Regulation der Phorbolester-induzierten Matrix-Metalloproteinase-9-Expression in humanen Brustkrebszelllinien durch Stickstoffmonoxid

Das Hauptziel dieser Arbeit war die Identifizierung der Regulationsebenen auf denen die TPA-induzierte Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9) durch das nitrose Gas Stickstoffmonoxid (NO) in MCF-7-Zellen ver��ndert wird. Dabei konnte sowohl mit Hilfe der Zymographie als auch mit einem MMP-9-Aktivit��ts-ELISA gezeigt werden, dass die extrazellul��ren MMP-9-Spiegel durch die Behandlung der Zellen mit NO reduziert werden. Gleichzeitig zeigte sich auch eine durch NO bedingte Abnahme der intrazellul��ren MMP-9-Spiegel, wie mit Hilfe von Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden konnte. Experimente mit dem Proteasominhibitor Lactacystin und dem Proteinsynthesehemmstoff Cycloheximid lie��en dar��ber hinaus eine NO-bedingte Ver��nderung der MMP-9-Proteinstabilit��t ausschlie��en. Im Gegensatz dazu konnte mittels der metabolischen Markierung mit radioaktiv markiertem Methionin und Cystein gezeigt werden, dass die Proteinneusynthese der MMP-9 durch eine Behandlung der Zellen mit NO stark beeintr��chtigt wird. In ��bereinstimmung mit diesen Daten finden sich reduzierte MMP-9-mRNA-Spiegel auch in der polysomalen Zellfraktion von MCF-7-Zellen. Wie mit Hilfe des Transkriptionshemmstoffes Actinomycin D und durch Reportergenstudien mit hybriden MMP-9-Promotorkonstrukten gezeigt werden konnte, ist die NO-induzierte Reduktion der MMP-9-mRNA-Spiegel nicht auf eine Verringerung der MMP-9-mRNA-Stabilit��t zur��ckzuf��hren. Reportergenstudien mit einem 670bp langen Promotorfragment des 5���flankierenden Bereichs des humanen MMP-9-Gens zeigten jedoch auf, dass der hemmende Effekt des NOs zum Teil auf eine NO-vermittelte Abnahme der TPA-induzierten MMP-9-Promotoraktivit��t zur��ckgef��hrt werden kann. Demzufolge wurde in den nachfolgenden Experimenten nach den f��r die MMP-9-Expression notwendigen und von NO modulierten Transkriptionsfaktoren in MCF-7-Zellen gesucht. Anhand von Western-Blot-Analysen und Gelshiftanalysen konnte gezeigt werden, dass die Aktivit��t des Transkriptionsfaktors AP-1 in MCF-7-Zellen durch NO gehemmt wird, w��hrend weder die Expressionspiegel noch die Bindungsaffinit��t der Transkriptionsfaktoren NF��B und Sp1 durch die NO-Behandlung ver��ndert sind. Weiterhin konnte unter Verwendung von pharmakologischen Inhibitoren der MAPK-Signalwege mit Hilfe der Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden, dass MAPK-vermittelte Signalwege zwar f��r die Induktion der MMP-9-Expression essenziell sind, diese jedoch nicht von NO beeinflusst sind. Im Unterschied hierzu konnte mit Hilfe eines PKC-Aktivit��tsassays gezeigt werden, dass die Gesamtaktivit��t von PKCs nach Behandlung von MCF-7-Zellen mit NO signifikant gehemmt ist. Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen, dass die NO-vermittelte Hemmung der TPA-induzierten MMP-9-Expression in MCF-7-Zellen im Wesentlichen auf eine NO-abh��ngige Reduktion der Protein-Kinase-C-Aktivit��t und einer daraus resultierenden Aktivit��tshemmung des Transkriptionsfaktors AP-1 zur��ckgef��hrt werden kann.

