Oligodendroglial exosomes in glia to neuron signaling

In the CNS, myelinating oligodendrocytes and axons form a functional unit based on intimate cell-cell interactions. In addition to axonal insulation serving to increase the conduction velocity of electrical impulses, oligodendrocytes provide trophic support to neurons essential for the long-term functional integrity of axons. The glial signals maintaining axonal functions are just at the beginning to become uncovered. Yet, their determination is highly relevant for all types of demyelinating diseases, where lack of glial support significantly contributes to pathology. rnThe present PhD thesis uncovers exosomes as a novel signaling entity in the CNS by which cargo can be transferred from oligodendrocytes to neurons. Exosomes are small membranous vesicles of endocytic origin, which are released by almost every cell type and have been implicated in intercellular communication. Oligodendrocytes secrete exosomes containing a distinct set of proteins as well as mRNA and microRNA. Intriguingly, oligodendroglial exosome release is stimulated by the neurotransmitter glutamate indicating that neuronal electrical activity controls glial exosome release. In this study, the role of exosomes in neuron-glia communication and their implications on glial support was examined. Cortical neurons internalized and accumulated oligodendroglial exosomes in the neuronal cell soma in a time-dependent manner. Moreover, uptake occurred likewise at the somatodendritic and axonal compartment of the neurons via dynamin and clathrin dependent endocytosis. Intriguingly, neuronal internalization of exosomes resulted in functional retrieval of exosomal cargo in vitro and in vivo upon stereotactic injection of Cre recombinase bearing exosomes. Functional recovery of Cre recombinase from transferred exosomes was indicated by acquired reporter recombination in the target cell. Electrophysiological analysis showed an increased firing rate in neurons exposed to oligodendroglial exosomes. Moreover, microarray analysis revealed differentially expressed genes after exosome treatment, indicating functional implications on neuronal gene expression and activity. rnTaken together, the results of this PhD thesis represent a proof of principle for exosome transmission from oligodendrocytes to neurons suggesting a new route of horizontal transfer in the CNS.rn

Quantitative Untersuchungen zur mRNA-Expression verschiedener Neurotransmitterrezeptoren im Verlauf der neuronalen Entwicklung der Zellinie PCC7-Mz1

Die murine embryonale Karzinomazellinie PCC7-Mz1 stellt ein Modell neuronaler Entwicklung dar, da nach RA-Gabe eine Differenzierung in neuronale, gliale und fibroblastoide Phänotypen erfolgt. Um die Expression von Neurotransmitterrezeptoren während der neuronalen Entwicklung zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit eine quantitative Analyse der Expression verschiedener Neurotransmitterrezeptoren im Verlauf der RA-induzierten Differenzierung der PCC7-Mz1 Zellen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde eine kompetitive RT-PCR eingesetzt. Als Kompetitor wurde ein synthetisches Gen ( SG) konstruiert, das sich aus den Antisense- und Sense-Primersequenzen zur spezifischen Amplifikation des Dopaminrezeptors D2, des Serotoninrezeptors 5HT3, der GABAA-Untereinheiten ß1 und ß3, der metabotropen Glutamatrezeptoren mGluR1 und mGluR5, der 5 NMDA-Rezeptoruntereinheiten 1,2a,2b,2c und 2d, der Markerproteine Synaptophysin und GFAP, und der Untereinheiten a3, a4 und a7 des nikotinischen Acetylcholinrezeptors zusammensetzt. Mit diesem SG erfolgten die Quantifizierungen der Rezeptor-mRNA im Sättigungsbereich der PCR. Die erhaltenen Transkriptmengen wurden auf ein Neuron bezogen, wodurch eine Korrelation zur neuronalen Entwicklung erfolgen konnte.

Generation of a NG2-EYFP mouse for studying the properties of NG2-expressing cells

A range of vectors were made in which the EYFP gene or the Cre gene were inserted in the start codon of the NG2 gene. The NG2-EYFP vectors were used to generate NG2-EYFP “knockin” mice by homologous recombination. The F1 generation showed lack of EYFP expression, due to NeoR cassette interference. Excision of the NeoR, by breeding the F1 generation to ELLA-Cre mice allowed proper expression of EYFP. NG2-EYFP heterozygous mice were characterized in detail for astrocytic, neurogenic and oligodendrocytic properties through antibody labeling. NG2-EYFP+ cells did not label for the astrocyte marker GFAP, but some cells did express S100 Beta. The cells did not label with any neuronal markers like Beta III tubulin, Neun, and double cortin, but many of the NG2-EYFP+ cells made intimate contacts to the neurons. These contacts are widespread throughout the grey and white matter of the brain. The NG2-EYFP+ cells did label for oligodendrocyte markers like PDGFα-R, NG2, Olig2, O4, and Sox 10. There were a few cells termed phantom cells that did label for NG2, but had no EYFP expression. This could have been caused by improper excision of the NeoR cassette in the F2 generation. The heterozygous mouse is a tool to allow the characterization of the in vivo properties of the NG2+ cells. Breeding of these mice to homozygosity yielded an NG2-knockout mouse, which was also subjected to initial characterization. The NG2-EYFP homozygous showed equivalent cell labeling results to the NG2-EYFP heterozygous mouse, but the phantom cells disappeared in the knockout. The results show that the NG2 cells are a heterogenous population that does not express astrocytic or neuronal markers. The homozygous mouse is an ideal tool to further dissect the properties of the cells, lacking NG2 in vivo.

