Molecular characterization of the immune modulatory function of matrix metalloproteinase-7, a factor in the tumour micromilieu

Matrix metalloproteinases are the components of the tumour microenvironment which play a crucial role in tumour progression. Matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) is expressed in a variety of tumours and the expression is associated with an aggressive malignant phenotype and poor prognosis. A role for MMP-7 in the immune escape of tumours has been postulated, but the mechanisms are not clearly understood. The present study was focused on identifying physiological inactivators of MMP-7 and also to unravel the mechanisms involved in MMP-7 mediated immune escape. This study shows that human leukocyte elastase (HLE), secreted by polymorphonuclear leukocytes cleaves MMP-7 in the catalytic domain as revealed by N-terminal sequencing. Further analysis demonstrates that the activity of MMP-7 was drastically decreased after HLE treatment in a time and dose dependent manner. MMP-7 induces apoptosis resistance in tumour cells by cleaving CD95 and CD95L. The effect of HLE on MMP-7 mediated apoptosis resistance was analysed. In vitro stimulation of apoptosis by anti-Apo-1 (anti-CD95 antibody) and the chemotherapeutic drug doxorubicin is reduced by MMP-7. Also tumour specific cytotoxic T cells do not effectively kill tumour cells in the presence of MMP-7. This study revealed that HLE abrogates the negative effect of MMP-7 on apoptosis induced by CD95 stimulation, doxorubicin or cytotoxic T cells and restores apoptosis sensitivity of tumour cells. To gain insight into the possible immune modulatory functions of MMP-7, experiments were performed to identify new immune relevant substrates. The human T cell line, Jurkat, was selected for these studies. Hsc70 which is involved in uncoating of clathrin vesicles was found in the supernatants of the MMP-7 treated cells indicating a modulatory role of MMP-7 on endocytosis. Further studies demonstrated that MMP-7 leads to decreased clathrin staining in HEK293, HepG2, Jurkat, CD4+ T cells and dendritic cells. Results also show MMP-7 treatment increased surface expression of cytotoxic T lymphocyte associated protein-4 (CTLA-4) which accumulated due to inhibition of the clathrin mediated internalization in CD4+CD25+ cells.

Aktivität der humanen Meprin-Metalloproteasen unter Berücksichtigung potentieller Aktivatoren

Die Metalloproteasen Meprin α und Meprin β sind an essentiellen (patho)physiologischen Prozessen beteiligt. Um die Funktion dieser Proteasen zu verstehen, ist es von Bedeutung, sie nicht isoliert, sondern im gesamten proteolytischen Netzwerk zu betrachten.rnDie Meprine werden in einer Vielzahl von Geweben, in Leukozyten, aber auch in Krebszellen exprimiert. In der Haut konnten die beiden Enzyme in unterschiedlichen dermalen Schichten detektiert werden, wo sie u.a. an der Kollagenassemblierung durch Abspaltung der Propeptide beteiligt sind. rnIm Zuge von Proteomics Analysen konnten mehr als 3000 proteolytische Schnittstellen von fünf Astacin-Metalloproteasen (Meprin α, Meprin β, Astacin, LAST und LAST_MAM) in Peptiden und nativen Substraten identifiziert werden und somit eine Aussage über die Spaltspezifität getroffen werden. In der vorliegenden Arbeit konnten diese Spaltspezifitäten mit Hilfe von fluorogenen Substraten in vitro verifiziert werden. Bemerkenswert hierbei ist die starke Präferenz der beiden Meprine und LAST_MAM für die Aminosäuren Aspartat und Glutamat in der P1‘ Position. rnMeprine werden als Zymogene exprimiert und müssen durch proteolytische Prozessierung einer tryptischen Protease aktiviert werden. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit waren Aktivitätsbestimmungen beider Meprine unter Berücksichtigung potentieller Aktivatoren und Substrate. Es konnten die kallikrein-related peptidases (KLK) 4, 5 und 8 als spezifische Aktivatoren identifiziert werden, wobei nur KLK5 beide Proteasen aktiviert. Sowohl KLK4 als auch KLK8 sind lediglich in der Lage, das Propeptid von Meprin β abzuspalten. Außerdem konnte biochemisch und mittels Proteomics gezeigt werden, dass proKLK7 von Meprin β prozessiert wird. Durch N-terminale Sequenzierung wurde eine Schnittstelle zwei Aminosäuren N-terminal der eigentlichen Aktivierungsstelle identifiziert. Dieser Schritt beschleunigt die Aktivierung von KLK7, wenn durch Trypsin noch das verbliebene Dipeptid abgespalten wird. rnDa einige Vertreter der humanen kallikrein-related peptidases (KLK) als Meprin-Aktivatoren identifiziert werden konnten, sollten diese im Zuge dieser Arbeit im Modellorganismus Danio rerio untersucht werden. Durch in silico und RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, dass keine funktionellen KLK-Homologe im Zebrafisch codiert sind. Da somit andere tryptische Proteasen an der Aktivierung der Meprine beteiligt sein müssen, wurde die Transmembran-Serinprotease TMPRSS4 analysiert. In der Tat zeigte die Reduktion des Expressionslevels von TMPRSS4 durch Morpholino-Injektion drastische Störungen in der embryonalen Entwicklung von Zebrabärblingen. Mittels Licht- und Rasterelektronenmikroskopie ließ sich eine Fehlbildung der epidermalen Haut bis zu einem Ablösen der Keratinozyten von dem darunter liegenden Gewebe feststellen. rn