Charakterisierung spezieller pflanzlicher Gamma-Tubulin-Sequenzbereiche und Detektion potentieller Interaktionspartner mittels Yeast-two-Hybrid-System

Mitotische und postmitotische Vorg��nge pflanzlicher Zellen basieren auf der Funktion von Mikrotubuli. Es liegen nur wenige gesicherte Erkenntnisse zur Organisation dieser Multifunktionalit��t vor. Eine zentrale Bedeutung wird bei der Nukleation der Mikrotubuli an MTOCs durch ��-Tubulin zugeschrieben. Deren Zusammenlagerung an MTOCs ist jedoch noch nicht richtig verstanden. Dom��nen, die an der Proteinoberfl��che exponiert werden, k��nnten in Interaktionen involviert sein. Hier werden im Besonderen der ��-A und ��-B-Peptivmotiv diskutiert. Es wurde das ��-A- und ��-B-Peptidmotiv des ��-Tubulins hinsichtlich einer Konservierung innerhalb des Pflanzenreiches untersucht. Die beiden Bereiche sind bei den gr��nen Landpflanzen stark konserviert. Sie divergieren stark zu den einzelligen Gr��nalgen Chlamydomonas reinhardtii und Chlorella spec. Es wurden daher in der bestehenden phylogentischen L��cke weitere Organismen hinsichtlich des ��-A und ��-B Peptidmotivs untersucht. Auswahlkriterien der Organismen waren Ein-/Mehrzelligkeit, Besitz/Abwesenheit von Centriolen und Besitz/Abwesenheit von Gei��eln. Des weiteren wurde mit verschiedenen ��-Tubulin-Konstrukten um das ��-A- und ��-B-Peptidmotiv, gewonnen aus Nicotiana tabacum (BY2) mittels Y2H-System nach Interaktionspartnern gesucht. Bei den Sequenzuntersuchungen des ��-A- und ��-B-Peptidmotivs konnte festgestellt werden, dass die Konservierung innerhalb der Streptophytenlinie erfolgt. Interessant erweist sich die Tatsache, dass dieses Motiv bei den Jochalgen, welche ebenfalls den Streptophyten angeh��ren, nur im ��-A-Peptidmotiv auftritt. Es besteht die M��glichkeit, dass die beiden potentiellen Interaktionspartner verschiedene Proteine als Interaktions-partner besitzen. Durch eine Anwendung eines auf dem GAL4-Protein basierenden Y2H-Systems mit vier unterschiedlichen Konstrukten des ��-Tubulin-A/B-Peptidbereichs als K��der-konstrukt und einer cDNA-Bibliothek als Beutekonstrukt, wurden diverse Sequenzen identifiziert. Identifiziert wurden das Poly(A)-Bindeprotein, Glycerin-aldehyd-3-phosphatdehydrogenase, die S-adenosyl-L-methionine-Synthetase, diverse Proteasom-Untereinheiten, eine sekretorische Peroxidase, eine Ascorbat-Peroxidase, die NtPOX1-Peroxidase und verschiedene Peroxidasen aus Nicotiana tabacum, Sequenzen des Chloroplastengenoms, ein Myosin-��hnliches Protein und eine Sequenz auf dem 5. Chromosom des Medicago truncatula-Klons mth2-16f8 und diverse humane Sequenzen der Proteine DKFZp68 und DKFZp77. Die Ergebnisse weisen auf eine komplexe Funktionsweise der unterschiedlichen Komponenten des pflanzlichen Cytoskeletts und des ��-Tubulins hin. Zur Aufkl��rung m��sste dies in Zukunft mittels anderer genetischer, biochemischer oder funktioneller Methoden untersucht werden. Hypothesen ��ber Interaktionen der Cytoskelettkomponenten k��nnen wahrscheinlich nicht allein durch die Anwendung des Y2H-Systems aufgekl��rt werden.

