Untersuchungen zur Expression und Funktion intrazellulärer Globine

Im Rahmen meiner Dissertation untersuchte ich die intrazelluläre Lokalisation des Hämoglobin von Drosophila melanogaster, sowie von Neuroglobin und Cytoglobin der Vertebraten. Obwohl alle drei Globine erst kürzlich entdeckt wurden, liegen bereits Daten über ihre Struktur, ihre biochemischen Eigenschaften und die Lokalisation der mRNA vor. Ihre Funktionen konnten bisher jedoch nicht eindeutig geklärt werden. Das Globin von Drosophila melanogaster konnte mittels Westernblot sowohl in Larven als auch adulten Fliegen nachgewiesen werden. Ebenso war es mir möglich, mittels Immunperoxidaseuntersuchungen die Tracheen, die Terminalzellen der Tracheolen sowie die Fettkörperzellen als Ort der Globinexpression in Drosophila zu identifizieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass dieses Globin eine Funktion als Sauerstoffpuffer, der sowohl Sauerstoff speichert als auch transportiert, hin. Damit würde das Drosophila Globin eine zu anderen Insektenglobinen vergleichbare Funktion übernehmen. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass Neuroglobin auch in der neuronalen Netzhaut von Säugern und Fischen vorkommt. Des Weiteren konnte Neuroglobin in der Retina zellulär sowie subzellulär lokalisiert werden. In der avaskulären Mäuseretina wurde Neuroglobin neben den Innensegmenten der Photorezeptorzellen, auch noch in den beiden plexiformen Schichten sowie in der Ganglienzellschicht gefunden. Die gezeigte Kolokalisation dieses intrazellulären Globins mit Mitochondrien und somit auch mit den Orten des höchsten Sauerstoffbedarfs in der Retina deutet auf eine Funktion im Sauerstofftransport zu den Mitochondrien hin. Des Weiteren könnte Neuroglobin auch als Sauerstoffspeicher dienen, der es Neuronen ermöglicht, kurzfristige hypoxische Bedingungen unbeschadet zu überstehen. Andere mögliche Funktionen wie z.B. die als Detoxifizierer von reaktiven Sauerstoff- bzw. Sickstoffverbindungen, als Sauerstoffsensor, sowie als terminale Oxidase erscheinen durch die gezeigten Daten eher unwahrscheinlich. Die bisherige Annahme, dass Cytoglobin ein ubiquitär exprimiertes Protein ist, konnte von mir nicht bestätigt werden. Für nichtneuronale Gewebe konnte gezeigt werden, dass Cytoglobin lediglich auf das Cytoplasma von Fibroblasten und ontogenetisch verwandte Zelltypen wie Osteoblasten, Chondroblasten und Sternzellen beschränkt ist. Möglicherweise hat Cytoglobin dort eine Funktion in der Kollagensynthese. Ferner wird Cygb cytoplasmatisch und nukleär in einigen Neuronen der Retina und des Gehirns exprimiert. Dort könnte Cygb z.B. nukleäre Enzyme wie die NO-Synthase mit Sauerstoff versorgen. Andere Funktionen scheinen aufgrund meiner Daten im Moment unwahrscheinlich.

Vibrational spectroscopic and electrochemical investigations of multi-centered heme proteins in biomimetic membrane architectures

