Comparative analysis of midline guidance and axon pathfinding in the chelicerates Achaearanea tepidariorum and Cupiennius salei

Die Neurogenese und axonale Wegfindung sind in den vergangenen Jahrzehnten Thema einer Vielzahl wissenschaftlicher Untersuchungen in den verschiedensten Organismen gewesen. Die zusammengetragenen Daten in Insekten und Crustaceen geben eine gute Übersicht darüber, wie das Nervensystem in Arthropoden aufgebaut wird. Die entwicklungsbiologischen Prozesse, die daran beteiligt sind, sind in den beiden genannten Gruppen sehr gut verstanden. In den Gruppen der Cheliceraten und Myriapoden jedoch wurden ähnliche Analysen bisher kaum durchgeführt. Das Hauptanliegen dieser Arbeit war es daher, Mechanismen in den Spinnen Achaearanea tepidariorum und Cupiennius salei, zwei Vertretern der Cheliceraten, zu untersuchen, die eine Rolle im Leitsystem der ventralen Mittellinie und bei der axonalen Wegfindung spielen. Eine Vorraussetzung hierfür sind Kenntnisse über die Architektur des Zentralnervensystems. In einem ersten Schritt beschrieb ich daher grundlegend die Morphologie des Nervensystems im Verlauf der gesamten Embryoalentwicklung. Ich konnte zeigen, dass in Spinnen ein für Arthropoden typisches Strickleiternervensystem gebildet wird. Dieses wird von segmental angelegten Neuronen geformt, wobei sowohl Gruppen von Zellen als auch einzelne Neurone daran beteiligt sind, die primären axonalen Trakte zu etablieren. Im Besonderen konnte ich eine Zelle identifizieren, die in Position, Projektionsmuster und der Expression des Markergens even-skipped vergleichbar zum PR2 Neuron in Drosophila ist, welches die posteriore Wurzel des Segmentalnervs anlegt.rnrnIn einem zweiten Ansatz untersuchte ich die ventrale Mittellinie in Spinnen im Bezug auf ihre mögliche Funktion in der axonalen Wegfindung. Es konnte gezeigt werden, dass es sich beim Epithel der Mittellinie, das die Lücke zwischen beiden Keimstreifhälften während des gesamten Prozesses der Inversion überspannt, um eine transiente Struktur handelt, die keine neuralen Zellen hervorbringt. Es ist daher vergleichbar mit der so genannten Floor plate in Vertebraten, die ebenfalls nur vorübergehend existiert. Die Untersuchung von single minded (sim) zeigte, dass es, anders als in Drosophila, wo sim ein wichtiges regulatorisches Gen für die korrekte Spezifizierung von Mittellinienzellen ist, nicht in den Zellen der Mittellinie, sondern in diesen benachbarten Zellen, exprimiert wird. Das ist vergleichbar mit Vertebraten. Zusätzlich konnte ich Expression von sim an den Basen der Gliedmassen und im Kopf nachweisen. Wie in Vertebraten könnte sim an der Musterbildung dieser Gewebe beteiligt sein. Dennoch spielt die Mittellinie in Spinnen eine wichtige Rolle als Organisator für auswachsende, kommissurale Axone. Diese Funktion teilt sie mit anderen Invertebraten und Vertebraten.rnrnDie Signaltransduktionskaskade, die an der axonalen Wegfindung an der Mittellinie beteiligt ist, ist in den verschiedensten Organismen hoch konserviert. In der vorliegenden Arbeit konnte ich sowohl in Achaearanea als auch in Cupiennius ein netrin Homolog identifizieren und eine konservierte Funktion des Wegfindungsmoleküls während der Bildung der Kommissuren aufzeigen. RNAi Experimente belegen, dass, wird die Funktion von netrin herunterreguliert, das Strickleiternervensystem nicht korrekt gebildet wird, ins Besondere die kommissuralen Faszikel. Des Weiteren konnte ich eine neue Funktion von netrin, die bisher in anderen Organsimen noch nicht beschrieben wurde, identifizieren. Neben seiner Rolle in der axonalen Wegfindung, scheint netrin auch an der epithelialen Morphogenese im zentralen Nervensystem beteiligt zu sein. In dieser Funktion scheint netrin in Gliazellen, die die epithelialen Vesikel der Invaginationsgruppen umhüllen, wichtig zu sein, um neurale Vorläuferzellen in einem undifferenzierten Zustand zu halten. Der Abbau von netrin Transkript durch RNA Interferenz führt zu einer verfrühten Segregation neuraler Vorläuferzellen aus dem epithelialen Verband der Invaginationsgruppen und zu einer Zunahme an Zellen, die den frühen Differenzierungsmarker islet exprimieren.