Relevanz der Methioninoxidation aus evolution��rer Sicht und im akuten oxidativen Stressmodell der Alzheimerschen Krankheit

Im Laufe der Evolution m��ssen Sauerstoff-metabolisierende Organismen eine Reihe von Anpassungen entwickelt haben, um in der zytotoxischen oxidativen Umgebung der sauerstoff-haltigen Erdatmosph��re ��berleben zu k��nnen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgef��hrten vergleichenden Analysen mitochondrial kodierter und kern-kodierter Proteome mehrerer hundert Spezies haben ergeben, dass die Evolution eines alternativen genetischen Codes in Mitochondrien eine moderne Adaptation in diesem Sinne war. Viele aerobe Tiere und Pilze dekodieren in Abweichung vom genetischen Standard-Code das Codon AUA als Methionin. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese Spezies dadurch eine massive Akkumulation der sehr leicht oxidierbaren Aminos��ure Methionin in ihren Atmungskettenkomplexen erreichen, die generell ein bevorzugtes Ziel reaktiver Sauerstoffspezies sind. Der gewonnene Befund l��sst sich widerspruchsfrei nur unter Annahme einer antioxidativen Wirkung dieser Aminos��ure erkl��ren, wie sie erstmals 1996 von R. Levine anhand von Oxidationsmessungen in Modellproteinen postuliert worden war. In der vorliegenden Arbeit wird diese Hypothese nun direkt mittels neuartiger Modellsubstanzen in lebenden Zellen best��tigt. Die durchgef��hrten bioinformatischen Analysen und zellbiologischen Experimente belegen, dass kollektive Proteinver��nderungen die Triebkraft f��r die Evolution abweichender genetischer Codes sein k��nnen.rnDie Bedeutung von oxidativem Stress wurde dar��ber hinaus auch im Referenzrahmen einer akuten oxidativen Sch��digung im Einzelorganismus untersucht. Da oxidativer Stress in der Pathogenese altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimerschen Krankheit prominent involviert zu sein scheint, wurden die Auswirkungungen von Umwelt-induziertem oxidativem Stress auf den histopathologischen Verlauf in einem transgenen Modell der Alzheimerschen Krankheit in vivo untersucht. Dabei wurden transgene M��use des Modells APP23 im Rahmen von F��tterungsversuchen einer lebenslangen Defizienz der Antioxidantien Selen oder Vitamin E ausgesetzt. W��hrend die Selenoproteinexpression durch die selendefiziente Di��t gewebespezifisch reduziert wurde, ergaben sich keine Anzeichen eines beschleunigten Auftretens pathologischer Marker wie amyloider Plaques oder Neurodegeneration. Es war vielmehr ein unerwarteter Trend hinsichtlich einer geringeren Plaquebelastung in Vitamin E-defizienten Alzheimerm��usen zu erkennen. Auch wenn diese Daten aufgrund einer geringen Versuchstiergruppengr����e nur mit Vorsicht interpretiert werden d��rfen, so scheint doch ein Mangel an essentiellen antioxidativen N��hrstoffen die Progression in einem anerkannten Alzheimermodell nicht negativ zu beeinflussen.rn

