von den HLA-unabhängigen T-Zellen exprimierten CD8-Moleküle identisch zu den CD8-Molekülen HLA-abhängiger CTL (engl. cytotoxic T lymphocytes). Die Präsenz von CD8-Molekülen förderte die HLA-unabhängige Erkennung von CSF2RA, schien aber dafür nicht zwingend erforderlich zu sein, da Antikörper gegen CD8 die Erkennung zu ca. 65 % blockierten und TCR-transgene CD4+ T-Zellen im Vergleich zu TCR-transduzierten CD8+ T-Zellen eine deutlich verringerte, aber noch erhaltene Funktionalität aufwiesen. Es ist derzeit nicht klar, ob HLA-unabhängige T-Zellen gegen CSF2RA im peripheren Blut der Patientin vorkamen, weil sie der im Tiermodell postulierten Thymusselektion MHC-unabhängiger TCR (Tikhonova et al., Immunity 36:79, 2012) entkommen waren, oder weil ein ursprünglich gegen einen HLA-Peptid-Komplex gerichteter TCR eine HLA-unabhängige Kreuzreaktivität aufwies. CSF2RA verbessert die Glucoseutilisation in malignen Zellen, und es wurden ihm embryotrophe Eigenschaften zugeschrieben (Spielholz et al., Blood 85:973, 1995; Sjöblom et al., Biol. Reprod. 67:1817, 2002). Damit kann CSF2RA malignes Wachstum fördern und ist somit ein potentielles Zielmolekül für die Immuntherapie. Seine HLA-unabhängige Erkennung würde sowohl die HLA-Vielfalt als auch den HLA-Verlust als typische Limitationen der T-Zellimmuntherapie umgehen. Zur Überprüfung der In vivo-Spezifität des HLA-unabhängigen TCR gegen CSF2RA und damit zum Ausschluss relevanter off-tumor-/on-target- bzw. off-tumor-/off-target-Effekte ist jedoch eine Testung in einem präklinischen Tiermodell erforderlich.