Endocytic trafficking and oligodendroglial exosome secretion in axon-glia communication and myelination

Oligodendrocytes form specialized plasma membrane extensions which spirally enwrap axons, thereby building up the myelin sheath. During myelination, oligodendrocytes produce large amounts of membrane components. Oligodendrocytes can be seen as a complex polarized cell type with two distinct membrane domains, the plasma membrane surrounding the cell body and the myelin membrane. SNARE proteins mediate the fusion of vesicular cargoes with their target membrane. We propose a model in which the major myelin protein PLP is transported by two different pathways. VAMP3 mediates the non-polarized transport of newly synthesized PLP via recycling endosomes to the plasma membrane, while transport of PLP from late endosomes/lysosomes to myelin is controlled by VAMP7. In the second part of the thesis, the role of exosome secretion in glia to axon signaling was studied. Further studies are required to clarify whether VAMP7 also controls exosome secretion. The thesis further focused on putative metabolic effects in the target neurons. Oligodendroglial exosomes showed no obvious influences on neuronal metabolic activity. Analysis of the phosphorylation levels of the neurofilament heavy subunit revealed a decrease in presence of oligodendrocytes, indicating effects of oligodendroglial exosomes on the neuronal cytoskeleton. Finally, candidates for kinases which are possibly activated upon influence of oligodendroglial exosomes and could influence neuronal survival were identified.

Oligodendroglial exosomes in glia to neuron signaling

In the CNS, myelinating oligodendrocytes and axons form a functional unit based on intimate cell-cell interactions. In addition to axonal insulation serving to increase the conduction velocity of electrical impulses, oligodendrocytes provide trophic support to neurons essential for the long-term functional integrity of axons. The glial signals maintaining axonal functions are just at the beginning to become uncovered. Yet, their determination is highly relevant for all types of demyelinating diseases, where lack of glial support significantly contributes to pathology. rnThe present PhD thesis uncovers exosomes as a novel signaling entity in the CNS by which cargo can be transferred from oligodendrocytes to neurons. Exosomes are small membranous vesicles of endocytic origin, which are released by almost every cell type and have been implicated in intercellular communication. Oligodendrocytes secrete exosomes containing a distinct set of proteins as well as mRNA and microRNA. Intriguingly, oligodendroglial exosome release is stimulated by the neurotransmitter glutamate indicating that neuronal electrical activity controls glial exosome release. In this study, the role of exosomes in neuron-glia communication and their implications on glial support was examined. Cortical neurons internalized and accumulated oligodendroglial exosomes in the neuronal cell soma in a time-dependent manner. Moreover, uptake occurred likewise at the somatodendritic and axonal compartment of the neurons via dynamin and clathrin dependent endocytosis. Intriguingly, neuronal internalization of exosomes resulted in functional retrieval of exosomal cargo in vitro and in vivo upon stereotactic injection of Cre recombinase bearing exosomes. Functional recovery of Cre recombinase from transferred exosomes was indicated by acquired reporter recombination in the target cell. Electrophysiological analysis showed an increased firing rate in neurons exposed to oligodendroglial exosomes. Moreover, microarray analysis revealed differentially expressed genes after exosome treatment, indicating functional implications on neuronal gene expression and activity. rnTaken together, the results of this PhD thesis represent a proof of principle for exosome transmission from oligodendrocytes to neurons suggesting a new route of horizontal transfer in the CNS.rn

Experimentelle Untersuchungen zur embryonalen Entwicklung identifizierter Vorläuferzellen des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster

Zusammenfassung Das ventrale Nervensystem (vNS) von Drosophila melanogaster entsteht aus zwei verschiedenen Populationen von Vorläufern, den mesektodermalen oder Mittellinien (ML)-Vorläufern und den neuroektodermalen Vorläufern oder Neuroblasten (NBs). Beide Populationen unterscheiden sich in vielen Aspekten, wie z.B. Genexpression, Teilungsverhalten und Zellstammbaum. Die ca. 30 NBs pro Hemisegment delaminieren als Einzelzellen aus dem Neuroektoderm und bilden ein invariantes subepidermales Muster in der neu entstandenen neuralen Zellschicht aus. Sie sind dort aufgrund ihrer Lage und der Expression spezifischer molekularer Marker individuell identifizierbar. Um die Mechanismen zu verstehen, die zur Determination und Differenzierung von ZNS Zellen führen, ist es eine Grundvoraussetzung, die Zellstammbäume aller Vorläufer zu kennen. Unter Verwendung des lipophilen in vivo Fluoreszenzfarbstoffs DiI wurden in früheren Arbeiten die Zellstammbäume der ML-Vorläufer und von 17 NBs, die aus der ventralen Hälfte des Neuroektoderms stammten, beschrieben. In der hier vorgelegten Arbeit wurden die Zellstammbäume von 13 NBs, die aus dem dorsalen Teil des Neuroektoderms delaminierten, beschrieben und 12 davon identifizierten Vorläufern zugeordnet. Darüber hinaus wurde ein bisher nicht beschriebener NB (NB 1-3) identifiziert und anhand morphologischer und molekularer Kriterien charakterisiert. Insgesamt produzierten die NBs ca. 120 Neurone und 22 bis 27 Gliazellen pro Hemineuromer, die in eine systematische Terminologie eingefügt wurden. Insgesamt besteht damit ein Neuromer des embryonalen vNS von Drosophila aus ca. 700 Neuronen (350 pro Hemineuromer) und 60 Gliazellen (30 pro Hemineuromer), die von NBs abstammen. Hinzu kommen ca. 12 ML-Neurone und 2 bis 4 ML-Glia pro Neuromer. Damit stammten die meisten Gliazellen im embryonalen vNS von Drosophila von NBs ab, die aus dem dorsalen Neuroektoderm hervorgingen. Zwei dieser NBs hatten ausschließlich gliale Nachkommen (NB 6-4A, GP) und fünf generierten sowohl Glia als auch Neurone (NBs 1-3, 2-5, 5-6, 6-4T, 7-4). Die übrigen sieben Zellstammbäume (NBs 2-4, 3-3, 3-5, 4-3, 4-4, 5-4, Klon y) waren rein neuronal. Es war ferner möglich, das bereits bekannte laterale Cluster von even-skipped exprimierenden Zellen (EL) dem Stammbaum von NB 3-3 zuzuordnen. Zusammen mit den zuvor beschriebenen Klonen sind damit mehr als 90% der thorakalen und abdominalen Zellstammbäume im embryonalen vNS von Drosophila bekannt. Darüber hinaus sind zuvor identifizierte Neurone und die meisten Gliazellen einem bestimmten Stammbaum zugeordnet und damit mit einer ontogenetischen Geschichte versehen. Dieser komplette Datensatz liefert eine Grundlage für die Interpretation mutanter Phänotypen und für zukünftige Untersuchungen über die Festlegung von Zellschicksalen und die Differenzierung von Zellen. Dies könnte dazu beitragen, das Verhältnis zwischen Herkunft der Zelle, Genexpression und Zellfunktion besser zu verstehen. Die wesentliche Funktion neuronaler Zellen ist die Integration und Weiterleitung von elektrischen Signalen. Mithin ist die Ausbildung elektrischer Eigenschaften (Elektrogenese) ein wesentlicher Aspekt der neuronalen Entwicklung. Um dabei zelltypspezifische Unterschiede zu finden, ist die Arbeit an definierten Zellpopulationen eine zwingende Voraussetzung. Es wurde daher hier ein in vitro System verwendet, das die selektive Kultivierung identifizierter embryonaler Vorläufer unter verschiedenen Bedingungen erlaubt. Da die Zellstammbäume der ML-Vorläufer besonders einfach sind und die ML-Zellen zudem in vielen Aspekten von den neuroektodermalen Zellen verschieden sind (s.o.), wurden die ML-Neurone als erstes Modellsystem ausgewählt. Unter Verwendung der Patch-clamp Technik wurden die in dieser definierten Zellpopulation auftretenden Ionenströme detailliert beschrieben. ML-Neurone exprimierten zumindest zwei verschiedene Typen von spannungsgesteuerten K+-Strömen (IA und IK), einen spannungsabhängigen Na+-Strom und zwei spannungsgesteuerte Ca(Ba)2+-Ströme. Darüber hinaus reagierten sie auf die Neurotransmitter ACh und GABA. Die meisten Ionenströme in den ML-Neuronen waren, trotz ihrer ontogenetischen Besonderheit, annähernd identisch mit denen, die in anderen Drosophila-Neuronen gefunden wurden. Ihnen fehlte allerdings eine anhaltende Komponente des Na+-Stroms, und sie waren homogen in ihrer Aktivität. Selbst bei anhaltender elektrischer Stimulation generierten sie immer nur ein Aktionspotential. Sie sind daher möglicherweise spezifisch hinsichtlich ihrer Signalleitungseigenschaften. Interessanterweise zeigte sich durch Verwendung verschiedener Kulturbedingungen, daß die Expression der spannungsgesteuerten K+-Kanäle weitgehend zellautonom erfolgte, während die Expression der anderen Ströme stark durch das Vohandensein von Neuritenkontakten beeinflußt wurde. Vorläufige Untersuchungen lassen darauf schließen, daß der involvierte molekulare Mechanismus unabhängig von synaptischer Transmission ist. In einer Art 'Ausblick' wurde schließlich die Validität von in vitro Ableitungen durch Analyse spannungsgesteuerter K+-Ströme in einer neuen in situ Präparation geprüft, die verschiedene Bereiche des Drosophila-ZNS für elektrophysiologische Untersuchungen zugänglich macht. Damit ist ein experimentelles System etabliert, daß den direkten Vergleich von in vitro und in situ Daten an definierten Zellpopulationen ermöglichen sollte.

Transgene Mausmodelle zur Untersuchung von Nervenzellwanderungen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden transgene Mausmodelle hergestellt, die eine weitere Aufklärung der Rolle des Transkriptionsfaktors Pax6 bei der Wanderung von Nervenzellen ermöglichen, sowie ein Kultursystem zur Darstellung embryonaler Wanderungen außerhalb des Mutterleibs entwickelt.Bei der YAC-transgenen Mäuselinie PhPax6-taulacZ wird das Reportergen taulacZ unter der Kontrolle des Pax6-Promotors exprimiert. Dadurch ist dort, wo Pax6 im Zellkern vorliegt, der Rest der Zelle über seine gesamte Ausdehnung mit der vom taulacZ-Transgen kodierten tau-b-Galactosidase markiert. Das räumlich-zeitliche Expressionsmuster von Pax6 und dem Transgen taulacZ wurde detailliert untersucht. Dabei wurde eine hohe Übereinstimmung festgestellt. Basierend auf der Darstellung der Zellen in ihrer gesamten Ausdehnung, die durch das taulacZ-Transgen erstmals möglich ist, wurde eine Klassifizierung Pax6-positiver Zelltypen vorgenommen. Zunächst wird Pax6 in Neuroepithelzellen, später in radialen Gliazellen exprimiert.Mit der zweiten transgenen Mäuselinie, PhPax6-tTA, wurde ein Werkzeug hergestellt, das die gezielte und hoch spezifische Expression von beliebigen Transgenen in Pax6-exprimierenden Zellen ermöglicht. In Pax6-positive Zellen der Medulla wurde das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) eingeführt und das Wanderungsverhalten in vitro über mehrere Tage dargestellt. Erstmals können mit dieser Linie beliebige Expressionskonstrukte gezielt, hocheffizient und schnell in wandernde Neurone eingebracht werden, ohne störende Hinter-grundexpression in anderen Zellen.