Comparative genomic sequencing analysis of a region in human chromosome 11p15.3, mouse chromosome 7 and analysis of the novel STK33, Stk33 gene

The comparative genomic sequence analysis of a region in human chromosome 11p15.3 and its homologous segment in mouse chromosome 7 between ST5 and LMO1 genes has been performed. 158,201 bases were sequenced in the mouse and compared with the syntenic region in human, partially available in the public databases. The analysed region exhibits the typical eukaryotic genomic structure and compared with the close neighbouring regions, strikingly reflexes the mosaic pattern distribution of (G+C) and repeats content despites its relative short size. Within this region the novel gene STK33 was discovered (Stk33 in the mouse), that codes for a serine/threonine kinase. The finding of this gene constitutes an excellent example of the strength of the comparative sequencing approach. Poor gene-predictions in the mouse genomic sequence were corrected and improved by the comparison with the unordered data from the human genomic sequence publicly available. Phylogenetical analysis suggests that STK33 belongs to the calcium/calmodulin-dependent protein kinases group and seems to be a novelty in the chordate lineage. The gene, as a whole, seems to evolve under purifying selection whereas some regions appear to be under strong positive selection. Both human and mouse versions of serine/threonine kinase 33, consists of seventeen exons highly conserved in the coding regions, particularly in those coding for the core protein kinase domain. Also the exon/intron structure in the coding regions of the gene is conserved between human and mouse. The existence and functionality of the gene is supported by the presence of entries in the EST databases and was in vivo fully confirmed by isolating specific transcripts from human uterus total RNA and from several mouse tissues. Strong evidence for alternative splicing was found, which may result in tissue-specific starting points of transcription and in some extent, different protein N-termini. RT-PCR and hybridisation experiments suggest that STK33/Stk33 is differentially expressed in a few tissues and in relative low levels. STK33 has been shown to be reproducibly down-regulated in tumor tissues, particularly in ovarian tumors. RNA in-situ hybridisation experiments using mouse Stk33-specific probes showed expression in dividing cells from lung and germinal epithelium and possibly also in macrophages from kidney and lungs. Preliminary experimentation with antibodies designed in this work, performed in parallel to the preparation of this manuscript, seems to confirm this expression pattern. The fact that the chromosomal region 11p15 in which STK33 is located may be associated with several human diseases including tumor development, suggest further investigation is necessary to establish the role of STK33 in human health.

Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung des Dmxl1-Gen in Mus musculus sowie die funktionelle Analyse durch Knock-Out

Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung des Dmxl1-Gen in Mus musculus sowie die funktionelle Analyse durch Knock-OutrnrnBei Dmxl1 handelt es sich um ein neuartiges Gen aus Mus musculus. Das ebenfalls in der vorliegenden Arbeit bioinformatisch untersuchte Gen DMXL1 ist das zu Dmxl1 homologe Gen des Menschen. Beide Gene bestehen aus 43 Exons, das murine Dmxl1 codiert für eine mRNA von 10992 bp bzw. 12210 bp, das humane DMXL1 kodiert für eine cDNA von 11082 bp, der offene Leserahmen umfasst bei der Maus 9042 bp. In der Maus konnte ein mögliches alternatives Polyadenylierungssignal identifiziert werden. Zwischen beiden Spezies sind die Exonpositionen und ihre Längen hoch konserviert. Dmxl1 liegt auf dem Crick-Strang von Chromosom 18 Bande C, der translatierte Bereich erstreckt sich auf genomischer Ebene über 129558 bp und die Orientierung verläuft in Richtung Centromer. Dmxl1 und DMXL1 gehören damit zu den größten bekannten Genen in Maus und Mensch. Bei beiden Spezies liegen die DmX-Homologen genomisch innerhalb eines Bereichs der Isochoren-Klasse L1 in einer Gen-armen Region. Die Anzahl der repetitiven Elemente innerhalb der Genregion von Dmxl1 liegt 6% unter dem erwarteten Wert eines L1 Isochors, die Anzahl beim Menschen liegt 4% über dem erwarteten Wert. Um die mögliche Promotorstruktur von Dmxl1 darzustellen, wurden umfangreiche in silico-Analysen der Region um den putativen Transkriptionsstart vorgenommen. Mit Hilfe der gewonnenen Daten konnte ein Transkriptionstartpunkt identifiziert werden. Zudem wurde eine Promotorstruktur erarbeitet, bei der angenommen werden kann, dass sie eine gute Näherung an die tatsächlich vorhandenen Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren darstellt. Die mit bioinformatischen Werkzeugen erzeugte virtuelle Promotor- und Enhancerstruktur zeigt das Potenzial, Dmxl1 basal und ubiquitär zu exprimieren. Gleichzeitig zeigen diese Daten, dass Dmxl1 vermutlich in einigen Geweben der Keimbahn, im Fettgewebe, dem blutbildenen System und während der Embryogenese hochkomplex reguliert werden kann. Eine regulierte Expression zur Steuerung des Energiestoffwechsels ist ebenfalls wahrscheinlich. Diese Ergebnisse passen sehr gut zu den experimentell ermittelten Daten und den beobachteten Phänotypen Dmxl1-chimärer Mäuse.rnDie abgeleitete Aminosäuresequenz umfasst in der Maus 3013 AS, im Menschen 3027 AS, der Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigt eine Identität von 89,3 % und eine Similarität von 94,7 % zwischen beiden Spezies. Im Dmxl1/DMXL1-Protein von Maus und Mensch konnten mindestens 24 und maximal 36 WD-Wiederholungseinheiten identifiziert werden, zudem wurden eine Reihe weiterer konservierter Proteinmotive gefunden. Die in silico-Strukturanalysen beider abgeleiteter Aminosäuresequenzen lässt vermuten, dass sich C- und N-terminal WD-Propellerstrukturen befinden. In dieser Arbeit gelang eine C-terminale Rekonstruktion einer 10-blättrigen Propellerstruktur, denkbar ist jedoch auch eine Struktur mit mindestens drei WD-Propellern, wenn eine prädominante Struktur mit Propellern aus jeweils sieben Propellerblättern angenommen wird.rnDas primäre Ziel dieser Arbeit, die Etablierung einer stabilen Mauslinie mit diruptiertem Dmxl1-Gen konnte aufgrund einer beobachteten Haploinsuffizienz nicht erreicht werden. Trotz zahlreicher Transformationen von Maus-Stammzelllinien konnte letztlich nur eine stabil transformierte Linie mit einem Dmxl1-Null-Allel identifiziert werden, was auch zu den theoretischen Daten und den angenommenen Aufgaben von Dmxl1 als komplex und diffizil reguliertes Multifunktions-Protein passt. Aus der transformierten Mauszelllinie konnten chimäre Mäuse entwickelt werden, die in Abhängigkeit von dem Ausmaß des Chimärismus phänotypisch massive Schädigungen aufwiesen. Neben einer Teilsterilität wurden massive Fettleibigkeit und ein ausgeprägter Hypogonadismus beobachtet. Keines der Tiere war in der Lage das Dmxl1-Null-Allel zu transduzieren. Die Tiere waren nur sehr eingeschränkt fertil, die wenigen Nachkommen entsprachen genotypisch und phänotypisch ausschließlich den verwendeten Blastocysten.rn