Membrane proteins play a major role in every living cell. They are the key factors in the cell’s metabolism and in other functions, for example in cell-cell interaction, signal transduction, and transport of ions and nutrients. Cytochrome c oxidase (CcO), as one of the membrane proteins of the respiratory chain, plays a significant role in the energy transformation of higher organisms. CcO is a multi centered heme protein, utilizing redox energy to actively transport protons across the mitochondrial membrane. One aim of this dissertation is to investigate single steps in the mechanism of the ion transfer process coupled to electron transfer, which are not fully understood. The protein-tethered bilayer lipid membrane is a general approach to immobilize membrane proteins in an oriented fashion on a planar electrode embedded in a biomimetic membrane. This system enables the combination of electrochemical techniques with surface enhanced resonance Raman (SERRS), surface enhanced reflection absorption infrared (SEIRAS), and surface plasmon spectroscopy to study protein mediated electron and ion transport processes. The orientation of the enzymes within the surface confined architecture can be controlled by specific site-mutations, i.e. the insertion of a poly-histidine tag to different subunits of the enzyme. CcO can, thus, be oriented uniformly with its natural electron pathway entry pointing either towards or away from the electrode surface. The first orientation allows an ultra-fast direct electron transfer(ET) into the protein, not provided by conventional systems, which can be leveraged to study intrinsic charge transfer processes. The second orientation permits to study the interaction with its natural electron donor cytochrome c. Electrochemical and SERR measurements show conclusively that the redox site structure and the activity of the surface confined enzyme are preserved. Therefore, this biomimetic system offers a unique platform to study the kinetics of the ET processes in order to clarify mechanistic properties of the enzyme. Highly sensitive and ultra fast electrochemical techniques allow the separation of ET steps between all four redox centres including the determination of ET rates. Furthermore, proton transfer coupled to ET could be directly measured and discriminated from other ion transfer processes, revealing novel mechanistic information of the proton transfer mechanism of cytochrome c oxidase. In order to study the kinetics of the ET inside the protein, including the catalytic center, time resolved SEIRAS and SERRS measurements were performed to gain more insight into the structural and coordination changes of the heme environment. The electrical behaviour of tethered membrane systems and membrane intrinsic proteins as well as related charge transfer processes were simulated by solving the respective sets of differential equations, utilizing a software package called SPICE. This helps to understand charge transfer processes across membranes and to develop models that can help to elucidate mechanisms of complex enzymatic processes.

In-vitro synthesis and reconstitution of cytochrome bo 3 ubiquinol oxidase in artificial membranes

Forschung über Membranenproteine stellt strenge Hindernisse, seit ruhigem gerade wenige Beispiele der Membranenproteinsorten sind gekennzeichnet worden in den verwendbaren experimentellen Plattformen gegenüber. Die Hauptherausforderung ist, ihre ausgezeichnete entworfene strukturelle Vollständigkeit zu konservieren, während die Ausdruck-, Lokalisierungs- und Wiederherstellungprozesse auftreten. In-vitro übersetzungssysteme können Vorteile über auf Zellenbasisgenausdruck zum Beispiel haben, wenn das über-ausgedrückte Produkt zur Wirtszelle giftig ist oder wenn fehlende Pfosten-Übersetzungsänderung in den bakteriellen Ausdrucksystemen die Funktionalität der Säugetier- Proteine oder Mangel an vorhandenem Membranenraum verdirbt, Funktionsausdruck verbieten.rn Der Nachahmer von biologische Membranen wie feste gestützte Lipidmembranen sind als Plattform am meisten benutzt, Proteinmembraneninteraktionen nachzuforschen. Wir sind in der Lage, Membranenproteinsorte, da wir eine Plattform für Membranenproteinsynthese vorstellen, nämlich die in-vitrosynthese der Membranenproteine in ein Peptid gestütztes Membranensystem zu adressieren. Die Wiederherstellung der Membranenproteine in den Lipid bilayers resultiert im Allgemeinen mit verschiedenen Proteinanpassungen. Als Alternative erforschen wir dieses System zum ersten Mal, um genaueres Modell zu den zellularen Membranen zu verursachen und ihre Funktion, wie Proteineinfügung, Proteinfunktion und Ligandinteraktionen nachzuahmen.rn In dieser Arbeit ist unser Ziel, komplizierte Transmembraneproteine, wie des Cytochrome bo3-ubiquinol Oxydase (Cyt-bo3) direkt innerhalb der biomimetic vorbildlichen Membrane zu synthetisieren. In unserem System wird festes gestütztes tBLM wie, P19/DMPE/PC als Plattform benutzt. Dieses künstliche Membranensystem mimiks die amphiphile Architektur eines Zelle-abgeleiteten Membranensystems.rn