Die Funktion von Dystroglycan in der Entwicklung des zentralen Nervensystems

Die Funktion von Dystroglycan in der Entwicklung des zentralen Nervensystems Der DAG ist ein oligomerer Proteinkomplex, der in den Muskelfasern die extrazelluläre Matrix mit dem Zytoskelett verbindet und dadurch der Muskulatur die mechanische Stabilität bei der Kontraktion verleiht. Mutationen des DAG sind die genetische Grundlage für verschiedene Formen von muskulären Dystrophien. Muskuläre Dystrophien sind Krankheiten, die neben einer Degeneration der Muskulatur auch verschiedene ZNS-Defekte aufweisen. Die Funktion des DAG im ZNS ist bisher unbekannt. Um seine Funktion im ZNS zu analysieren, wurde Huhn-Dystroglycan, eine zentrale Komponente des DAG, kloniert. Dystroglycan besteht aus dem extrazellulären Matrixprotein alpha-Dystroglycan und dem transmembranen beta-Dystroglycan. Beide Proteine werden vom selben Gen codiert und posttranslational gespalten. Die Huhn-Dystroglycan-Sequenz ist sehr homolog zu anderen Spezies. Antikörper hergestellt gegen die Interaktionsdomänen von alpha- und beta-Dystroglycan, wurden verwendet um die Interaktion von Dystroglycan selektiv an der Grenzfläche zwischen Gliazellendfüßen und Basallamina in der Retina zu stören. Die Antikörper wurden in vivo intravitreal in Augen von Hühnerembryoanen der Stadien E6 bis E10 injiziert. Die Injektion der Antikörper und entsprechender Fab-Fragmente führten zu schweren Veränderungen in der Retina, unter anderem Hyperproliferation, Auflösung der radialen Struktur der neuroepithelialen Zellen und einer veränderten Schichtung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß der DAG am Kontakt der radiären Glizellen zur Basalmembran beteiligt sind.

Markierung der Zellinien im Embryo von Platynereis

Die Zellgenealogie des Polychaeten Platynereis dumerilii wurde durch Farbstoffinjektion in die Blastomeren des 2-, 4- und 8-Zellstadiums, sowie die Zellen 2d, 2d112, 4d und 4d1 untersucht. Injektionen gelangen durch Aufweichung der Vitellinhülle mittels Dithioerythritol und Trypsin. Die injizierten Keime wurden zur Trochophora bzw zum dreisegmentigen Jungwurm aufgezogen, fixiert und mit dem konfokalen Rasterlichtmikroskop dreidimensional aufgenommen. Die animal-vegetale Achse des Frühkeims entspricht der antero-posterioren Achse des Jungwurms. Die Mikromeren des ersten Quartetts sind radiär um die antero-posteriore Achse angeordnet und bilden den Kopf. Die Mikromere 2d proliferiert bilateralsymmetrisch von der dorsalen Mittellinie aus und liefert das gesamte Rumpfektoderm. Indirekt ließ sich ableiten, daß die Mikromeren 2a1 bis 2c1 schmale ektodermale Streifen zwischen Kopf und Rumpf bilden und aus 2a2 und 2c2 das ektodermale Stomodaeum hervorgeht. Die Mikromeren des dritten Quartetts sowie möglicherweise 2b2 bilden 'Ektomesoderm'. 4d proliferiert ebenfalls bilateralsymmetrisch von der dorsalen Mittellinie aus zum Rumpfmesoderm und liefert vielleicht noch kleine Beiträge zum Aufbau des Darmes. Der Mitteldarm stammt von den dotterreichen Makromeren 4A bis 4D.