Sources and pathways of methane formed in oxidative environments

Methane is the most abundant reduced organic compound in the atmosphere. As the strongest known long-lived greenhouse gas after water vapour and carbon dioxide methane perturbs the radiation balance of Earth���s atmosphere. The abiotic formation of methane requires ultraviolet irradiation of organic matter or takes place in locations with high temperature and/or pressure, e.g. during biomass burning or serpentinisation of olivine, under hydrothermal conditions in the oceans deep or below tectonic plates. The biotic methane formation was traditionally thought to be formed only by methanogens under strictly anaerobic conditions, such as in wetland soils, rice paddies and agricultural waste. rnIn this dissertation several chemical pathways are described which lead to the formation of methane under aerobic and ambient conditions. Organic precursor compounds such as ascorbic acid and methionine were shown to release methane in a chemical system including ferrihydrite and hydrogen peroxide in aquatic solution. Moreover, it was shown by using stable carbon isotope labelling experiments that the thio-methyl group of methionine was the carbon precursor for the methane produced. Methionine, a compound that plays an important role in transmethylation processes in plants was also applied to living plants. Stable carbon isotope labelling experiments clearly verified that methionine acts as a precursor compound for the methane from plants. Further experiments in which the electron transport chain was inhibited suggest that the methane generation is located in the mitochondria of the plants. The abiotic formation of methane was shown for several soil samples. Important environmental parameter such as temperature, UV irradiation and moisture were identified to control methane formation. The organic content of the sample as well as water and hydrogen peroxide might also play a major role in the formation of methane from soils. Based on these results a novel scheme was developed that includes both biotic and chemical sources of methane in the pedosphere.rn

Evolution��re Ver��nderungen in der Nutzung redox-aktiver Aminos��uren und ihre Ursachen

Gewebe, Zellen und speziell Zellkompartimente unterscheiden sich in ihrer Sauerstoffkonzentration, Stoffwechselrate und in der Konzentration an gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies. Um eine m��gliche ��nderung in der Aminos��urennutzung durch den Einfluss von Sauerstoff und seinen reaktiven Spezies untersuchen zu k��nnen wurden, Bereiche bzw. Kompartimente der menschlichen Zelle definiert, die einen Referenzrahmen bildeten und bekannt daf��r sind, einen relativ hohen Grad an reaktiven Sauerstoffspezies aufzuweisen. Aus dem Vergleich wurde deutlich, dass vor allem die beiden redox-aktiven und schwefeltragenden Aminos��uren Cystein und Methionin durch eine besondere Verteilung und Nutzung charakterisiert sind. Cystein ist hierbei diejenige Aminos��ure mit den deutlichsten ��nderungen in den f��nf untersuchten Modellen der oxidativen Belastung. In all diesen Modellen war die Nutzung von Cystein deutlich reduziert, wohingegen Methionin in Proteinen des Mitochondriums und der Elektronentransportkette angereichert war. Dieser auf den ersten Blick paradoxe Unterschied zwischen Cystein und Methionin wurde n��her untersucht, indem die differenzierte Methioninnutzung in verschiedenen Zellkompartimenten von Homo sapiens charakterisiert wurde.rnDie sehr leicht zu oxidierende Aminos��ure Methionin zeigt ein ungew��hnliches Verteilungsmuster in ihrer Nutzungsh��ufigkeit. Entgegen mancher Erwartung wird Methionin in zellul��ren Bereichen hoher oxidativer Belastung und starker Radikalproduktion intensiv verwendet. Dieses Verteilungsmuster findet man sowohl im intrazellul��ren Vergleich, als auch im Vergleich verschiedener Spezies untereinander, was daraufhin deutet, dass es einen lokalen Bedarf an redox-aktiven Aminos��uren gibt, der einen sehr starken Effekt auf die Nutzungsh��ufigkeit von Methionin aus��bt. Eine hohe Stoffwechselrate, die im Allgemeinen mit einer erh��hten Produktion von Oxidantien assoziiert wird, scheint ein ma��geblicher Faktor der Akkumulation von Methionin in Proteinen der Atmungskette zu sein. Die Notwendigkeit, oxidiertes Antioxidans wieder zu reduzieren, findet auch bei Methionin Anwendung, denn zu Methioninsulfoxid oxidiertes Methionin wird durch die Methioninsulfoxidreduktase wieder zu Methionin reduziert. Daher kann die spezifische Akkumulation von Methionin in Proteinen, die verst��rkt reaktiven Sauerstoffspezies ausgesetzt sind, als eine systematische Strategie angesehen werden, um andere labile Strukturen vor ungewollter Oxidation zu sch��tzen. rnDa Cystein in allen untersuchten Modellen der oxidativen Belastung und im Besonderen in Membranproteinen der inneren Mitochondrienmembran lebensspannenabh��ngig depletiert war, wurde dieses Merkmal n��her untersucht. Deshalb wurde die Hypothese getestet, ob ein besonderer Redox-Mechanismus der Thiolfunktion f��r diese selektive Depletion einer im Allgemeinen als harmlos oder antioxidativ geltenden Aminos��ure verantwortlich ist. Um den Effekt von Cysteinresten in Membranen nachzustellen, wurden prim��re humane Lungenfibroblasten (IMR90) mit diversen Modellsubstanzen behandelt. Geringe Konzentrationen der lipophilen Substanz Dodecanthiol verursachten eine signifikante Toxizit��t in IMR90-Zellen, die von einer schnellen Zunahme an polyubiquitinierten Proteinen und anderen Indikatoren des proteotoxischen Stresses, wie Sequestosom 1 (P62), HSP70 und HSP90 begleitet wurde. Dieser Effekt konnte spezifisch der Chemie der Thiolfunktion in Membranen zugeordnet werden, da Dodecanol (DOH), Dodecylmethylsulfid (DMS), Butanthiol oder wasserl��sliche Thiole weder eine cytotoxische Wirkung noch eine Polyubiquitinierung von Proteinen verursachten. Die Ergebnisse stimmen mit der Hypothese ��berein, dass Thiole innerhalb von biologischen Membranen als radikalische Kettentransferagentien wirken. Diese Eigenschaft wird in der Polymerchemie durch Nutzung von lipophilen Thiolen in hydrophoben Milieus technisch f��r die Produktion von Polymeren benutzt. Da die Thiylradikal-spezifische Reaktion von cis-Fetts��uren zu trans-Fetts��uren in 12SH behandelten Zellen verst��rkt ablief, kann gefolgert werden, dass 12SH zellul��r radikalisiert wurde. In lebenden Organismen kann demnach die Oxidation von Cystein die Sch��digung von Membranen beschleunigen und damit Einfallstore f��r die laterale Radikalisierung von integralen Membranproteinen schaffen, welche m��glicherweise der Langlebigkeit abtr��glich ist, zumindest, wenn sie in der inneren Mitochondrienmembran auftritt.

