Identifizierung einer Mutation im Exon 2 des C1q-B-Ketten-Gens als Ursache eines hereditären C1q-Defekts mit Ausbildung einer SLE-ähnlichen Symptomatik

Komplementdefizienzen gehen mit einer erhöhten Infektionsanfälligkeit gegenüber bestimmten Krankheitserregern in den ersten Lebensjahren (MBL-Defizienz) und darüber hinaus (C1q- und anderen Komplementdefizienten) einher. Dies unterstreicht die Rolle des Komplementsystems als effektiver Abwehrmechanismus in der Übergangsphase zwischen Verlust des „mütterlichen Nestschutzes“ und Ausreifung der eigenen „erworbenen“ Immunität. Das Auftreten von Autoimmunerkrankungen wie dem SLE-ähnlichen Syndrom bei Defizienzen des Klassischen Weges beleuchten zusätzliche Funktionen des Komplementsystems während der Ausreifung der erworbenen Immunität und als wesentlicher Effektor in der Erkennung apoptotischer Zellen und deren Eliminierung aus dem System.rnHereditäre C1q-Defizienzen gehen mit einer hohen Wahrscheinlichkeit mit einem SLE-ähnlichen Syndrom einher. Sie stellen unter den Defizienzen des Komplementsystems eines Seltenheit dar, ihr klinisches „Gesicht“ ist umso eindrucksvoller. Sie sind von der funktionellen C1q-Defizienz im Rahmen eines erhöhten „turnover“ und in der Folge einer C1q-Autoantokörperbildung abzugrenzen. Ursächlich ist ihnen eine Mutation in einem der drei C1q-Gene, die auf dem Chromosom 1 lokalisiert sind. Homozygote Mutationsträger können den Defekt nicht ausgleichen und zeigen eine C1q-Defizienz mit Verlust der gesamthämolytischen Aktivität CH50. Häufungen treten bei Nachkommen von Geschwister- und Verwandtschaftsehen auf.rnrnIn dieser Arbeit wird der Fall einer Patientin mit einem schweren, frühkindlich einsetzenden, SLE-ähnlichen Syndrom aufgearbeitet. Als Ursache für eine Erkrankung konnte ein hereditärer C1q-Defekt, ohne immunologischem Nachweis eines C1q oer LMQ-C1q, identifiziert werden. Da sich keine der vorab beschriebenen Mutatonsmuster bei der Patientin detektieren ließ, erfolgte die Sequenzierung aller drei C1q-Gene. Dadurch ließ sich ein neues Mutationsmuster darstellen.rnrnDie in dieser Arbeit vorgestellte Mutation unterscheidet sich von den bislang beschriebenen Mutationen dadurch, dass es sich nicht um eine Punktmutation, sonder um eine Deletion von 29 Basen (c283_311) im Exon 2 des C1q-B-Ketten-Gens mit einhergehendem Rasterschub und vorzeitigem Stop-Codon (pMet95TrpfsX8) handelt. Durch die Analyse der Eltern und Geschwister der betroffenen Patientin konnte der Vererbungsweg dargestellt werden. Zudem gelang es die Mutation im Rahmen einer Pränataldiagnostik bei einem „ungeborenen“ Geschwisterkind auszuschließen.rn