Funktionelle Analyse von Dystroglycan in der sich entwickelnden Hühnerretina durch in-ovo-Elektroporation

Alpha- und Beta-Dystroglycan, die zentralen Komponenten eines multimeren Dystrophin-assoziierten Proteinkomplexes wurden bislang im Wesentlichen in der Skelettmuskulatur charakterisiert. Dort stellt der DAG eine molekulare Verbindung zwischen dem Aktin-Zytoskelett der Muskelfaser und einer Basalmembran her, die die einzelne Muskelfaser umhüllt. Dystroglycan vermittelt auf diese Weise die mechanische Festigkeit der Muskelfasern während der Kontraktion. Außerdem dient der DAG als Gerüst für die Anlagerung von Proteinen. Mutationen in den strukturgebenden oder signaltransduzierenden Proteinen des DAG verursachen Muskeldystrophie. Besonders schwere Muskeldystrophien werden durch Mutationen hervorgerufen, die eine veränderte Glykosylierung von Dystroglycan und damit eine verminderte Bindung von alpha-Dystroglycan an Matrixproteine verursachen. Dies führt zu einer Beeinträchtigung der Basalmembranbiosynthese sowie sich daraus ergebende Störungen in der Migration, Schichtung und Differenzierung von Nervenzellen im ZNS. Welche Rolle Dystroglycan im sich entwickelnden ZNS spielt, sollte in dieser Arbeit an der Hühnerretina untersucht werden. Durch Anwendung der in ovo Elektroporation wurden zwei modifizierte Dystroglycankonstrukte in Neuroepithelzellen transfiziert. Die Überexpression eines verkürtzten Dystroglycanproteins, verursachte eine Abrundung der Neuroepithelzellen. Dies führte zur Hyperproliferation der Zellen deren Folge die Bildung von Verdickungen in der Retina war sowie eine verstärkte Bildung postmitotischer Neurone. Die Elektroporation eines nicht-spaltbaren Dystroglycans, führte im Gegensatz dazu zu einer Abnahme der Anzahl proliferierender und differenzierender Nervenzellen. Als Konsequenz veränderte sich die Orientierung der Axone von retinalen Ganglienzellen. Nach der Überexpression des verkürzten Dystroglycans verloren die Axone ihre zentripetale Orientierung auf den optischen Nerv, während die Elektroporation von Wt-Dystroglycan und nicht-spaltbarem Dystroglycan nur einen gelegentlichen Richtungswechsel der Axone verursachte. Die Daten zeigen, dass Dystroglycan einen entscheidenden Einfluss auf die Proliferation, Differenzierung und Polarität der Neuroepithelzellen ausübt. Dies geschieht vermutlich durch die Vermittlung der Adhäsion des Endfußes von Neuroepithelzellen an die Basalmembran. Die Veränderungen nach der Überexpression der modifizierten Dystroglycankonstrukte liefern möglicherweise eine Erklärung für den ZNS-Phänotyp der sich bei verschiedenen Formen von Muskeldystrophie zeigt.

The role of the NG2 proteoglycan in migration and characterization of the interaction with the intracellular binding partner, Syntenin

NG2 is a transmembrane proteoglycan with two N-terminal LNS domains and a C-terminal PDZ-binding motif. It is expressed in the developing and adult CNS by oligodendroglial precursor cells and subpopulations of perisynaptic glia and elsewhere by many immature cell types. In order to elucidate the functions of the protein and the heterogenous cell population which expresses it, we undertook to identify and characterise interaction partners of the molecule. The presence of the C-terminal PDZ recognition site in NG2 suggested PDZ-domain proteins as intracellular binding partners. In this work, interaction between the PDZ protein Syntenin and NG2 has been characterised. Syntenin is known to be involved in plasma membrane dynamics, metastasis and adhesion. Syntenin may thus link NG2 to the cytoskeleton, mediating migration of developing oligodendrocytes to axonal tracts prior to myelination, as well as process movement of NG2+ perisynaptic glia. NG2 is involved in cell spreading and polyclonal antibodies against NG2 inhibit the migration of immature glia and cell lines expressing the molecule. In this work we have characterised the segments of the extracellular portion of NG2 that are involved in migration. We found that the extracellular region immediately preceding the transmembrane segment is most important for cell motility. As part of this thesis, biochemical approaches to identify a trans-binding ligand interacting with the extracellular part of NG2 was also explored.

Untersuchungen zur Funktion und Regulation der Rezeptor-Tyrosin-Phosphatase RPTPlambda bei der Entwicklung des Mittel- und Hinterhirns