Biochemical analysis of the phosphatase domain of the human soluble epoxide hydrolase (sEH)

Die lösliche Epoxidhydrolase (sEH) gehört zur Familie der Epoxidhydrolase-Enzyme. Die Rolle der sEH besteht klassischerweise in der Detoxifikation, durch Umwandlung potenziell schädlicher Epoxide in deren unschädliche Diol-Form. Hauptsächlich setzt die sEH endogene, der Arachidonsäure verwandte Signalmoleküle, wie beispielsweise die Epoxyeicosatrienoic acid, zu den entsprechenden Diolen um. Daher könnte die sEH als ein Zielenzym in der Therapie von Bluthochdruck und Entzündungen sowie diverser anderer Erkrankungen eingesetzt werden. rnDie sEH ist ein Homodimer, in dem jede Untereinheit aus zwei Domänen aufgebaut ist. Das katalytische Zentrum der Epoxidhydrolaseaktivität befindet sich in der 35 kD großen C-terminalen Domäne. Dieser Bereich der sEH s wurde bereits im Detail untersucht und nahezu alle katalytischen Eigenschaften des Enzyms sowie deren dazugehörige Funktionen sind in Zusammenhang mit dieser Domäne bekannt. Im Gegensatz dazu ist über die 25 kD große N-terminale Domäne wenig bekannt. Die N-terminale Domäne der sEH wird zur Haloacid Dehalogenase (HAD) Superfamilie von Hydrolasen gezählt, jedoch war die Funktion dieses N-terminal Domäne lange ungeklärt. Wir haben in unserer Arbeitsgruppe zum ersten Mal zeigen können, dass die sEH in Säugern ein bifunktionelles Enzym ist, welches zusätzlich zur allgemein bekannten Enzymaktivität im C-terminalen Bereich eine weitere enzymatische Funktion mit Mg2+-abhängiger Phosphataseaktivität in der N-terminalen Domäne aufweist. Aufgrund der Homologie der N-terminalen Domäne mit anderen Enzymen der HAD Familie wird für die Ausübung der Phosphatasefunktion (Dephosphorylierung) eine Reaktion in zwei Schritten angenommen.rnUm den katalytischen Mechanismus der Dephosphorylierung weiter aufzuklären, wurden biochemische Analysen der humanen sEH Phosphatase durch Generierung von Mutationen im aktiven Zentrum mittels ortsspezifischer Mutagenese durchgeführt. Hiermit sollten die an der katalytischen Aktivität beteiligten Aminosäurereste im aktiven Zentrum identifiziert und deren Rolle bei der Dephosphorylierung spezifiziert werden. rnrnAuf Basis der strukturellen und möglichen funktionellen Ähnlichkeiten der sEH und anderen Mitgliedern der HAD Superfamilie wurden Aminosäuren (konservierte und teilweise konservierte Aminosäuren) im aktiven Zentrum der sEH Phosphatase-Domäne als Kandidaten ausgewählt.rnVon den Phosphatase-Domäne bildenden Aminosäuren wurden acht ausgewählt (Asp9 (D9), Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124), Lys160 (K160), Asp184 (D184), Asp185 (D185), Asn189 (N189)), die mittels ortsspezifischer Mutagenese durch nicht funktionelle Aminosäuren ausgetauscht werden sollten. Dazu wurde jede der ausgewählten Aminosäuren durch mindestens zwei alternative Aminosäuren ersetzt: entweder durch Alanin oder durch eine Aminosäure ähnlich der im Wildtyp-Enzym. Insgesamt wurden 18 verschiedene rekombinante Klone generiert, die für eine mutante sEH Phosphatase Domäne kodieren, in dem lediglich eine Aminosäure gegenüber dem Wildtyp-Enzym ersetzt wurde. Die 18 Mutanten sowie das Wildtyp (Sequenz der N-terminalen Domäne ohne Mutation) wurden in einem Expressionsvektor in E.coli kloniert und die Nukleotidsequenz durch Restriktionsverdau sowie Sequenzierung bestätigt. Die so generierte N-terminale Domäne der sEH (25kD Untereinheit) wurde dann mittels Metallaffinitätschromatographie erfolgreich aufgereinigt und auf Phosphataseaktivität