Tolerance and immunity to human tumor-associated antigens

Tumor-assoziierte Antigene (TAA) repräsentieren wichtige Zielstrukturen in zytotoxischen T-Zell (ZTL)-basierten Immuntherapien zur Behandlung maligner Erkrankungen. Die Tatsache, dass TAA nicht spezifisch nur in Tumoren sondern auch in nicht-transformierten Zellen vorhanden sind, kann infolge verschiedener Toleranz-Mechanismen zur Eliminierung von ZTL führen, deren T-Zell-Rezeptoren eine hohe Affinität für TAA besitzen. Entsprechend erfordert die Entwicklung effektiver Immuntherapeutika die genaue Analyse des verfügbaren T-Zell-Repertoires mit Spezifität für ein gegebenes TAA.Die Arbeit fokusierte das Tyrosinase (369-377) ZTL-Epitop, das im Komplex mit HLA-A*0201 (A2.1) auf der Zell-Oberfläche von malignen Melanomen und verschiedenen nicht-transformierten Zellen präsentiert wird. Es wurde gefunden, dass sowohl das humane als auch das murine Tyrosinase (369-377)-spezifische ZTL-Repertoire durch Selbst-Toleranz kompromittiert ist und dass diese Toleranz weder durch Verwendung einer bestimmten Peptid-Variante noch durch Interferenz mit CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen oder CTLA-4 umgangen werden kann. Diese Ergebnisse wurden anschließend auf ein anderes Krankheitsmodell, das Multiple Myelom (MM), adaptiert. Unter Umgehung von Selbst-Toleranz in A2.1-transgenen Mäusen wurde gezeigt, dass Transkriptionsfaktoren, die die terminale Differenzierung von B-Zellen in maligne und nicht-maligne Plasmazellen diktieren, als MM-assoziierte ZTL-Epitope dienen können.Diese Arbeit bietet einen bedeutenden und innovativen Beitrag zur Gestaltung von Tyrosinase-basierten Melanom- und MM-reaktiven Immuntherapien.

The role of CYLD in dendritic cell function

Deubiquitination of NF-κB members by CYLD is crucial in controlling the magnitude and nature of cell activation. The naturally occurring CYLD splice variant, devoid of exons 7 and 8, lacks TRAF2 and NEMO binding sites. The role of this splice variant in dendritic cell (DC) function was analyzed using CYLDex7/8 mice, which lack the full-length CYLD (FL-CYLD) transcript and over-express the short splice variant (sCYLD). Bone marrow derived DCs (BMDC) from CYLDex7/8 mice display a hyper-reactive phenotype in vitro and in vivo and have a defect in establishing tolerance using DEC205-mediated antigen targeting to resting DCs. This phenotype was accompanied by an increased nuclear translocation of the IκB molecule Bcl-3, and increased degradation of cytoplasmic p105 in CYLDex7/8 BMDCs after stimulation. This suggests that in contrast to FL-CYLD, sCYLD is a positive regulator of NF-κB activity and its over-expression induces a hyper-reactive phenotype in DCs.

Evaluation der Leukämie-Reaktivität von PRAME- und p53-spezifischen T-Zellen bei lymphohämatopoetischen Neoplasien im Rahmen einer adoptiven Immuntherapie