Der isthmische Organisator liegt an der Grenze zwischen dem sich entwickelnden Mittel- und Hinterhirn und kontrolliert Wachstum und Musterbildung dieser beiden Hirnregionen. In der vorliegenden Arbeit wird die räumliche und zeitliche Expression der Rezeptor-ähnlichen Protein Tyrosin Phosphatase lambda aus dem Huhn (cRPTPλ, auch als cRPTPψ bekannt) während der Entwicklung dieser Struktur beschrieben. Nach einer anfänglich weitläufigen Expression im kaudalen Vorderhirn und in der Mittelhirnregion, beschränkt sich die Expression von cRPTPλ zwischen dem embryonalen Tag E2 und E3.5 auf die ventrale Mittellinie des Neuralrohrs, den Bereich der späteren neuralen Retina und Linse und auf einen schmalen Ring anterior der isthmischen Einschnürung, welcher der molekularen Mittel- / Hinterhirngrenze (MHO) entspricht. Ab dem embryonalen Tag E3.5 wird RPTPλ dann auch im gesamten Mittelhirn gebildet. Um Hinweise auf die Funktion von cRPTPλ zu bekommen, wurde die Regulation dieses Moleküls untersucht. Die Expression von cRPTPλ am MHO wird von dem Fibroblasten Wachstumsfaktor Fgf8 und dem Transkriptionsfaktor Lmx1b, nicht aber von dem sezernierten Glykoprotein Wnt1 induziert. Der Transkriptionsfaktor En-1 unterdrückt die Expression von cRPTPλ am MHO. cRPTPλ-Expression im Mittelhirn wird negativ durch das sezernierte Protein Sonic Hedgehog reguliert, während Lmx1b und En-1 dort keinen Einfluss auf das Expressionsmuster von cRPTPλ haben. Fgf8 und Wnt1 sind maßgeblich an der Regulation von Wachstum und Musterbildung des embryonalen Mittelhirns beteiligt. Funktionelle Studien zu RPTPλ deuten darauf hin, dass dieses Protein als negativer Rückkopplungsmechanismus beider Signalwege wirken kann. RNAi- und Überexpressionsstudien am MHO lieferten Hinweise darauf, dass RPTPλ der Induktion der Wnt1-Expression durch Fgf8 entgegenwirkt. Dies scheint durch Interaktion noch unbekannter Faktoren mit der Juxtamembrandomäne von RPTPλ vermittelt zu werden. Auf das Expressionsmuster von Fgf8 selbst, oder einer Reihe anderer Faktoren, die ebenfalls von Fgf8 reguliert werden, hat RPTPλ allerdings keinen Einfluss. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine „künstliche“ Aufrechterhaltung der Expression von cRPTPλ im Mittelhirn zwischen dem embryonalen Tag E2 und E3.5 zu einem stark verkleinerten Mesenzephalon führt. RPTPλ bindet in vivo an β-Catenin, ein zentrales Protein des kanonischen Wnt-Signalweges, und moduliert dadurch vermutlich das Wnt-Signal, welches seinerseits Proliferation im Mesenzephalon fördert. Durch diesen Mechanismus könnte cRPTPλ als „Bremse“ des kanonischen Wnt-Signalweges im Mittelhirn wirken.

Generation of a NG2-EYFP mouse for studying the properties of NG2-expressing cells

A range of vectors were made in which the EYFP gene or the Cre gene were inserted in the start codon of the NG2 gene. The NG2-EYFP vectors were used to generate NG2-EYFP “knockin” mice by homologous recombination. The F1 generation showed lack of EYFP expression, due to NeoR cassette interference. Excision of the NeoR, by breeding the F1 generation to ELLA-Cre mice allowed proper expression of EYFP. NG2-EYFP heterozygous mice were characterized in detail for astrocytic, neurogenic and oligodendrocytic properties through antibody labeling. NG2-EYFP+ cells did not label for the astrocyte marker GFAP, but some cells did express S100 Beta. The cells did not label with any neuronal markers like Beta III tubulin, Neun, and double cortin, but many of the NG2-EYFP+ cells made intimate contacts to the neurons. These contacts are widespread throughout the grey and white matter of the brain. The NG2-EYFP+ cells did label for oligodendrocyte markers like PDGFα-R, NG2, Olig2, O4, and Sox 10. There were a few cells termed phantom cells that did label for NG2, but had no EYFP expression. This could have been caused by improper excision of the NeoR cassette in the F2 generation. The heterozygous mouse is a tool to allow the characterization of the in vivo properties of the NG2+ cells. Breeding of these mice to homozygosity yielded an NG2-knockout mouse, which was also subjected to initial characterization. The NG2-EYFP homozygous showed equivalent cell labeling results to the NG2-EYFP heterozygous mouse, but the phantom cells disappeared in the knockout. The results show that the NG2 cells are a heterogenous population that does not express astrocytic or neuronal markers. The homozygous mouse is an ideal tool to further dissect the properties of the cells, lacking NG2 in vivo.

Zellulärer Transport von Myelinproteinen

Während der Myelinbildung im zentralen Nervensystem (ZNS) umwinden Oligodendrozyten mit Ausläufern ihrer Plasmamembran mehrfach das Axon. Myelin ermöglicht die saltatorische Erregungsweiterleitung entlang der Axone und ist zudem für die Aufrechterhaltung der axonalen Integrität erforderlich (Edgar and Garbern, 2004). Ein Oligodendrozyt myelinisiert bis zu 40 Axonsegmente gleichzeitig, wodurch er in seiner aktivsten Myelinisierungsphase 5 bis 50 x 103 µm2 Membranfläche pro Tag produziert (Pfeiffer et al., 1993). Die vollständig ausgebildete Myelinscheide besteht aus Subdomänen mit charakteristischen Protein- und Lipidzusammensetzungen. Die Entwicklung und der Erhalt der komplexen Myelinmembran erfordert die kontinuierliche Kommunikation zwischen Neuronen und Glia-Zellen, die Koordination der Protein- und Lipidsynthese sowie angepasste intrazelluläre Sortier- und Transportwege der Myelinkomponenten. Über die molekularen Mechanismen, die zur Ausbildung des Myelins und seiner Domänen führen, ist bisher nicht sehr viel bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Endo- und Exozytosemechanismen von Myelinproteinen analysiert. Dabei wurden drei Proteine untersucht, die in unterschiedlichen Subdomänen der Myelinmembran des ZNS lokalisiert sind. Das Hauptmyelinprotein Proteolipid Protein (PLP), das Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG) und das Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG). Die Exozytose des Hauptmyelinproteins PLP erfolgt möglicherweise durch sekretorische Lysosomen (Trajkovic et al., 2006) und ist Ca2+-abhängig. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass PLP, MAG und MOG unterschiedlichen endosomalen Transportwegen und Sortierprozessen unterliegen. PLP wird über einen Clathrin-unabhängigen, MAG und MOG hingegen über einen Clathrin-abhängigen Mechanismus endozytiert. Zudem gelangen die Proteine zu unterschiedlichen endosomalen Zielkompartimenten und recyceln zu verschiedenen oligodendroglialen Membrandomänen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die endosomale Sortierung und das Recycling der Myelinproteine, die für die Bildung der Subdomänen erforderliche Umgestaltung der oligodendroglialen Plasmamembran unterstützen.