gegenüber des allgemeinen Substrats 4-Nitophenylphosphat getestet. Diejenigen Mutanten, die Phosphataseaktivität zeigten, wurden anschließend kinetischen Tests unterzogen. Basiered auf den Ergebnissen dieser Untersuchungen wurden kinetische Parameter mittels vier gut etablierter Methoden berechnet und die Ergebnisse mit der „direct linear blot“ Methode interpretiert. rnDie Ergebnisse zeigten, dass die meisten der 18 generierten Mutanten inaktiv waren oder einen Großteil der Enzymaktivität (Vmax) gegenüber dem Wildtyp verloren (WT: Vmax=77.34 nmol-1 mg-1 min). Dieser Verlust an Enzymaktivität ließ sich nicht durch einen Verlust an struktureller Integrität erklären, da der Wildtyp und die mutanten Proteine in der Chromatographie das gleiche Verhalten zeigten. Alle Aminosäureaustausche Asp9 (D9), Lys160 (K160), Asp184 (D184) und Asn189 (N189) führten zum kompletten Verlust der Phosphataseaktivität, was auf deren katalytische Funktion im N-terminalen Bereich der sEH hindeutet. Bei einem Teil der Aminosäureaustausche die für Asp11 (D11), Thr123 (T123), Asn124 (N124) und Asn185 (D185) durchgeführt wurden, kam es, verglichen mit dem Wildtyp, zu einer starken Reduktion der Phosphataseaktivität, die aber dennoch für die einzelnen Proteinmutanten in unterschiedlichem Ausmaß zu messen war (2 -10% and 40% of the WT enzyme activity). Zudem zeigten die Mutanten dieser Gruppe veränderte kinetische Eigenschaften (Vmax allein oder Vmax und Km). Dabei war die kinetische Analyse des Mutanten Asp11  Asn aufgrund der nur bei dieser Mutanten detektierbaren starken Vmax Reduktion (8.1 nmol-1 mg-1 min) und einer signifikanten Reduktion der Km (Asp11: Km=0.54 mM, WT: Km=1.3 mM), von besonderem Interesse und impliziert eine Rolle von Asp11 (D11) im zweiten Schritt der Hydrolyse des katalytischen Zyklus.rnZusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass alle in dieser Arbeit untersuchten Aminosäuren für die Phosphataseaktivität der sEH nötig sind und das aktive Zentrum der sEH Phosphatase im N-terminalen Bereich des Enzyms bilden. Weiterhin tragen diese Ergebnisse zur Aufklärung der potenziellen Rolle der untersuchten Aminosäuren bei und unterstützen die Hypothese, dass die Dephosphorylierungsreaktion in zwei Schritten abläuft. Somit ist ein kombinierter Reaktionsmechanismus, ähnlich denen anderer Enzyme der HAD Familie, für die Ausübung der Dephosphorylierungsfunktion denkbar. Diese Annahme wird gestützt durch die 3D-Struktur der N-terminalen Domäne, den Ergebnissen dieser Arbeit sowie Resultaten weiterer biochemischer Analysen. Der zweistufige Mechanismus der Dephosphorylierung beinhaltet einen nukleophilen Angriff des Substratphosphors durch das Nukleophil Asp9 (D9) des aktiven Zentrums unter Bildung eines Acylphosphat-Enzym-Zwischenprodukts, gefolgt von der anschließenden Freisetzung des dephosphorylierten Substrats. Im zweiten Schritt erfolgt die Hydrolyse des Enzym-Phosphat-Zwischenprodukts unterstützt durch Asp11 (D11), und die Freisetzung der Phosphatgruppe findet statt. Die anderen untersuchten Aminosäuren sind an der Bindung von Mg 2+ und/oder Substrat beteiligt. rnMit Hilfe dieser Arbeit konnte der katalytischen Mechanismus der sEH Phosphatase weiter aufgeklärt werden und wichtige noch zu untersuchende Fragestellungen, wie die physiologische Rolle der sEH Phosphatase, deren endogene physiologische Substrate und der genaue Funktionsmechanismus als bifunktionelles Enzym (die Kommunikation der zwei katalytischen Einheiten des Enzyms) wurden aufgezeigt und diskutiert.rn