Ver��nderungen der DNA-Methylierung in Patienten mit AHCY-Defizienz

Die S-adenosyl-L-Homocysteinhydrolase (AHCY)-De���zienz ist eine seltene autosomal rezessive Erbkrankheit, bei der Mutationen im AHCY-Gen die Funktionsf��higkeit des kodierten Enzyms beeintr��chtigen. Diese Krankheit f��hrt zu Symptomen wie Entwicklungsverz��gerungen, mentaler Retardierung und Myopathie. In der vorliegenden Arbeit wurde der Ein���uss der AHCY-De���zienz auf die Methylierung der DNA in Blutproben und Fibroblasten von Patienten mit AHCY-De���zienz, sowie in HEK293- und HepG2-Zelllinien mit AHCY-Knockdown untersucht. Der gesamtgenomische Methylierungsstatus wurde mit Hilfe des MethylFlash ��� Methylated DNA Quanti���cation Kit (Epigentek) bei drei Patienten-Blutproben festgestellt. In den Blutproben von sieben Patienten und Fibroblasten von einem Patienten wurde die Methylierung von DMRs sieben gepr��gter Gene (GTL2, H19, LIT1, MEST, NESPAS, PEG3, SNRPN) und zwei repetitiver Elemente (Alu, LINE1) mittels Bisul���t-Pyrosequenzierung quanti���ziert und durch High Resolution Melting-Analyse best��tigt. Zus��tzlich wurde eine genomweite Methylierungsanalyse mit dem In���nium�� HumanMethylation450 BeadChip (Illumina) f��r vier Patientenproben durchgef��hrt und die Expression von AHCY in Fibroblasten mittels Expressions-qPCR und QUASEP-Analyse untersucht. Die Methylierungsanalysen ergaben eine Hypermethylierung der gesamtgenomischen DNA und stochastische Hypermethylierungen von DMRs gepr��gter Gene bei einigen Patienten. Die HEK293- und HepG2-Zelllinien wiesen dagegen haupts��chlich stochastische Hypomethylierungen an einigen DMRs gepr��gter Gene und LINE1-Elementen auf. Die genomweite Methylierungsarray-Analyse konnte die Ergebnisse der Bisul���t-Pyrosequenzierung nicht best��tigen. Die Expressionsanalysen der AHCY-de���zienten Fibroblasten zeigten eine verminderte Expression von AHCY, wobei beide Allele etwa gleich stark transkribiert wurden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die AHCY-De���zienz eine gute Modellerkrankung f��r die Untersuchung biologischer Konsequenzen von Methylierungsst��rungen im Rahmen der Epigenetik-Forschung sein k��nnte. Sie ist unseres Wissens die erste monogene Erkrankung mit symptomaler DNA-Hypermethylierung beim Menschen.