Expression und Funktion der Lyn Kinase in Oligodendrozyten

Die Bildung, Aufrechterhaltung und die Funktionalität von Oligodendrozyten, den myelinisierenden Zellen des ZNS, bedarf einer präzisen Regulation von Ereignissen wie Migration, Proliferation und Differenzierung. Die Src-Kinasen spielen in vielen Signalkaskaden eine zentrale Rolle. In murinen Oligodendrozyten werden die beiden Src-Kinasen Fyn und Lyn exprimiert, diese Arbeit konzentriert sich auf die Analyse der Lyn Kinase. Es konnte die Expression von Lyn in Oligodendrozyten und Myelin in vitro und in vivo bestätigen werden, sowie die Lokalisation innerhalb und außerhalb von rafts. Je älter die Mäuse, desto weniger Lyn wird in Myelin exprimiert und desto stärker ist das verbleibende Lyn in den rafts lokalisiert. Die Aktivität von Lyn ist im Myelin 12-Tage alter Mäuse am höchsten. Synchronisation des Zellzyklus in Oli-neu Zellen zeigte eine zyklische Expression von Lyn. Transfektion aktiver und inaktiver Konstrukte machte deutlich, dass eine Lyn Aktivität die Zellausläufer Bildung, sowie die Differenzierung der Zelle, hemmt. Es konnte eine Assoziation der GluRB/C Untereinheit des AMPA Rezeptors mit Lyn nachgewiesen werden. Stimulierung des AMPA-Rezeptors mit Glutamat führte zu einer Aktivierung der Lyn Kinase und daraus resultierend, zu einer Inhibierung der Zelldifferenzierung. Welche biologische Relevanz diese Ergebnisse haben könnten, wurde in drei Hypothesen festgehalten. Zum einen könnte die Lyn Kinase den zeitlichen Übergang von Proliferation und Differenzierung in Oligodendrozyten regulieren und zwar sowohl in perinatalen oligodendroglialen Vorläuferzellen, als auch, unter besonderen Umständen, in adulten oligodendroglialen Vorläuferzellen. Des Weiteren könnte die Lyn Kinase auch eine Rolle in der Neuron-Glia-Synapsenbildung spielen. Weitere Versuche, insbesondere in vivo, müssen folgen, um diese Hypothesen zu bestätigen oder zu widerlegen.

Neuroglobin, Cytoglobin und Myoglobin in der Blindmaus Spalax ehrenbergi: Adaptation an „unterirdische Verhältnisse“