The central role of Fyn kinase in axon-glial signalling and translation of myelin proteins

During central nervous system myelination, oligodendrocytes extend membrane processes towards an axonal contact site which is followed by ensheathment resulting in a compacted multilamellar myelin sheath. The formation of this axon-glial unit facilitates rapid saltatory propagation of action potentials along the axon and requires the synthesis and transport of copious amounts of lipids and proteins to the axon-glial contact site. Fyn is a member of the Src family of non receptor tyrosine kinases and inserted into the inner leaflet of the oligodendrocyte membrane by acylation. Fyn activity plays a pivotal role in the maturation of oligodendrocytes and the myelination process. It was suggested previously that Fyn kinase can be stimulated by binding of a neuronal ligand to oligodendroglial F3/ contactin, a glycosyl-phosphatidyl-inositol anchored immunoglobulin superfamily (IgSF) member protein. It could be shown here, that neuronal cell adhesion molecule L1 binds to oligodendrocytes in an F3-dependent manner and activates glial Fyn. In the search for downstream participants of this novel axon-glial signalling cascade, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) A2 was identified as a novel Fyn target in oligodendrocytes. HnRNP A2 was known to be involved in the localisation of translationally repressed myelin basic protein (MBP) mRNA by binding to a cis acting A2 response element (A2RE) present in the 3’ untranslated region. Transport of MBP mRNAs occurs in RNA-protein complexes termed RNA granules and translational repression during transport is achieved by hnRNP A2-mediated recruitment of hnRNP E1 to the granules. It could be shown here, that Fyn activity leads to enhanced translation of reporter mRNA containing a part of the 3’ UTR of MBP including the A2RE. Furthermore hnRNP E1 seems to dissociate from RNA granules in response to Fyn activity and L1 binding. These findings suggest a novel form of neuron- glial communication: Axonal L1 binding to oligodendroglial F3 activates Fyn kinase. Activated Fyn phosphorylates hnRNP A2 leading to removal of hnRNP E1 from RNA granules initiating the translation of MBP mRNA. MBP is the second most abundant myelin protein and mice lacking this protein show a severe hypomyelination phenotype. Moreover, the brains of Fyn knock out mice contain reduced MBP levels and are hypomyelinated. Hence, L1-mediated MBP synthesis via Fyn as a central molecule could be part of a regulatory mechanism required for myelinogenesis in the central nervous system.

Analyse der Transmembran-Agrin-abhängigen Signalkaskade in auswachsenden Axonen des zentralen Nervensystems

Die Entdeckung einer Transmembranform des Proteoglykans Agrin führte zu der Hypothese, dass TM-Agrin ein Rezeptor oder Korezeptor mit signaltransduzierenden Eigenschaften sein könnte. Die durch Antikörper simulierte Ligandenbindung an TM-Agrin resultiert in der Bildung von zahlreichen Ausläufern sowohl auf ZNS als auch auf PNS Axonen und Dendriten und unterstützt diese Hypothese. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen führt die Überexpression von TM-Agrin in ZNS Neuronen ebenfalls zur Bildung von zahlreichen Ausläufern, wohingegen die Unterdrückung der TM-Agrin Expression durch siRNA die Anzahl der Ausläufer stark reduziert. Der Mechanismus der durch TM-Agrin induzierten Bildung von Ausläufern ist jedoch unbekannt. Ziel der Dissertation war es deshalb, die durch TM-Agrin induzierte Signalkaskade zu untersuchen. Mit Hilfe von biochemischen, immunozytochemischen und pharmakologischen Unter-suchungen konnte gezeigt werden, dass sich TM-Agrin auf auswachsenden Axonen und nach Überexpression in nicht-neuronalen Zellen in lipid rafts anreichert und das lipid rafts sowohl für die Bildung als auch für die Aufrechterhaltung der Ausläufer notwendig sind. Die durch polyklonale Antikörper induzierte Bildung von Ausläufern kann sowohl durch die Inhibierung der Src-Kinase Fyn, welche in lipid rafts lokalisiert ist, als auch der 44/42 MAPK gehemmt werden. Zudem führt die Aggregation von TM-Agrin durch polyklonale Antikörper zu einer erhöhten Aktivität der Fyn- und 44/42 MAP-Kinase. Im Gegensatz dazu hat eine Inhibierung der PI3-Kinase keine Auswirkungen auf die Bildung der Ausläufer. Der intrazelluläre, sekundäre Botenstoff cGMP, nicht aber cAMP, fördert die Bildung von Ausläufern. Die konzentrationsabhängige Blockierung des Coxsackie-Adenovirus-Rezeptors (CAR) führt zu einer Hemmung der Ausläuferbildung. Ferner interagiert CAR im Zentralnervensystem während der Phase des aktiven axonalen Wachstums mit TM-Agrin und induziert nach Überexpression in neuronalen und nicht-neuronalen Zellen die Bildung von Ausläufern. In der vorliegenden Arbeit konnten somit Teilabschnitte der durch TM-Agrin induzierten Signalkaskade entschlüsselt werden.