Isolierung von Essigs��ure-, Propions��ure- und Butters��ure-bildenden Bakterien aus Biogasanlagen

In der vorliegenden Arbeit wurden Essigs��ure-, Propions��ure und Butters��ure-bildende Bakterien aus einer thermophilen und drei mesophilen Biogasanlagen sowie aus zwei Hochdruck-Biogas-Laborfermentern isoliert. Die Fermenter waren mit dem nachwachsenden Rohstoff Maissilage, teilweise mit Rinder- oder Schweineg��lle und weiteren festen Inputstoffen gef��ttert. F��r die Isolierung von S��ure-bildenden Bakterien wurde ein Mineralsalzmedium verwendet, welchem als Kohlenstoffquelle Na-DL-Laktat, Succinat, Ethanol, Glycerin, Glucose oder eine Aminos��uremischung (Alanin, Serin, Threonin, Glutamins��ure, Methionin und Cystein) hinzugef��gt wurde. Hierbei handelt es sich um Substrate, welche beim anaeroben Abbau w��hrend der Hydrolyse oder der prim��ren G��rung entstehen k��nnen. Die erhaltenen Isolate waren in der Lage, aus diesen Substraten Essigs��ure, Propions��ure oder Butters��ure zu bilden. Insgesamt wurden aus den beprobten Anlagen 49 Isolate gewonnen, welche zu den Phyla Firmicutes, Tenericutes oder Thermotogae geh��rten. Mit Hilfe von 16S rDNA-Sequenzen konnten die meisten Isolate als Clostridium sporosphaeroides, Defluviitoga tunisiensis und Dendrosporobacter sp. identifiziert werden. Die Bildung von Essigs��ure, Propions��ure oder Butters��ure wurde in Kulturen von Isolaten festgestellt, welche als folgende Arten identifiziert wurden: Bacillus thermoamylovorans, Clostridium aminovalericum, Clostridium cochlearium/Clostridium tetani, Clostridium sporosphaeroides, Dendrosporobacter sp., Proteiniborus sp., Selenomonas bovis und Tepidanaerobacter sp. Zwei Isolate, verwandt mit Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, konnten Butters��ure und Milchs��ure bilden. In Kulturen von Defluviitoga tunisiensis wurde Essigs��urebildung festgestellt. Ein Vergleich der 16S rDNA-Sequenzen mit Datenbanken und die Ergebnisse der PCR-Amplifikationen mit Isolat-spezifischen Primerpaaren ergaben zus��tzlich Hinweise, dass es sich bei einigen Isolaten um neue Arten handeln k��nnte (z. B. Stamm Tepidanaerobacter sp. AS34, Stamm Proteiniborus sp. ASG1.4, Stamm Dendrosporobacter sp. LG2.4, Stamm Desulfotomaculum sp. EG2.4, Stamm Gallicola sp. SG1.4B und Stamm Acholeplasma sp. ASSH51). Durch die Entwicklung Isolat-spezifischer Primerpaare, abgeleitet von 16S rDNA-Sequenzen der Isolate oder Referenzst��mmen, konnten die Isolate in Biogasanlagen detektiert und mittels qPCR quantifiziert werden (haupts��chlich im Bereich zwischen 1000 bis 100000000 Kopien der 16S rDNA/g BGA-Probe). Weiterhin konnten die Isolate mit Hilfe physiologischer Versuche charakterisiert und deren Rolle in der anaeroben Abbaukette diskutiert werden. Die Art Defluviitoga tunisiensis scheint eine gro��e Bedeutung in Biogasanlagen zu spielen. Defluviitoga tunisiensis wurde am h��ufigsten in Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Arbeit isoliert und konnte auch mit Hilfe des entwickelten Primerpaares in hohen Abundanzen in den beprobten Biogasanlagen detektiert werden (10000 - 100000000 Kopien der 16S rDNA/g BGA-Probe). Die manuelle Annotation des Gesamtgenoms sowie die Substratverwertungsversuche haben gezeigt, dass Defluviitoga tunisiensis ein sehr breites Substratspektrum in der Verwertung von Kohlenhydraten besitzt und dadurch m��glicherweise eine wichtige Rolle bei der Verwertung von Biomasse in Biogasanlagen einnimmt. Mit Hilfe der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten somit neue Einblicke in die zweite Stufe des anaeroben Abbaus, die Acidogenese, in Biogasanlagen gegeben werden. rn