Hypoxie ist ein Zustand des Sauerstoffmangels, hervorgerufen durch fehlende Verfügbarkeit von Sauerstoff in der Umgebung eines Organismus oder durch pathologisch bedingte unzureichende Nutzbarkeit des Sauerstoffs von Geweben. Die Sensitivität gegenüber Hypoxie variiert enorm im Tierreich zwischen verschiedenen Phyla und Spezies. Die meisten Säugetiere sind nur unzureichend an niedrige Sauerstoffkonzentrationen angepasst, wohingegen einige unterirdisch lebende Säuger sehr resistent gegen Hypoxiestress sind. Um die molekulare Basis der Hypoxietoleranz zu bestimmen, wurden in der vorliegenden Arbeit Globine untersucht, die potenziell in der Lage sind, als respiratorische Proteine zur Hypoxietoleranz von Tieren beizutragen. Dazu wurde die Expression der Globine in der hypoxieresistenten, in Israel lebenden Blindmaus Spalax ehrenbergi mit der Genexpression in der hypoxiesensitiven Ratte (Rattus norvegicus) verglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden die erst vor wenigen Jahren entdeckten Globine Neuroglobin und Cytoglobin untersucht, deren exakte physiologische Rolle noch unklar ist, und mit Daten des viel detaillierter untersuchten Myoglobins verglichen. Beim Vergleich der Expression von Cytoglobin und Neuroglobin in Spalax versus Ratte fällt auf, dass Neuroglobin und Cytoglobin bereits unter normoxischen Bedingungen auf mRNA- und Proteinebene in der Blindmaus um einen Faktor von mindesten 2 bis 3 verstärkt exprimiert werden. Bei Myoglobin (als dem Kontrollgen mit bekannter Funktion) konnte auf mRNA-Ebene eine noch weitaus stärkere Expression in Spalax vs. Ratte gefunden werden. Das übergreifende Phänomen der verstärkten Genexpression von Globinen in Spalax kann im Sinne einer Präadaptation an das unterirdische, häufig hypoxische Leben der Blindmaus interpretiert werden. Einen weiteren Hinweis auf eine besondere, spezialisierte Funktion von Neuroglobin in Spalax geben immunhistochemische Daten, die zeigen, dass Neuroglobin im Gehirn von Spalax im Gegensatz zur Ratte nicht nur in Neuronen, sondern auch in Gliazellen exprimiert wird. Dies impliziert Änderungen des oxidativen Stoffwechsels im Nervensystem der hypoxietoleranten Spezies. Die zellulären Expressionsmuster von Cytoglobin erscheinen hingegen in beiden Säugerspezies weitgehend identisch. Es wurde der Frage nachgegangen, ob und wie experimentell induzierte Hypoxie die Genexpression der Globine verändert. Dabei zeigten sich für Neuroglobin und Cytoglobin unterschiedliche Expressionsmuster. Neuroglobin wird unter diversen Sauerstoffmangelbedingungen sowohl in der Ratte als auch in Spalax auf mRNA- und Proteinebene herunterreguliert. Ein ähnliches Regulationsverhalten wurde auch für Myoglobin beobachtet. Die verminderte Expression von Neuroglobin (und evtl. auch Myoglobin) unter Hypoxie ist mit einer gezielten Verringerung der Sauerstoff-Speicherkapazität in Abwesenheit von O2 zu erklären. Ein weiterer denkbarer Grund könnte auch die allgemeine Tendenz sein, unter Hypoxie aus Energiespargründen den Metabolismus herunter zu regulieren. Cytoglobin, das bei normalen Sauerstoffbedingungen nur im Gehirn von Spalax (nicht jedoch in Herz und Leber) ebenfalls um Faktor 2 bis 3 stärker exprimiert wird als in der Ratte, ist mit einiger Sicherheit ebenfalls von adaptivem Nutzen für die Anpassung von Spalax an niedrige Sauerstoffbedingungen, wenngleich seine Funktion unklar bleibt. Unter Hypoxie wird die Cytoglobin-mRNA sowohl in Spalax als auch in der Ratte hochreguliert. Es konnte in der vorliegenden Arbeit dargelegt werden, dass die Expression von Cygb höchstwahrscheinlich durch den Transkriptionsfaktor Hif-1 gesteuert wird, der die molekulare Hypoxieantwort vieler Tierarten zentral steuert. In der vorliegenden Arbeit wurde ebenfalls die Expression von Ngb und Cygb im Gehirn des Hausschweins (Sus scrofa) untersucht. Diese Spezies diente in der Arbeit als weiterer hypoxiesensitiver Organismus sowie als biomedizinisch relevantes Modell für eine Operation an Säuglingen mit angeborenen Herzkrankheiten. Die Versuche haben gezeigt, dass die Gabe bestimmter Medikamente wie dem Immunsuppressivum FK506 zu einer erhöhten Ngb-Konzentration auf mRNA-Ebene führen kann, was potenziell im Zusammenhang mit beobachteten protektiven Effekten der Medikamentengabe während und nach der Herzoperation steht.

Analyse der Funktion von Dystroglycan im frühen sich entwickelnden ZNS mittels inhibierender Antikörper

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion von Dystroglycan in jungen und späten Stadien des sich entwickelnden ZNS untersucht. Hierzu wurden Antikörper generiert, die fähig waren, in vivo die Interaktion zwischen a-und b-Dystroglycan zu stören. Die Antikörper oder Fab-Fragmente wurden in das Mesencephalon oder Auge lebender Hühnerembryonen injiziert, um aus den beobachteten Veränderungen die Funktion des DAG zu untersuchen. Die Fab-Fragmentinjektionen führten zu Hyperproliferation, verbunden mit morphologischen Veränderungen der Neuroepithelzellen und Zunahme der Anzahl postmitotischer Neuronen. Ebenso wurde die basale und apikale Polarität von Neuroepithelzellen beeinflusst. Auch die Axonorientierung der tectobulbären Axone wurde durch die Injektionen gestört. In älteren embryonalen Stadien kam es, durch Fab-Fragmentinjektionen in die Augen von Embryonen, zu strukturellen Veränderungen der Retina, verbunden mit einer breiteren Verteilung des DAG, wie auch der Synapsen innerhalb der OPL. Die retinalen Zelltypen, wie Müller-Gliazellen und Stäbchen-Bipolarzellen, waren abgerundet und hatten ihre typische Zellform verloren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Dystroglycan einen entscheidenden Einfluss auf die Proliferation, Migration, Polarität und Differenzierung der Neuroepithelzellen ausübt. Außerdem zeigen diese Daten, dass Dystroglycan nicht nur in der frühen embryonalen ZNS-Entwicklung eine maßgebliche Rolle spielt, sondern auch in späten Stadien. Die Ähnlichkeit der beobachteten Veränderungen nach Fab-Fragmentinjektionen legt nahe, dass einige Veränderungen im ZNS bestimmter Muskeldystrophieformen, durch Beeinflussung der Neuroepithelzellen im sich entwickelnden ZNS, verursacht werden.