Expressions- und Funktionsanalysen von Neuroglobin und Cytoglobin

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden Untersuchungen zur Expression und Funktion der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Ngb) und Cytoglobin (Cygb) in Vertebraten durchgeführt. Beide Globine wurden erst kürzlich entdeckt, und ihre Funktionen konnten trotz vorliegender Daten zur Struktur und biochemischen Eigenschaften dieser Proteine bisher nicht eindeutig geklärt werden. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre und subzelluläre Lokalisation von Neuroglobin und Cytoglobin in murinen Gewebeschnitten untersucht. Die Expression von Ngb in neuronalen und endokrinen Geweben hängt offensichtlich mit den hohen metabolischen Aktivitäten dieser Organe zusammen. Insbesondere im Gehirn konnten regionale Unterschiede in der Ngb-Expression beobachtet werden. Dabei korrelierte eine besonders starke Neuroglobin-Expression mit Gehirnbereichen, die bekanntermaßen die höchsten Grundaktivitäten aufweisen. In Anbetracht dessen liegt die Funktion des Neuroglobins möglicherweise im basalen O2-Metabolismus dieser Gewebe, wobei Ngb als O2-Lieferant und kurzfristiger O2-Speicher den vergleichsweise hohen Sauerstoffbedarf vor Ort sicherstellen könnte. Weitere Funktionen in der Entgiftung von ROS bzw. RNS oder die kürzlich publizierte mögliche Rolle des Ngb bei der Verhinderung der Mitochondrien-vermittelten Apoptose durch eine Reduktion des freigesetzten Cytochrom c wären darüber hinaus denkbar. Die Cygb-Expression im Gehirn beschränkte sich auf relativ wenige Neurone in verschiedenen Gehirnbereichen und zeigte dort vorwiegend eine Co-Lokalisation mit der neuronalen NO-Synthase. Dieser Befund legt eine Funktion des Cytoglobins im NO-Metabolismus nahe. Quantitative RT-PCR-Experimente zur mRNA-Expression von Ngb und Cygb in alternden Säugern am Bsp. der Hamsterspezies Phodopus sungorus zeigten keine signifikanten Änderungen der mRNA-Mengen beider Globine in alten im Vergleich zu jungen Tieren. Dies widerspricht publizierten Daten, in denen bei der Maus anhand von Western Blot-Analysen eine Abnahme der Neuroglobin-Menge im Alter gezeigt wurde. Möglicherweise handelt es sich hierbei um speziesspezifische Differenzen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte vergleichende Sequenzanalyse der humanen und murinen NGB/Ngb-Genregion liefert zum einen Hinweise auf die mögliche Regulation der Ngb-Expression und zum anderen eine wichtige Grundlage für die funktionellen Analysen dieses Gens. Es konnte ein minimaler Promotorbereich definiert werden, der zusammen mit einigen konservierten regulatorischen Elementen als Basis für experimentelle Untersuchungen der Promotoraktivität in Abhängigkeit von äußeren Einflüssen dienen wird. Bioinformatische Analysen führten zur Identifizierung des sog. „neuron restrictive silencer element“ (NRSE) im Ngb-Promotor, welches vermutlich für die vorwiegend neuronale Expression des Proteins verantwortlich ist. Die kontrovers diskutierte O2-abhängige Regulation der Ngb-Expression konnte hingegen anhand der durchgeführten komparativen Sequenzanalysen nicht bestätigt werden. Es wurden keine zwischen Mensch und Maus konservierten Bindestellen für den Transkriptionsfaktor HIF-1 identifiziert, der die Expression zahlreicher hypoxieregulierter Gene, z.B. Epo und VEGF, vermittelt. Zusammen mit den in vivo-Daten spricht dies eher gegen eine Regulation der Ngb-Expression bei verminderter Verfügbarkeit von Sauerstoff. Die Komplexität der Funktionen von Ngb und Cygb im O2-Stoffwechsel der Vertebraten macht den Einsatz muriner Modellsysteme unerlässlich, die eine sukzessive Aufklärung der Funktionen beider Proteine erlauben. Die vorliegende Arbeit liefert auch dazu einen wichtigen Beitrag. Die hergestellten „gene-targeting“-Vektorkonstrukte liefern in Verbindung mit den etablierten Nachweisverfahren zur Genotypisierung von embryonalen Stammzellen die Grundlage zur erfolgreichen Generierung von Ngb-knock out sowie Ngb- und Cygb-überexprimierenden transgenen Tieren. Diese werden für die endgültige Entschlüsselung funktionell relevanter Fragestellungen von enormer Bedeutung sein.

Expression und Funktion der Lyn Kinase in Oligodendrozyten

Die Bildung, Aufrechterhaltung und die Funktionalität von Oligodendrozyten, den myelinisierenden Zellen des ZNS, bedarf einer präzisen Regulation von Ereignissen wie Migration, Proliferation und Differenzierung. Die Src-Kinasen spielen in vielen Signalkaskaden eine zentrale Rolle. In murinen Oligodendrozyten werden die beiden Src-Kinasen Fyn und Lyn exprimiert, diese Arbeit konzentriert sich auf die Analyse der Lyn Kinase. Es konnte die Expression von Lyn in Oligodendrozyten und Myelin in vitro und in vivo bestätigen werden, sowie die Lokalisation innerhalb und außerhalb von rafts. Je älter die Mäuse, desto weniger Lyn wird in Myelin exprimiert und desto stärker ist das verbleibende Lyn in den rafts lokalisiert. Die Aktivität von Lyn ist im Myelin 12-Tage alter Mäuse am höchsten. Synchronisation des Zellzyklus in Oli-neu Zellen zeigte eine zyklische Expression von Lyn. Transfektion aktiver und inaktiver Konstrukte machte deutlich, dass eine Lyn Aktivität die Zellausläufer Bildung, sowie die Differenzierung der Zelle, hemmt. Es konnte eine Assoziation der GluRB/C Untereinheit des AMPA Rezeptors mit Lyn nachgewiesen werden. Stimulierung des AMPA-Rezeptors mit Glutamat führte zu einer Aktivierung der Lyn Kinase und daraus resultierend, zu einer Inhibierung der Zelldifferenzierung. Welche biologische Relevanz diese Ergebnisse haben könnten, wurde in drei Hypothesen festgehalten. Zum einen könnte die Lyn Kinase den zeitlichen Übergang von Proliferation und Differenzierung in Oligodendrozyten regulieren und zwar sowohl in perinatalen oligodendroglialen Vorläuferzellen, als auch, unter besonderen Umständen, in adulten oligodendroglialen Vorläuferzellen. Des Weiteren könnte die Lyn Kinase auch eine Rolle in der Neuron-Glia-Synapsenbildung spielen. Weitere Versuche, insbesondere in vivo, müssen folgen, um diese Hypothesen zu bestätigen oder zu widerlegen.