Investigations on DNA methylation by Dnmt2 and impact of tRNA modifications on TLR7 stimulation

The incorporation of modified nucleotides into ribonucleic acids (RNAs) is important for their structure and proper function. These modifications are inserted by distinct catalytic macromolecules one of them being Dnmt2. It methylates the Cytidine (C) at position 38 in tRNA to 5-methylcytidine (m5C). Dnmt2 has been a paradigm in this respect, because all of its nearest neighbors in evolution are DNA-cytosine C5-methyltransferases and methylate DNA, while its (own) DNA methyltransferase activity is the subject of controversial reports with rates varying between zero and very weak. This work determines whether the biochemical potential for DNA methylation is present in the enzyme. It was discovered that DNA fragments, when presented as covalent RNA:DNA hybrids in the structural context of a tRNA, can be more efficiently methylated than the corresponding natural tRNA substrate. Additional minor deviations from a native tRNA structure that were seen to be tolerated by Dnmt2 were used for a stepwise development of a composite system of guide RNAs that enable the enzyme to perform cytidine methylation on single stranded DNA in vitro. Furthermore, a proof-of-principle is presented for utilizing the S-adenosyl methionine-analog cofactor SeAdoYn with Dnmt2 to search for new possible substrates in a SELEX-like approach.rnIn innate immunity, nucleic acids can function as pathogen associated molecular patterns (PAMPs) recognized by pattern recognition receptors (PRRs). The modification pattern of RNA is the discriminating factor for toll-like receptor 7 (TLR7) to distinguish between self and non-self RNA of invading pathogens. It was found that a 2'-O-methylated guanosine (Gm) at position18, naturally occurring at this position in some tRNAs, antagonizes recognition by TLR7. In the second part of this work it is pointed out, that recognition extends to the next downstream nucleotide and the effectively recognized molecular detail is actually a methylated dinucleotide. The immune silencing effect of the ribose methylation is most pronounced if the dinucleotide motif is composed of purin nucleobases whereas pyrimidines diminish the effect. Similar results were obtained when the Gm modification was transposed into other tRNA domains. Point mutations abolishing base pairings important for a proper tertiary structure had no effect on the immune stimulatory potential of a Gm modified tRNA. Taken together these results suggest a processive type of RNA inspection by TLR7.rn