A biomimetic model membrane system on oxidic surfaces designed for the investigation of cytochrome c oxidase and other membrane proteins by fluorescence and waveguide spectroscopy

Die transmembrane Potenzialdifferenz Δφm ist direkt mit der katalytischen Aktivität der Cytochrom c Oxidase (CcO) verknüpft. Die CcO ist das terminale Enzym (Komplex IV) in der Atmungskette der Mitochondrien. Das Enzym katalysiert die Reduktion von O2 zu 2 H2O. Dabei werden Elektronen vom natürlichen Substrat Cytochrom c zur CcO übertragen. Der Eleltronentransfer innerhalb der CcO ist an die Protonentranslokation über die Membran gekoppelt. Folglich bildet sich über der inneren Membrane der Mitochondrien eine Differenz in der Protonenkonzentration. Zusätzlich wird eine Potenzialdifferenz Δφm generiert.rnrnDas Transmembranpotenzial Δφm kann mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie unter Einsatz eines potenzialemfindlichen Farbstoffs gemessen werden. Um quantitative Aussagen aus solchen Untersuchungen ableiten zu können, müssen zuvor Kalibrierungsmessungen am Membransystem durchgeführt werden.rnrnIn dieser Arbeit werden Kalibrierungsmessungen von Δφm in einer Modellmembrane mit inkorporiertem CcO vorgestellt. Dazu wurde ein biomimetisches Membransystem, die Proteinverankerte Doppelschicht (protein-tethered Bilayer Lipid Membrane, ptBLM), auf einem transparenten, leitfähigem Substrat (Indiumzinnoxid, ITO) entwickelt. ITO ermöglicht den simultanen Einsatz von elektrochemischen und Fluoreszenz- oder optischen wellenleiterspektroskopischen Methoden. Das Δφm in der ptBLM wurde durch extern angelegte, definierte elektrische Spannungen induziert. rnrnEine dünne Hydrogelschicht wurde als "soft cushion" für die ptBLM auf ITO eingesetzt. Das Polymernetzwerk enthält die NTA Funktionsgruppen zur orientierten Immobilisierung der CcO auf der Oberfläche der Hydrogels mit Hilfe der Ni-NTA Technik. Die ptBLM wurde nach der Immobilisierung der CcO mittels in-situ Dialyse gebildet. Elektrochemische Impedanzmessungen zeigten einen hohen elektrischen Widerstand (≈ 1 MΩ) der ptBLM. Optische Wellenleiterspektren (SPR / OWS) zeigten eine erhöhte Anisotropie des Systems nach der Bildung der Doppellipidschicht. Cyklovoltammetriemessungen von reduziertem Cytochrom c bestätigten die Aktivität der CcO in der Hydrogel-gestützten ptBLM. Das Membranpotenzial in der Hydrogel-gestützten ptBLM, induziert durch definierte elektrische Spannungen, wurde mit Hilfe der ratiometrischen Fluoreszenzspektroskopie gemessen. Referenzmessungen mit einer einfach verankerten Dopplellipidschicht (tBLM) lieferten einen Umrechnungsfaktor zwischen dem ratiometrischen Parameter Rn und dem Membranpotenzial (0,05 / 100 mV). Die Nachweisgrenze für das Membranpotenzial in einer Hydrogel-gestützten ptBLM lag bei ≈ 80 mV. Diese Daten dienen als gute Grundlage für künftige Untersuchungen des selbstgenerierten Δφm der CcO in einer ptBLM.