Genetische und funktionelle Analyse von Vesikelmembranprotein-Mutanten in Maus und Caenorhabditis elegans

Tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) sind konservierte, ubiquitär vorkommende Membranproteine synaptischer Vesikel und zytoplasmatischer Transportvesikel. Bei Säugetieren lassen sie sich in die Physine, Gyrine und SCAMPs (secretory carrier-associated membrane proteins) unterteilen, die im Nematoden C. elegans jeweils nur durch ein einzelnes Polypeptid vertreten sind (Synaptophysin-1 [SPH-1], Synaptogyrin-1 [SNG-1] und SCAMP-1 [SCM-1]). Obwohl den TVPs eine Beteiligung bei der Regulation des Vesikelzyklus zugesprochen wurde, sind Synaptophysin-1-Knockout-Mäuse und vollständig TVP-defiziente Würmer gesund und weisen nur geringgradige Veränderungen auf. In dieser Arbeit sollten daher zum einen genomweite komparative Transkriptomanalysen durchgeführt werden, um mögliche Kompensationsmechanismen in der Maus und C. elegans zu finden, zum anderen sollten mit Hilfe pharmakologischer Stressassays und genetischer Verfahren Schwachstellen und Redundanzen identifiziert werden. Erstaunlicherweise konnten durch Affymetrix GeneChip-Analysen der RNA in der Retina von Synaptophysin-1-/--Mäusen keine differenziell exprimierten Gene gefunden werden. Bei der Untersuchung der C. elegans-TVP-Dreifachmutante wurden hingegen 17 Gene mit erhöhter und 3 mit erniedrigter Transkription identifiziert. Die Befunde für 12 hochregulierte Gene wurden durch quantitative Real-Time RT-PCR bestätigt. Das am stärksten hochregulierte Gen arf-1.1 kodiert für eine GTPase, die vermutlich an der Regulation der Vesikelbildung beteiligt ist. Von den ebenso identifizierten Genen cdr-2, cdr-4 und pgp-9 ist bekannt, dass sie in Stresssituationen, z. B. in Gegenwart von Cadmium, verstärkt transkribiert werden. ugt-62 und ugt-19 kodieren für Glucuronosyltransferasen. Für arf-1.1, cdr-2, ugt-62 sowie für das Gen T16G1.6, das für eine coiled-coil-Domäne kodiert, wurden im Folgenden fluoreszierende Promoterkonstrukte hergestellt, um Koexpressionsmuster mit TVPs zu bestimmen. Es stellte sich heraus, dass alle vier Promoterkonstrukte im Darm zusammen mit SPH-1 und SCM-1 im Darm transkribiert werden. Mit fluoreszierenden Translationschimären konnte weiterhin gezeigt werden, dass ARF-1.1 und CDR-2 mit den Darm-spezifischen TVPs im apikalen Bereich der Darmzellen kolokalisieren. Um mehr über die Funktion von TVPs im Vesikelzyklus zu erfahren, wurden pharmakologische und genetische Analysen von Würmern durchgeführt, in denen die Expression des Neuronen-spezifischen SNG-1 verändert ist. Deletion oder Überexpression führte zu einer Resistenz gegenüber dem Acetylcholinesterase-Inhibitor Aldicarb und zu erhöhter Empfindlichkeit gegenüber dem GABA-Rezeptor-Antagonisten Pentylentetrazol. Auf genetischer Ebene zeigte sich, dass sng-1 synthetisch mit den Genen für Synaptotagmin-1, Endophilin A sowie Synaptojanin wirkt. Die beobachteten Effekte weisen auf alternative Funktionen in der synaptischen Übertragung hin und unterstützen zugleich die Hypothese, dass SNG-1 im synaptischen Vesikelzyklus eine wichtige Funktion erfüllt, die möglicherweise einem noch unbekannten redundanten Kompartiment-spezifischen Signalweg der synaptischen Transmission zuzuordnen ist.

Aktivitätsabhängige Kontrolle der Apoptose in neonatalen kortikalen Neuronen und Etablierung eines Biosensors zur Echtzeitanalyse der Caspase-3-Aktivierung

Die Apoptose spielt eine entscheidende Rolle während der normalen Entwicklung des zentralen Nervensystems. Elektrische Aktivität und die Versorgung mit trophischen Faktoren sind ausschlaggebend für das Überleben von Neuronen. Um zu untersuchen, welche zellulären Prozesse die aktivitätsabhängige Apoptose in organotypischen Schnittkulturen des neugeborenen Neokortex beeinflussen, wurde in der vorliegenden Arbeit immunzytochemisch das Auftreten aktivierter Caspase-3, nach pharmakologischer Beeinflussung von Ionenkanälen und membranständigen Rezeptoren analysiert. Die Unterdrückung neuronaler Aktivität durch den Natriumionenkanalblocker TTX führte zu einem signifikanten Verlust kortikaler Neuronen. Ein ähnlicher Anstieg der Zahl apoptotischer Neurone konnte durch Applikation von Antagonisten ionotroper Glutamatrezeptoren, GABAA-Rezeptoren oder neuronaler Gap Junctions induziert werden. Jedoch konnte bei einigen Antagonisten die apoptosefördernde Wirkung erst nach längerer Einwirkung beobachtet werden. Im Weiteren wurde eine Methode etabliert, mit deren Hilfe eine Echtzeitanalyse der Apoptose kortikaler Neurone unter dem Entzug trophischer Faktoren in Gegenwart unterschiedlicher extrazellulärer Kaliumkonzentrationen ermöglicht wurde. Dazu wurden dissoziierte kortikale Kulturen mit dem pCaspase3-sensor Vektor transfiziert. Das durch dieses Plasmid codierte fluoreszente Protein wird Caspase-3 abhängig gespalten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Caspase3-sensor spezifisch für die Aktivierung der Caspase-3 ist, und dass die Überlebensfähigkeit der transfizierten Neurone durch das Transfektionsprotokoll nicht beeinflusst wird.