On the car sequencing problem: analysis and solution methods

This work deals with the car sequencing (CS) problem, a combinatorial optimization problem for sequencing mixed-model assembly lines. The aim is to find a production sequence for different variants of a common base product, such that work overload of the respective line operators is avoided or minimized. The variants are distinguished by certain options (e.g., sun roof yes/no) and, therefore, require different processing times at the stations of the line. CS introduces a so-called sequencing rule H:N for each option, which restricts the occurrence of this option to at most H in any N consecutive variants. It seeks for a sequence that leads to no or a minimum number of sequencing rule violations. In this work, CS’ suitability for workload-oriented sequencing is analyzed. Therefore, its solution quality is compared in experiments to the related mixed-model sequencing problem. A new sequencing rule generation approach as well as a new lower bound for the problem are presented. Different exact and heuristic solution methods for CS are developed and their efficiency is shown in experiments. Furthermore, CS is adjusted and applied to a resequencing problem with pull-off tables.

Funktionelle Analyse der Meprin-Metalloproteasen alpha und beta hinsichtlich ihrer physiologischen Regulation und biologischen Bedeutung

Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, ein besseres Verständnis der beiden Metalloproteasen Meprin α und β in ihrem proteolytischen Netzwerk hinsichtlich ihrer physiologischen Regulation durch endogene Inhibitoren, wie auch der biologischen Funktion von Meprin α für den Prozess der Angiogenese, zu erlangen. rnMit der Analyse des ersten identifizierten endogenen Meprin-Inhibitors Fetuin-A gelang die Bestimmung der Ki-Werte für Meprin α mit 4,2 x 10-5 M und 1,1 x 10-6 M für Meprin β. Des Weiteren konnte für Meprin β eine Schnittstelle im Fetuin-A validiert werden. Mit der Identifizierung von Cystatin C, einem Cystein-Protease-Inhibitor als endogener Inhibitor der Metalloprotease Meprin α, mit einem Ki-Wert von 8,5 x 10-6 M, wurden erstmals Proteasefamilie-übergreifende Inhibitionsmechanismen für Metalloproteasen offenbart.rnDie Analyse von drei potentiellen Meprin-Inhibitoren, identifiziert als Substrate in einem neuen Proteomics-Analyse-Verfahren terminal amine isotopic labeling of substrates (TAILS), ermöglichte die Charakterisierung von Elafin als spezifischen Meprin α-Inhibitor. Für Elafin ist es außerdem gelungen, die durch TAILS ermittelte Schnittstelle für Meprin α mittels Edman Sequenzierung zu validieren. Der secretory leukocyte peptidase inhibitor (SLPI), ein Elafin-Homolog, konnte als weiteres Meprin α-Substrat bestätigt werden. Außerdem gelang es, die Meprin α-Schnittstelle im SLPI zu validieren.rnEin weiteres Ziel dieser Arbeit war, ein besseres Verständnis der biologischen Funktion der Metalloprotease Meprin α zu erlangen. Hier konnte in vivo eine stark pro-angiogene Wirkung von Meprin α gezeigt werden und erstmals die Expression von Meprin α, jedoch nicht von Meprin β, in Endothelzellen nachgewiesen werden. Zugleich konnte mit der Analyse der durch die TAILS-Methode identifizierten pro-angiogenen Substrate vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) und connective tissue growth factor (CTGF) der Regulationsmechanismus von Meprin α in der Angiogenese identifiziert werden. So ist Meprin α durch die Spaltung von CTGF in der Lage VEGF-A – gebunden und inhibiert im Komplex mit CTGF – durch proteolytische Spaltung von CTGF wieder freizusetzen. Somit wird die inhibierte VEGF-A-Aktivität wieder vollständig hergestellt. rnMit der Charakterisierung der ersten endogenen Meprin-Inhibitoren ist es gelungen, zu einem besseren Verständnis der endogenen Regulation der Meprine beizutragen und eine Proteasefamilie-übergreifende endogene Regulation aufzuzeigen. Mit der Entdeckung von Meprin α als pro-angiogene Protease und der Entschlüsselung des angiogenen Regulationsmechanismus konnte eine essentielle biologische Bedeutung dieser Protease beschrieben werden.rn

TBX3-Mutationsanalysen und Konstruktion einer Zelllinie für TBX2-Inhibitorscreenings