Direct electron transfer to cytochrome c oxidase investigated by electrochemistry and time-resolved surface-enhanced infrared absorption spectroscopy

Cytochrom c Oxidase (CcO), der Komplex IV der Atmungskette, ist eine der Häm-Kupfer enthaltenden Oxidasen und hat eine wichtige Funktion im Zellmetabolismus. Das Enzym enthält vier prosthetische Gruppen und befindet sich in der inneren Membran von Mitochondrien und in der Zellmembran einiger aerober Bakterien. Die CcO katalysiert den Elektronentransfer (ET) von Cytochrom c zu O2, wobei die eigentliche Reaktion am binuklearen Zentrum (CuB-Häm a3) erfolgt. Bei der Reduktion von O2 zu zwei H2O werden vier Protonen verbraucht. Zudem werden vier Protonen über die Membran transportiert, wodurch eine elektrochemische Potentialdifferenz dieser Ionen zwischen Matrix und Intermembranphase entsteht. Trotz ihrer Wichtigkeit sind Membranproteine wie die CcO noch wenig untersucht, weshalb auch der Mechanismus der Atmungskette noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Das Ziel dieser Arbeit ist, einen Beitrag zum Verständnis der Funktion der CcO zu leisten. Hierzu wurde die CcO aus Rhodobacter sphaeroides über einen His-Anker, der am C-Terminus der Untereinheit II angebracht wurde, an eine funktionalisierte Metallelektrode in definierter Orientierung gebunden. Der erste Elektronenakzeptor, das CuA, liegt dabei am nächsten zur Metalloberfläche. Dann wurde eine Doppelschicht aus Lipiden insitu zwischen die gebundenen Proteine eingefügt, was zur sog. proteingebundenen Lipid-Doppelschicht Membran (ptBLM) führt. Dabei musste die optimale Oberflächenkonzentration der gebundenen Proteine herausgefunden werden. Elektrochemische Impedanzspektroskopie(EIS), Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und zyklische Voltammetrie (CV) wurden angewandt um die Aktivität der CcO als Funktion der Packungsdichte zu charakterisieren. Der Hauptteil der Arbeit betrifft die Untersuchung des direkten ET zur CcO unter anaeroben Bedingungen. Die Kombination aus zeitaufgelöster oberflächenverstärkter Infrarot-Absorptionsspektroskopie (tr-SEIRAS) und Elektrochemie hat sich dafür als besonders geeignet erwiesen. In einer ersten Studie wurde der ET mit Hilfe von fast scan CV untersucht, wobei CVs von nicht-aktivierter sowie aktivierter CcO mit verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten gemessen wurden. Die aktivierte Form wurde nach dem katalytischen Umsatz des Proteins in Anwesenheit von O2 erhalten. Ein vier-ET-modell wurde entwickelt um die CVs zu analysieren. Die Methode erlaubt zwischen dem Mechanismus des sequentiellen und des unabhängigen ET zu den vier Zentren CuA, Häm a, Häm a3 und CuB zu unterscheiden. Zudem lassen sich die Standardredoxpotentiale und die kinetischen Koeffizienten des ET bestimmen. In einer zweiten Studie wurde tr-SEIRAS im step scan Modus angewandt. Dafür wurden Rechteckpulse an die CcO angelegt und SEIRAS im ART-Modus verwendet um Spektren bei definierten Zeitscheiben aufzunehmen. Aus diesen Spektren wurden einzelne Banden isoliert, die Veränderungen von Vibrationsmoden der Aminosäuren und Peptidgruppen in Abhängigkeit des Redoxzustands der Zentren zeigen. Aufgrund von Zuordnungen aus der Literatur, die durch potentiometrische Titration der CcO ermittelt wurden, konnten die Banden versuchsweise den Redoxzentren zugeordnet werden. Die Bandenflächen gegen die Zeit aufgetragen geben dann die Redox-Kinetik der Zentren wieder und wurden wiederum mit dem vier-ET-Modell ausgewertet. Die Ergebnisse beider Studien erlauben die Schlussfolgerung, dass der ET zur CcO in einer ptBLM mit größter Wahrscheinlichkeit dem sequentiellen Mechanismus folgt, was dem natürlichen ET von Cytochrom c zur CcO entspricht.