Charakterisierung der neuroprotektiven Eigenschaften des Corticotropin-Releasing-Hormons

Das Corticotropin Releasing Hormon (CRH) ist ein zentraler Mediator des neuroendokrinen Systems von Säugetieren und kontrolliert die physiologische Stressreaktion des Körpers. Zudem zeigten in vitro Daten, dass es Neuroprotektion gegenüber oxidativem Stress induzieren kann. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals ein neuroprotektiver Effekt des CRH in vivo gezeigt werden. Die Überexpression des CRH im ZNS von Mäusen konnte Nervenzellen in vivo vor Exzitotoxizität schützen; nach Injektion des Exzitotoxins Kainat verkürzte die CRH-Überexpression die Dauer der epileptischen Anfälle, schützte die Neurone der betroffenen Hippocampusregion vor Zelltod und verhinderte die bei Exzitotoxizität und vielen neurodegenerativen Erkrankungen auftretende Neuroinflammation. Desweiteren konnten in CRH-überexprimierenden Tieren erhöhte BDNF-Proteinspiegel nachgewiesen werden. BDNF, ein bedeutender neurotropher Faktor im ZNS, vermittelt daher teilweise die CRH-induzierte Neuroprotektion gegenüber der Exzitotoxizität in vivo. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Connexin43, dem Haupt-Gap Junction-Protein der Astrozyten, ein neues CRH-Zielgen im ZNS identifiziert. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass CRH sowohl die Expression des Connexin43-Gens als auch den Connexin43-Proteinspiegel in vitro und in vivo erhöht. Diese Effekte werden über die Aktivierung des CRH-Rezeptor 1 und nachfolgend der PKA- und MAPK-Signalwege vermittelt. In Übereinstimmung mit der Hochregulation des Connexin43-Proteinspiegels verstärkte CRH auch die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions. Physiologisch hat diese CRH-induzierte Verstärkung der astrozytären Gap Junction-Kommunikation eine große Bedeutung für die Neuroprotektion, da eine Hochregulation der interzellulären Kommunikation schnell toxische Moleküle verdünnt, Energiesubstrate und protektive Faktoren verteilt und Ionen abpuffert. Dadurch werden Schädigungen durch oxidativen Stress in den Zellen reduziert, was über die Analyse der Proteincarbonylierung gezeigt wurde. Die Relevanz der astrozytären Gap Junction-Kommunikation für das Überleben der Neurone konnte in organotypischen hippocampalen Schnitten und in Neuron-Astrozyten-Co-Kulturen deutlich gemacht werden. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten zeigen, dass die Stress-induzierte Sekretion von CRH im ZNS zur verstärkten Expression neuroprotektiver Moleküle wie BDNF und Connexin43 beiträgt. Diese vermögen Neurone gegenüber toxischen Einflüssen zu schützen und zum Erhalt ihrer Funktion beizutragen. Die protektiven CRH-Effekte könnten speziell bei chronischen neurodegenerativen Krankheiten wie der Alzheimerschen Demenz und der Parkinsonschen Krankheit hilfreich sein.

Comparative analysis of midline guidance and axon pathfinding in the chelicerates Achaearanea tepidariorum and Cupiennius salei