Der Transplantat-gegen-Leukämie (GVL) Effekt als immuntherapeutisches Mittel bei der allogenen hämatopoetischen Stammzell Transplantation (HSZT) ist hauptsächlich durch Spender Lymphozyten vermittelt, welche hämatopoetische Minor-Histokompatibilitäts Antigene bzw. Leukämie-assoziierte Antigene (z. B.: PRAME, p53) erkennen. Der adoptive Transfer von Leukämie-spezifischen T-Zellen kann den GVL-Effekt, ohne ein Auftreten einer Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung (GVHD), steigern. Unter Verwendung von HLA-A2 und human CD8 transgenen Mäusen (CD8yCyA2Kb) konnten in dieser Arbeit PRAME spezifische CD8+ zytotoxischen T-Zellen generiert werden. Diese zytotoxischen CD8+ T-Zellen zeigten in Chromfreisetzungsuntersuchungen lytische Aktivität gegen eine Vielzahl von Zelllinien, die PRAME endogen prozessieren sowie gegen das spezifische PRAME-Peptid. Des Weiteren wurden die hier generierten T-Zellen auf ihre zytotoxische Aktivität gegen akute myeloische Leukämie Blasten hin untersucht, und diese Untersuchungen zeigten AML-Reaktivität der PRAME-spezifischen sowie der als Vergleich genutzten p53- und HLA-A2-spezifischen T-Zellen. Das Potenzial der PRAME-spezifischen ZTL die GVL-Immunität in vivo zu erhöhen ohne das Vorkommen einer GVHD wurde in einem Tumor-Protektions-Model unter der Nutzung von NOD/SCIDgcnull Mäusen untersucht. Die PRA100- bzw. p53-ZTL wurden adoptiv in NOD/SCIDgcnull Rezipienten transferiert und gleichzeitig wurden die Tiere mit PRAME-, oder p53-exprimierende Tumorzelllinien inokuliert. Die Reduktion des Tumorwachstums bestätigte die Spezifität der T-Zellen auch in vivo. In weiteren in vivo Experimenten wurden NOD/SCIDgcnull Mäuse mit AML-Blasten rekonstituiert. Durch die Applikation von nur CD34 positiven Zellen aus einer AML-Probe, oder einer CD56 depletierten Probe, konnten Rekonstitutionen in 95 % aller Versuche erfolgreich beendet werden. Wurde eine Rekonstitution mittels PCR- und FACS-Analysen diagnostiziert, so folgten mehrere Applikationen der PRAME- oder p53-spezifischen ZTL. In diesen Untersuchungen konnten wir in einem therapeutischen AML-in vivo-Modell zeigen, dass die in diesen Untersuchungen generierten/verwandten ZTL in der Lage sind AML-Blasten in vivo zu bekämpfen und so die leukämische Last der Tiere im Blut sowie in der Milz auf unter 1 % zu regulieren. Der prozentuale Anteil humaner AML Zellen im Knochenmark konnte deutlich gesenkt werden (< 10 %). Zusammenfassend sind die von uns generierten PRAME-spezifischen T-Zellen in der Lage, in vitro und auch in vivo, endogen prozessiertes Protein auf Zelllinien und AML-Blasten zu erkennen und zu lysieren. Auch die p53-ZTL, welche als eine weitere Antigen-spezifische ZTL-Population in vivo getestet wurden, zeigten GVL-Effekte. Die Kenntnis von Tumor- bzw. Leukämie assoziierten Antigenen und die daraus erwachsene Möglichkeit der Generierung krankheitsspezifischer ZTL bietet die Grundlage für eine spezifische Immuntherapie maligner Erkrankungen.

Untersuchungen zum Einfluss des malignen Melanoms auf die Frequenz und Funktion regulatorischer T-Zellen

Im Immunsystem spielen regulatorische T-Zellen (Treg) eine essentielle Rolle bei der Unterdrückung und Eindämmung von überschüssigen oder schädlichen Immunreaktionen. Ihre suppressiven Eigenschaften wirken aber auch bei Immune Escape Mechanismen von Tumoren mit und können den Erfolg von Tumorimmuntherapien deutlich mindern.rnIn dieser Arbeit konnte zum ersten Mal die Frequenz verschiedener Treg Subpopulationen im peripheren Blut von gesunden Spendern und Melanompatienten in verschiedenen Stadien der Erkrankung verglichen werden. Dabei wurden Treg-Subpopulationen mit den Markerkombinationen CD4+CD25++, CD4+CD25+CD127low, CD4+CD25+HLA DR+, CD4+Foxp3+, CD4+Foxp3+CD25+, CD4+Foxp3+CD127low und CD4+Foxp3+HLA DR+ untersucht. Insbesondere bei den Subpopulationen, die durch die Expression von Foxp3 charakterisiert sind, konnten in Patienten im Spätstadium IV der Melanomerkrankung, verglichen mit Patienten im Stadium I-II oder gesunden Spendern, erhöhte Treg Frequenzen im peripheren Blut festgestellt werden. Diese Funde korrelierten mit der Beobachtung einer verminderten antigenspezifischen T Zellreaktivität in solchen Melanompatienten. Des Weiteren zeigte sich, dass eine DC basierte Tumorantigen-spezifische Immuntherapie bei einem Teil der behandelten Stadium IV Melanompatienten eine Abnahme der Treg Frequenzen im peripheren Blut zur Folge hatte. Dies korrelierte mit Beobachtungen aus vorangegangenen Studien unserer Arbeitsgruppe, bei denen sich zeigte, dass eine solche Immuntherapie die zuvor supprimierten T Zellantworten zumindest vorübergehend wiederherstellen kann. Bei Untersuchungen zur Expression des IL 1-Rezeptors-1 konnte dieser auf Proteinebene als verstärkt exprimierter Aktivierungsmarker auf Treg bestätigt werden. In Anwesenheit von IL-1 wird die Suppressorfunktion der Treg inhibiert. Eine Konversion von humanen Treg zu nicht suppressorischen TH-17-Zellen durch die Kostimulation mit IL 1 konnte dabei nicht nachgewiesen werden. Vielmehr scheint die Induktion von IL 2 die entscheidende Wirkung von IL 1 auf humane Treg und Teff darzustellen.rn