Effects of glucocorticoids on vascular NADPH oxidases and endothelial NO synthase

Glukokortikoide (GCs) stellen wichtige Hormone in der Regulation der metabolischen Homöostase dar. Synthetische GCs, wie Dexamethasone (DEX), spielen eine essentielle Rolle in der Behandlung inflammatorischer Krankheiten. Jedoch sind unter einer Dexamethason-Therapie zahlreiche Nebenwirkungen bekannt, so z.B. auch die Entwicklung einer Hypertonie, in deren Pathogenese oxidativer Stress eine entscheidende Rolle spielt. Obwohl sich in den vergangenen Jahren zahlreiche Studien zum Ziel setzten die GC-induzierte Hypertonie (GC-HT) aufzuklären, sind die genauen Mechanismen bis heute unklar. Eine erhöhte Expression von NADPH Oxidasen (Nox) und eine Entkopplung der endothelialen NO Synthase (eNOS), die Hauptquellen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) im vaskulären System, tragen maßgeblich zur Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen bei. Daher ist eine Beteiligung dieser Enzyme in GC-induziertem oxidativen Stress sehr wahrscheinlich. Folglich wurde die Hypothese aufgestellt, dass NADPH Oxidasen und eine entkoppelte eNOS die vielversprechendsten unter den zahlreichen involvierten pro- und anti-oxidativen Enzymen sind. Mit Fokus auf die oben genannten Systeme wurde in der vorliegenden Studie der Effekt von DEX mit Hilfe von in vivo (WKY Ratten) ebenso wie in vitro Experimenten (A7r5 und EA.hy 926 Zellen) untersucht. Dabei zeigte sich, dass Nox1, Nox4 und p22phox durch DEX unterschiedlich reguliert wurden. Nox1 wurde hoch-, Nox4 hingegen herunterreguliert, während p22phox unverändert blieb. Die Modufikation schien hierbei auf transkriptioneller und post-transkriptioneller Ebene stattzufinden. Durch die gegensätzliche Regulation von Nox1 und Nox4 bleibt die Nettowirkung der verschiedenen Nox Isoformen unklar. Immer mehr Studien bringen vaskulären oxidativen Stress mit der Pathogenese einer GC-HT in Zusammenhang, welche letztendlich zu einer verminderten Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid (NO) führt. Durch die eNOS produziertes NO stellt einen essentiellen Schutzfaktor der Blutgefäße dar. Eine verminderte NO-Bioverfügbarkeit könnte die Folge einer eNOS-Entkopplung darstellen, ausgelöst durch oxidativen Stress. Da die Verfügbarkeit von Tetrahydrobiopterin (BH4) entscheident ist für die Aktivität und enzymatische Kopplung der eNOS, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit GC-induzierten Veränderungen in der BH4-Versorgung. Die Behandlung von EA.hy 926 Zellen mit DEX führte zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Herunterregulation von eNOS auf mRNA- und Proteinebene. Gleichzeitig wurde die Phosphorylierung an Serine1177 vermindert. Als maßgeblicher “Kopplungs-Schalter” kann BH4 endogen über zwei verschiedene Signalwege synthetisiert werden, welche durch die Enzyme GCH1 und DHFR reguliert werden. DEX führte zu einer zeit- und konzentrationsabhängigen Herunterregulation von BH4, BH2 und Biopterin, wobei ebenso das BH4 / BH2 -Verhältnis vermindert wurde. Beide Enzyme, GCH1 genauso wie DHFR, wurden auf mRNA- und Proteinebene herunterreguliert, was auf einen Effekt von GCs auf beide rnBH4-produzierenden Signalwege schließen lässt. Nach Behandlung mit DEX wurde die Produktion von NO in Endothelzellen maßgeblich vermindert. In ROS-Messungen zeigte sich eine Tendenz hin zu einer eNOS-Entkopplung, jedoch war es mit unserem experimentellen Aufbau nicht möglich, diese endgültig zu beweisen.rnZusammenfassend lässt sich sagen, dass die Behandlung mit GCs zu Veränderungen in beiden untersuchten Systemen, den NADPH Oxidasen ebenso wie dem eNOS-NO System, führte. DEX erhöhte die Expression von Nox1 in glatten Muskelzellen und reduzierte die Nox4-Expression in Endothelzellen. Gleichzeitig verminderte DEX die Verfügbarkeit von BH4 und inhibierte die Phosphorylierung / Aktivität von eNOS. Mithilfe weiterer Studien muss die endgültige Beteiligung von NADPH Oxidasen und einer eNOS-Entkopplung an oxidativem Stress in GC-HT abschließend aufgeklärt werden.rn