Die Neurogenese und axonale Wegfindung sind in den vergangenen Jahrzehnten Thema einer Vielzahl wissenschaftlicher Untersuchungen in den verschiedensten Organismen gewesen. Die zusammengetragenen Daten in Insekten und Crustaceen geben eine gute Übersicht darüber, wie das Nervensystem in Arthropoden aufgebaut wird. Die entwicklungsbiologischen Prozesse, die daran beteiligt sind, sind in den beiden genannten Gruppen sehr gut verstanden. In den Gruppen der Cheliceraten und Myriapoden jedoch wurden ähnliche Analysen bisher kaum durchgeführt. Das Hauptanliegen dieser Arbeit war es daher, Mechanismen in den Spinnen Achaearanea tepidariorum und Cupiennius salei, zwei Vertretern der Cheliceraten, zu untersuchen, die eine Rolle im Leitsystem der ventralen Mittellinie und bei der axonalen Wegfindung spielen. Eine Vorraussetzung hierfür sind Kenntnisse über die Architektur des Zentralnervensystems. In einem ersten Schritt beschrieb ich daher grundlegend die Morphologie des Nervensystems im Verlauf der gesamten Embryoalentwicklung. Ich konnte zeigen, dass in Spinnen ein für Arthropoden typisches Strickleiternervensystem gebildet wird. Dieses wird von segmental angelegten Neuronen geformt, wobei sowohl Gruppen von Zellen als auch einzelne Neurone daran beteiligt sind, die primären axonalen Trakte zu etablieren. Im Besonderen konnte ich eine Zelle identifizieren, die in Position, Projektionsmuster und der Expression des Markergens even-skipped vergleichbar zum PR2 Neuron in Drosophila ist, welches die posteriore Wurzel des Segmentalnervs anlegt.rnrnIn einem zweiten Ansatz untersuchte ich die ventrale Mittellinie in Spinnen im Bezug auf ihre mögliche Funktion in der axonalen Wegfindung. Es konnte gezeigt werden, dass es sich beim Epithel der Mittellinie, das die Lücke zwischen beiden Keimstreifhälften während des gesamten Prozesses der Inversion überspannt, um eine transiente Struktur handelt, die keine neuralen Zellen hervorbringt. Es ist daher vergleichbar mit der so genannten Floor plate in Vertebraten, die ebenfalls nur vorübergehend existiert. Die Untersuchung von single minded (sim) zeigte, dass es, anders als in Drosophila, wo sim ein wichtiges regulatorisches Gen für die korrekte Spezifizierung von Mittellinienzellen ist, nicht in den Zellen der Mittellinie, sondern in diesen benachbarten Zellen, exprimiert wird. Das ist vergleichbar mit Vertebraten. Zusätzlich konnte ich Expression von sim an den Basen der Gliedmassen und im Kopf nachweisen. Wie in Vertebraten könnte sim an der Musterbildung dieser Gewebe beteiligt sein. Dennoch spielt die Mittellinie in Spinnen eine wichtige Rolle als Organisator für auswachsende, kommissurale Axone. Diese Funktion teilt sie mit anderen Invertebraten und Vertebraten.rnrnDie Signaltransduktionskaskade, die an der axonalen Wegfindung an der Mittellinie beteiligt ist, ist in den verschiedensten Organismen hoch konserviert. In der vorliegenden Arbeit konnte ich sowohl in Achaearanea als auch in Cupiennius ein netrin Homolog identifizieren und eine konservierte Funktion des Wegfindungsmoleküls während der Bildung der Kommissuren aufzeigen. RNAi Experimente belegen, dass, wird die Funktion von netrin herunterreguliert, das Strickleiternervensystem nicht korrekt gebildet wird, ins Besondere die kommissuralen Faszikel. Des Weiteren konnte ich eine neue Funktion von netrin, die bisher in anderen Organsimen noch nicht beschrieben wurde, identifizieren. Neben seiner Rolle in der axonalen Wegfindung, scheint netrin auch an der epithelialen Morphogenese im zentralen Nervensystem beteiligt zu sein. In dieser Funktion scheint netrin in Gliazellen, die die epithelialen Vesikel der Invaginationsgruppen umhüllen, wichtig zu sein, um neurale Vorläuferzellen in einem undifferenzierten Zustand zu halten. Der Abbau von netrin Transkript durch RNA Interferenz führt zu einer verfrühten Segregation neuraler Vorläuferzellen aus dem epithelialen Verband der Invaginationsgruppen und zu einer Zunahme an Zellen, die den frühen Differenzierungsmarker islet exprimieren.

Klonale Analysen im embryonalen Gehirn von Drosophila mit besonderem Fokus auf die Entwicklung der Pilzkörper

Eine wichtige Voraussetzung für das Verständnis der Spezifizierungsmechanismen unterschiedlicher Zelltypen im embryonalen Gehirn ist die detaillierte Kenntnis des neuroektodermalen Ursprungs seiner neuralen Stammzellen (Neuroblasten, NB), sowie der Morphologie und zellulären Komposition der daraus hervorgehenden Zellstammbäume (ZSBe). In der vorliegenden Arbeit wurde die Entstehung und Topologie von 21 embryonalen ZSBen im anteriorsten Gehirnteil, dem Protocerebrum, charakterisiert, mit besonderem Fokus auf solche ZSBe, die den Pilzkörper konstituieren. Pilzkörper sind prominente, paarige Neuropilzentren, die eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung olfaktorischer Informationen, beim Lernen und bei der Gedächtnisbildung spielen. In dieser Arbeit konnte erstmalig die Embryonalentwicklung der Pilzkörper ab dem Zeitpunkt der Entstehung ihrer NBen im procephalen Neuroektoderm (pNE), bis hin zum funktionellen Gehirnzentrum in der frühen Larve auf Ebene individueller ZSBe bzw. einzelner Neurone beschrieben werden. Mittels der klonalen Di-Markierungstechnik konnte ich zeigen, dass die vier NBen der Pilzkörper (PKNBen) jeder Gehirnhemisphäre innerhalb des NE aus dem ventralen Bereich der mitotischen Domäne B (δB) hervorgehen. Ein in diesem Bereich liegendes proneurales Feld beherbergt etwa 10-12 Zellen, die alle das Potential haben sich zu PKNBen zu entwickeln. Des Weiteren zeigen diese Untersuchungen, dass die PKNBen (und weitere NBen der δB) aus benachbarten NE-Zellen hervorgehen. Dieser Befund impliziert, dass der Mechanismus der lateralen Inhibition in diesem Bereich des NE keine Rolle spielt. Weiterhin stellte sich heraus, dass jeder PKNB eine ihm eigene Position im sich entwickelnden Pilzkörperkortex besetzt und eine spezifische Kombination der Transkriptionsfaktoren Dachshund, Eyeless und Retinal homeobox exprimiert. Dadurch konnte jeder der vier PKNBen in den betreffenden frühembryonalen NB-Karten einem der ca. 105 NBen pro Gehirnhemisphäre zugeordnet werden. Die PKNBen bringen individuelle ZSBe hervor, die Pilzkörper-intrinsische γ-Neurone beinhalten, aber auch jeweils charakteristische Sets an Interneuronen, die nicht am Aufbau des Pilzkörpers beteiligt sind. Diese verschiedenen Neuronentypen entstehen in einer zeitlichen Abfolge, die für jeden PKNBen spezifisch ist. Ihre embryonalen ZSBe sind aber nicht nur durch individuelle Sets an frühgeborenen ni-Neuronen charakterisiert, sondern auch durch spezifische Unterschiede in der Anzahl ihrer γ-Neurone, welche jedoch, wie ich zeigen konnte, nicht durch Apoptose reguliert wird. Weiterhin konnte ich zeigen, dass γ-Neurone, in einer PKNB Klon-abhängigen Weise, spezifische Unterschiede in der räumlich-zeitlichen Innervation des Pedunkels, der Calyx und der Loben aufweisen. Im Weiteren wurde die Expression verschiedener molekularer Marker in diesen ZSBen charakterisiert, u.a. die Expression verschiedener Gal4-Fliegenstämme, und solcher Transkriptionsfaktoren, die eine wichtige Rolle bei der temporären Spezifizierung im VNS spielen. So werden hb, Kr, pdm1 auch in Nachkommenzellen der PKNBen exprimiert und haben möglicherweise eine Funktion bei ihrer temporären Spezifizierung. Diese Arbeit gibt auch erstmalig Einblick in die vollständige spätembryonale/frühlarvale Morphologie anderer protocerebraler Gehirnzellstammbäume aus δB und δ1. Die Beschreibungen dieser ZSBe beinhalten Angaben zu deren Zellzahl, Zelltypen, der Lage der ZSBe im Gehirn, axonalen/dendritischen Projektionsmustern sowie dem Entstehungsort des NBen.