Neonatal plasmacytoid dendritic cells at the interface of innate and adaptive immunity = Neonatale plasmazytoide dendritische Zellen - an der Schnittstelle zwischen angeborener und adaptiver Immunität

Human cord blood plasmacytoid dendritic cells (PDC) react to stimulation with CPG A and CPG B with an increase in cell surface activation and maturation markers and cytokine production, similar to adult PDC. Intracellular phosphorylation in neonatal PDC did not benefit from CPG stimulation, in contrast to adult PDC. Cord blood PDC primed with CPG A, CPG B and CD40L do not promote division of autologous T cells contrary to adult PDC. Priming of neonatal PDC with CPG A or CPG B does not induce a clear bias in T helper cell response towards Th1 or Th2 while adult PDC trend towards a Th2 response.

The interaction of Leishmania major parasites with human myeloid cells and its consequence for adaptive immunity

In der vorliegenden Arbeit fokussierten wir uns auf drei verschiedene Aspekte der Leishmanien-Infektion. Wir charakterisierten den Prozess des Zelltods „Apoptose“ bei Parasiten (1), untersuchten die Eignung von Makrophagen und dendritischen Zellen als Wirtszelle für die Entwicklung der Parasiten (2) und analysierten die Konsequenzen der Infektion für die Entstehung einer adaptiven Immunantwort im humanen System. Von zentraler Bedeutung für dieses Projekt war die Hypothese, dass apoptotische Leishmanien den Autophagie-Mechanismus ihrer Wirtszellen ausnutzen, um eine T-Zell-vermittelte Abtötung der Parasiten zu vermindern.rnWir definierten eine apoptotische Leishmanien-Population, welche durch eine rundliche Morphologie und die Expression von Phosphatidylserin auf der Parasitenoberfläche charakterisiert war. Die apoptotischen Parasiten befanden sich zudem in der SubG1-Phase und wiesen weniger und fragmentierte DNA auf, welche durch TUNEL-Assay nachgewiesen werden konnte. Bei der Interaktion der Parasiten mit humanen Makrophagen und dendritischen Zellen zeigte sich, dass die anti-inflammatorischen Makrophagen anfälliger für Infektionen waren als die pro-inflammatorischen Makrophagen oder die dendritischen Zellen. Interessanterweise wurde in den dendritischen Zellen jedoch die effektivste Umwandlung zur krankheitsauslösenden, amastigoten Lebensform beobachtet. Da sowohl Makrophagen als auch dendritische Zellen zu den antigenpräsentierenden Zellen gehören, könnte dies zur Aktivierung der T-Zellen des adaptiven Immunsystems führen. Tatsächlich konnte während der Leishmanien-Infektion die Proliferation von T-Zellen beobachtet werden. Dabei stellten wir fest, dass es sich bei den proliferierenden T-Zellen um CD3+CD4+ T-Zellen handelte, welche sich überraschenderweise als Leishmanien-spezifische CD45RO+ T-Gedächtniszellen herausstellten. Dies war unerwartet, da ein vorheriger Kontakt der Spender mit Leishmanien als unwahrscheinlich gilt. In Gegenwart von apoptotischen Parasiten konnte eine signifikant schwächere T-Zell-Proliferation in Makrophagen, jedoch nicht in dendritischen Zellen beobachtet werden. Da sich die T-Zell-Proliferation negativ auf das Überleben der Parasiten auswirkt, konnten die niedrigsten Überlebensraten in dendritischen Zellen vorgefunden werden. Innerhalb der Zellen befanden sich die Parasiten in beiden Zelltypen im Phagosom, welches allerdings nur in Makrophagen den Autophagie-Marker LC3 aufwies. Chemische Induktion von Autophagie führte, ebenso wie die Anwesenheit von apoptotischen Parasiten, zu einer stark reduzierten T-Zell-Proliferation und dementsprechend zu einem höheren Überleben der Parasiten.rnZusammenfassend lässt sich aus unseren Daten schließen, dass Apoptose in Einzellern vorkommt. Während der Infektion können sowohl Makrophagen, als auch dendritische Zellen mit Leishmanien infiziert und das adaptive Immunsystem aktivert werden. Die eingeleitete T-Zell-Proliferation nach Infektion von Makrophagen ist in Gegenwart von apoptotischen Parasiten reduziert, weshalb sie im Vergleich zu dendritischen Zellen die geeigneteren Wirtszellen für Leishmanien darstellen. Dafür missbrauchen die Parasiten den Autophagie-Mechanismus der Makrophagen als Fluchtstrategie um das adaptive Immunsystem zu umgehen und somit das Überleben der Gesamtpopulation zu sichern. Diese Ergebnisse erklären den Vorteil von Apoptose in Einzellern und verdeutlichen, dass der Autophagie-Mechanismus als potentielles therapeutisches Ziel für die Behandlung von Leishmaniose dienen kann.rn