Die nahe verwandten T-box Transkriptionsfaktoren TBX2 und TBX3 werden in zahlreichen humanen Krebsarten überexprimiert, insbesondere in Brustkrebs und Melanomen. Die Überexpression von TBX2 und TBX3 hat verschiedene zelluläre Effekte, darunter die Unterdrückung der Seneszenz, die Förderung der Epithelialen-Mesenchymalen Transition sowie invasive Zellmotilität. Im Gegensatz dazu führt ein Funktionsverlust von TBX3 und der meisten anderen humanen T-box-Gene zu haploinsuffizienten Entwicklungsdefekten. Durch Sequenzierung des Exoms von Brustkrebsproben identifizierten Stephens et al. fünf verschiedene Mutationen in TBX3, welche allesamt die DNA-bindende T-box-Domäne betrafen. Die In-Frame-Deletion N212delN wurde zweimal gefunden. Aus der Anhäufung der Mutationen innerhalb der T-box-Domäne wurde geschlossen, dass TBX3 bei Brustkrebs ein Treibergen ist. Da Mutationen innerhalb der T-box-Domäne im Allgemeinen zu einem Funktionsverlust führen, aber die onkogene Aktivität von TBX3 meist auf eine Überexpression zurückzuführen ist, wurden die potentiellen Treibermutationen hinsichtlich einer verminderten oder gesteigerten TBX3-Funktion geprüft. Getestet wurden zwei In-Frame Deletionen, eine Missense- sowie eine Frameshift-Mutante bezüglich der DNA-Bindung in vitro und der Zielgen-Repression in Zellkultur. Zusätzlich wurde eine in silico Analyse der im The Cancer Genome Atlas (TCGA) gelisteten somatischen TBX-Brustkrebsmutationen durchgeführt. Sowohl die experimentelle als auch die in silico Analyse zeigten, dass die untersuchten Mutationen vorwiegend zum Verlust der TBX3-Funktion führen. Um den Mechanismus der Genrepression durch TBX3 besser zu verstehen, wurden weitere TBX3-Mutanten bezüglich ihrer Wirkung auf die p21-Promotoraktivität (p21-Luc-Reporter und endogene p21-Expression) analysiert. Wildtypische p21-Luc-Repression zeigten die zwei Mutationen S674A (Phosphorylierung) und D275K (SUMOylierung), welche posttranslationale Modifikationen verhindern, sowie die Interaktion mit dem Tumorsuppressor Rb1 unterbindende M302A/V304A-Mutation. Erstaunlicherweise war die endogene p21-Repression dieser Mutanten stärker als die des wildtypischen TBX3-Proteins. Alle drei Mutationen führten zu einer Stabilisierung des TBX3-Proteins. Die ursprünglich in Patienten mit Ulna-Mamma Syndrom identifizierte, DNA-bindungsdefekte Y149S-Mutante konnte weder p21-Luc noch endogenes p21 reprimieren. Mutationen in potentiellen Interaktionsdomänen für die Bindung der Co-Repressoren Groucho und C-terminalem Bindeprotein zeigten sowohl auf p21-Luc als auch auf endogenes p21-Gen wildtypische Repressoraktivität, so dass diese Co-Repressoren in COS-7-Zellen wahrscheinlich nicht an der Repression dieses Gens beteiligt sind. Da TBX2 und TBX3 interessante Ziele zur direkten Krebsbekämpfung darstellen, sollte ein zelluläres Reportersystem zur Identifikation TBX2-inhibierender, pharmakologisch aktiver Substanzen etabliert werden. Dazu sollte eine stabile Zelllinie mit vom p21-Promotor reguliertem d2EGFP-Reporter und Doxyzyklin-induzierbarem TBX2-Protein erzeugt werden, da ektopische Expression von TBX2 genetische Instabilität und Toxizität induzieren kann. In dieser Zelllinie sollte die TBX2-Expression zur Reduktion der d2EGFP-Fluoreszenz führen. Zur Erzeugung der Zelllinie wurden die folgenden drei Konstrukte Schritt-für-Schritt stabil in das Genom der Zielzelllinie COS-7 integriert: pEF1alpha-Tet3G, pTRE3G-TBX2 und p21-d2EGFP. Während die Herstellung der doppelt stabilen COS-7-Zelllinie gelang, scheiterte die Herstellung der dreifach stabilen Zelllinie.