Periodicities in the Hodgkin-Huxley model and versions of this model with stochastic input

A field of computational neuroscience develops mathematical models to describe neuronal systems. The aim is to better understand the nervous system. Historically, the integrate-and-fire model, developed by Lapique in 1907, was the first model describing a neuron. In 1952 Hodgkin and Huxley [8] described the so called Hodgkin-Huxley model in the article “A Quantitative Description of Membrane Current and Its Application to Conduction and Excitation in Nerve”. The Hodgkin-Huxley model is one of the most successful and widely-used biological neuron models. Based on experimental data from the squid giant axon, Hodgkin and Huxley developed their mathematical model as a four-dimensional system of first-order ordinary differential equations. One of these equations characterizes the membrane potential as a process in time, whereas the other three equations depict the opening and closing state of sodium and potassium ion channels. The membrane potential is proportional to the sum of ionic current flowing across the membrane and an externally applied current. For various types of external input the membrane potential behaves differently. This thesis considers the following three types of input: (i) Rinzel and Miller [15] calculated an interval of amplitudes for a constant applied current, where the membrane potential is repetitively spiking; (ii) Aihara, Matsumoto and Ikegaya [1] said that dependent on the amplitude and the frequency of a periodic applied current the membrane potential responds periodically; (iii) Izhikevich [12] stated that brief pulses of positive and negative current with different amplitudes and frequencies can lead to a periodic response of the membrane potential. In chapter 1 the Hodgkin-Huxley model is introduced according to Izhikevich [12]. Besides the definition of the model, several biological and physiological notes are made, and further concepts are described by examples. Moreover, the numerical methods to solve the equations of the Hodgkin-Huxley model are presented which were used for the computer simulations in chapter 2 and chapter 3. In chapter 2 the statements for the three different inputs (i), (ii) and (iii) will be verified, and periodic behavior for the inputs (ii) and (iii) will be investigated. In chapter 3 the inputs are embedded in an Ornstein-Uhlenbeck process to see the influence of noise on the results of chapter 2.

Funktionelle Analyse der Plasmamembran-Ca 2+-ATPase 2 -PMCA2- in Modellen der Neurodegeneration