Investigations on DNA methylation by Dnmt2 and impact of tRNA modifications on TLR7 stimulation

The incorporation of modified nucleotides into ribonucleic acids (RNAs) is important for their structure and proper function. These modifications are inserted by distinct catalytic macromolecules one of them being Dnmt2. It methylates the Cytidine (C) at position 38 in tRNA to 5-methylcytidine (m5C). Dnmt2 has been a paradigm in this respect, because all of its nearest neighbors in evolution are DNA-cytosine C5-methyltransferases and methylate DNA, while its (own) DNA methyltransferase activity is the subject of controversial reports with rates varying between zero and very weak. This work determines whether the biochemical potential for DNA methylation is present in the enzyme. It was discovered that DNA fragments, when presented as covalent RNA:DNA hybrids in the structural context of a tRNA, can be more efficiently methylated than the corresponding natural tRNA substrate. Additional minor deviations from a native tRNA structure that were seen to be tolerated by Dnmt2 were used for a stepwise development of a composite system of guide RNAs that enable the enzyme to perform cytidine methylation on single stranded DNA in vitro. Furthermore, a proof-of-principle is presented for utilizing the S-adenosyl methionine-analog cofactor SeAdoYn with Dnmt2 to search for new possible substrates in a SELEX-like approach.rnIn innate immunity, nucleic acids can function as pathogen associated molecular patterns (PAMPs) recognized by pattern recognition receptors (PRRs). The modification pattern of RNA is the discriminating factor for toll-like receptor 7 (TLR7) to distinguish between self and non-self RNA of invading pathogens. It was found that a 2'-O-methylated guanosine (Gm) at position18, naturally occurring at this position in some tRNAs, antagonizes recognition by TLR7. In the second part of this work it is pointed out, that recognition extends to the next downstream nucleotide and the effectively recognized molecular detail is actually a methylated dinucleotide. The immune silencing effect of the ribose methylation is most pronounced if the dinucleotide motif is composed of purin nucleobases whereas pyrimidines diminish the effect. Similar results were obtained when the Gm modification was transposed into other tRNA domains. Point mutations abolishing base pairings important for a proper tertiary structure had no effect on the immune stimulatory potential of a Gm modified tRNA. Taken together these results suggest a processive type of RNA inspection by TLR7.rn