Effects of maternal PETN treatment of spontaneously hypertensive rats on blood pressure in the offspring

Pentaerithrityltetranitrat (PETN) ist ein organisches Nitrat und wird in der Klinik zur Behandlung der Angina Pectoris eingesetzt. PETN hat, wenn direkt verabreicht, kaum Wirkung auf den Blutdruck. Diese Arbeit wurde konzipiert, um einen potentiellen „perinatalen Programmierung“-Effekt von PETN in spontan-hypertensiven Ratten (SHR), einem Rattenmodel der genetischen Hypertonie, zu testen. Die F0-Elterntiere wurden mit PETN (50 mg/kg/Tag) während der Schwangerschaft und der Laktation behandelt; die F1-Nachkommen bekamen nach der Ablaktation normales Haltungsfutter. Der Blutdruck wurde an den Nachkommen vom 3. Monat bis zum 8. Monat nach der Geburt gemessen. Maternale PETN-Behandlung hatte kaum Wirkung auf den Blutdruck in den männlichen SHR-Nachkommen. Dagegen zeigten die weiblichen Nachkommen der PETN-Behandlungsgruppe eine persistente Reduktion des Blutdrucks. Der systolische Blutdruck war in den weiblichen Nachkommen in der PETN-Gruppe etwa 13 mmHg niedriger im 4. Monat und etwa 10 mmHg niedriger im 8. Monat als in den Kontrolltieren. Dieser lang-anhaltende Effekt ging mit einer substanziellen Änderung der Genexpression einher, die auch beim 8. Monat noch nachzuweisen war. In den Aorten der weiblichen F1-Nachkommen wurde Veränderungen an Genexpression der α-adrenergen Rezeptoren sowie Endothelin-Rezeptoren festgestellt, die aber funktionell von minimaler Bedeutung für die PETN-Wirkung waren. Hingegen war eine klare Rolle des StickstoffmoNOXid (NO) zu sehen. Maternale PETN-Behandlung führte zur Heraufregulation der endothelialen NO-Synthase (eNOS) und der GTP-Cyclohydrolase I (GCH-1). GCH-1 ist für die Biosynthese des Tetrahydrobiopterins, eines essentiellen eNOS-Kofaktors, entscheidend, und dadurch auch für die eNOS-Funktionalität. Zusätzlich wurden auch anti-oxidative Enzyme wie die mitochondriale Superoxid-Dismutase (SOD2), die Glutathion-Peroxidase 1 (GPx1) und die Hem-Oxygenase 1 (HO-1) heraufreguliert, und die Superoxid-produzierende NADPH-Oxidase NOX1 herunterreguliert. Dies kann zur Verminderung vom oxidativen Stress und Erhöhung der NO-Bioverfügbarkeit führen. Letztlich wurde auch ~ 74 ~ die Sirtuin 1 (SIRT1) durch maternale PETN-Behandlung heraufreguliert, die auch zur Heraufregulation der SOD2, GPx1 und eNOS beitragen kann. Im Organbad-Experiment wurde die Acetylcholin-induzierte, Endothel-abhängige Vasodilatation in der Aorta der weiblichen Nachkommen der PETN-Gruppe verstärkt. Diese verbesserte Endothelfunktion, was vermutlich aus der Genexpressionsänderung resultiert, stellt sehr wahrscheinlich einen Schlüsselmechanismus der Blutdrucksenkung in den Nachkommen der PETN-behandelten F0-Tiere dar.