Calcium (Ca2+) ist ein ubiquitär vorkommendes Signalmolekül, das an der Regulation zahlreicher zellulärer Prozesse, von der Proliferation bis zum programmierten Zelltod, beteiligt ist. Daher müssen die intrazellulären Ca2+-Spiegel streng kontrolliert werden. Veränderungen der Ca2+-Homöostase während der altersassoziierten Neurodegeneration können dazu beitragen, dass Neuronen vulnerabler sind. So wurden erhöhte Ca2+-Konzentrationen in gealterten Neuronen, begleitet von einer erhöhten Vulnerabilität, beobachtet (Hajieva et al., 2009a). Weiterhin wird angenommen, dass der selektive Untergang von dopaminergen Neuronen bei der Parkinson Erkrankung auf eine erhöhte Ca2+-Last zurückzuführen sein könnte, da diese Neuronen einem ständigen Ca2+-Influx,rnaufgrund einer besonderen Isoform (CaV 1.3) spannungsgesteuerter Ca2+-Kanäle des L-Typs, ausgesetzt sind (Chan et al., 2007). Bislang wurden die molekularen Mechanismen, die einem Ca2+-Anstieg zu Grunde liegen und dessen Auswirkung jedoch nicht vollständig aufgeklärt und daher in der vorliegenden Arbeit untersucht. Um Veränderungen der Ca2+-Homöostase während der altersassoziiertenrnNeurodegeneration zu analysieren wurden primäre Mittelhirnzellen aus Rattenembryonen und SH-SY5Y-Neuroblastomazellen mit dem Neurotoxin 1-Methyl-4-Phenyl-Pyridin (MPP+), das bei der Etablierung von Modellen der Parkinson-Erkrankung breite Anwendung findet, behandelt. Veränderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration wurden mit einem auf dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-basierten Ca2+-Indikator,rn„Cameleon cpYC 3.6“ (Nagai et al., 2004), ermittelt. Dabei wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass MPP+ die Abregulation der neuronenspezifischen ATP-abhängigen Ca2+-Pumpe der Plasmamembran (PMCA2) induziert, die mit der Ca2+-ATPase des endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und dem Na+/Ca2+-Austauscher (NCX) das zelluläre Ca2+-Effluxsystem bildet, was zu einer erhöhten zytosolischen Ca2+-Konzentration führt. Die PMCA2-Abnahme wurde sowohl auf Transkriptionsebene als auch auf Proteinebene demonstriert, während keine signifikanten Veränderungen der SERCA- und NCX-Proteinmengen festgestellt wurden. Als Ursache der Reduktion der PMCA2-Expression wurde eine Abnahme des Transkriptionsfaktors Phospho-CREB ermittelt, dessen Phosphorylierungsstatus abhängig von der Proteinkinase A (PKA) war. Dieser Mechanismus wurde einerseits unter MPP+-Einfluss und andererseits vermittelt durch endogene molekulare Modulatoren gezeigt. Interessanterweise konnten die durch MPP+ induzierte PMCA2-Abregulation und der zytosolische Ca2+-Anstieg durch die Aktivierung der PKA verhindert werden. Parallel dazu wurde eine MPP+-abhängige verringerte mitochondriale Ca2+-Konzentration nachgewiesen, welche mit einer Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials korrelierte. Darüber hinaus kam es als Folge der PMCA2-Abnahme zu einem verminderten neuronalen Überleben.rnVeränderungen der Ca2+-Homöostase wurden auch während der normalen Alterung inrnprimären Fibroblasten und bei Mäusen nachgewiesen. Dabei wurden verringerte PMCA und SERCA-Proteinmengen in gealterten Fibroblasten, einhergehend mit einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration demonstriert. Weiterhin wurden verringerte PMCA2-Proteinmengen im Mittelhirn von gealterten Mäusen (C57B/6) detektiert.rnDer zelluläre Ca2+-Efflux ist somit sowohl im Zuge der physiologischen Alterung als auch in einem altersbezogenen Krankheitsmodell beeinträchtigt, was das neuronale Überleben beeinflussen kann. In zukünftige Studien soll aufgeklärt werden, welche Auswirkungen einer PMCA2-Reduktion genau zu dem Verlust von Neuronen führen bzw. ob durch eine PMCA2-Überexpression neurodegenerative Prozesse verhindert werden können.

Behavioural analysis of mouse mutants with altered neuronal and glial genes

Im ersten Teil dieser Doktorarbeit beabsichtigte meine Arbeit, die funktionelle Beteiligung des CB1 Rezeptors, einer Hauptkomponente des neuronalen Endocannabinoid-Systems (ECS), an der Ausbildung von verschiedenen Verhaltensphänotypen mit Hilfe von konditionalen Mausmutanten, denen der CB1 Rezeptor auf verschiedenen neuronalen Unterpopulationen fehlt, aufzuschlüsseln und zu untersuchen. Verschiedene Verhaltensmodelle wurden hierzu getestet. Dabei lag der Fokus dieser Arbeit auf der CB1f/f;D1-Cre Mauslinie, welche der CB1 Rezeptor auf den D1 Rezeptor exprimierenden Neuronen des Striatums fehlt. Ich konnte zeigen, dass der Verlust des CB1 Rezeptors auf diesen Neuronen keinen Einfluss auf basale neurologische Funktionen, Gewicht, Bewegung, Exploration, Sozialverhalten, Angst und Stressbewältigung der Tiere hat, jedoch eine Beteiligung an der Entwicklung von Suchtverhalten gegeben ist. Bei Betrachtung des Kokain-induzierten Suchtverhaltens zeigten die konditionalen Mausmutanten eine reduzierte Suchtanfälligkeit sowohl im Vergleich zu Tieren mit einem totalen CB1 Rezeptor Verlust in allen Körperzellen, als auch zu genetisch unveränderten Kontrollmäusen beider Linien.rnDes Weiteren zeigen die Ergebnisse dieser Studie eine große, aber gegensätzliche Beteiligung des ECS bei der Regulation von Exploration in Abhängigkeit des Verlustes des CB1 Rezeptors auf GABAergen Neuronen des Vorderhirns und kortikalen glutamatergen Neuronen, jedoch nicht auf striatalen Neuronen alleine. Zusätzlich war ich in der Lage, die Wichtigkeit des genetischen Hintergrunds von Mauslinien nicht nur auf die Ausbildung von spezifischen Verhaltensphänotypen, sondern auch auf die Genexpression zu zeigen.rnIn dem zweiten Teil dieser Arbeit, in dem ich mich auf die Funktion von Gliazellen konzentrierte, wurden ebenfalls Mausmutanten in verschiedenen Verhaltensmodellen getestet. Ein genetisches Auslöschen des NG2 Glykoproteins in Gliazellen sorgt in den Knock-out Mäusen für ein schlechteres Hörvermögen und ein reduziertes Depressionsverhalten im Vergleich zu ihren Wildtyp-Kontrollmäusen. Interessanterweise zeigten diese Tiere auch eine reduzierte Empfänglichkeit bei chemisch induzierten epileptischen Krämpfen, was eine Rolle des NG2 Glykoproteins bei der Kontrolle der glutamatergen Homöostase vorschlägt, die wahrscheinlich durch Strukturänderungen der Neuron-Glia-Synapse verursacht wird. rn