Untersuchungen zur Induktion von Filopodien durch das Amyloid Precursor Like Protein 1 (APLP1), ein Mitglied der APP-Genfamilie

Die Alzheimer Krankheit ist eine fortschreitendende Demenzerkrankung von der in Deutschland ca. 1,6 Millionen Menschen betroffen sind. Im Gehirn der Patienten finden sich sogenannte amyloide Plaques, deren Hauptbestandteil das Aβ-Protein ist. Dieses Peptid ist ein Spaltprodukt des APP-Proteins (engl. amyloid precursor protein). APP ist das namensgebende Mitglied der APP-Proteinfamilie zu der neben APP die beiden APP-Homologen APLP1 und APLP2 (engl. amyloid precursor like protein) gehören. Obwohl inzwischen über die pathologische Rolle dieser Proteinfamilie bei der Alzheimer Krankheit vieles bekannt ist, bleiben die physiologischen Funktionen dieser Proteine bisher größtenteils ungeklärt. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmals einen APLP1-spezifischen Effekt auf die Ausbildung von Filopodien. Sowohl das humane als auch das murine APLP1 induzierten nach transienter Überexpression die Bildung zahlreicher filopodialer Fortsätze auf der Membran von PC12-Zellen. Vergleichbare Resultate konnten mit beiden APLP1-Proteinen auch auf der Membran von embryonalen (E18.5), cortikalen Neuronen der Ratte gezeigt werden. Dass APLP1 einen derartigen Effekt auf Neuronen und PC12-Zellen zeigt, begründet die Annahme, dass APLP1 in vivo eine Funktion bei der Entwicklung und Differenzierung von Neuronen übernimmt. Anhand von Versuchen mit deletierten APLP1-Proteinen und APLP1/APLP2-Chimärproteinen konnte gezeigt werden, dass die von Exon 5 und Exon 6 codierten Bereiche des APLP1 für die Induktion der Filopodien essentiell sind. Unter Einbeziehung von in ihrer räumlichen Struktur bereits bekannten Domänen und aufgrund von Homologievergleichen der primären Aminosäuresequenz dieser Region mit entsprechenden Bereichen der APP- bzw. APLP2-Proteine wurde die wahrscheinliche Lage der Filopodien-induzierenden Domäne innerhalb des von Exon 6 codierten Bereiches diskutiert. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die untersuchte Induktion von Filopodien durch die sogenannte α-Sekretierung moduliert werden kann. Unter den gewählten Versuchsbedingungen war nur membranständiges APLP1, nicht aber sekretiertes APLP1 in der Lage, Filopodien zu induzieren. Abschliessend wurden Ergebnisse gezeigt, die erste Einblicke in Signalkaskaden erlauben, die von APLP1 angesteuert werden und so die Enstehung der Filopodien auslösen. Bezüglich des primären Prozesses der Signalkaskade, der Bindung von APLP1 an einen bisher unbekannten Rezeptor, wurde die Möglichkeit diskutiert, ob APP oder APLP2 oder sogar APLP1 selbst als Rezeptor fungieren könnten. Die beobachteten Prozesse nach Überexpression von APLP1 entsprechen vermutlich einer physiologischen Funktion bei der Differenzierung von Neuronen, die mit der Interaktion einer extrazellulär gelegenen Domäne mit einem Rezeptor beginnt, die Aktivierung einer Signalkaskade zur Akrinreorganisation zu Folge hat und die Entstehung filopodialer Strukturen auslöst.

EPR spectroscopic investigation of membrane protein structure and folding on light harvesting complex LHCIIb

Structure and folding of membrane proteins are important issues in molecular and cell biology. In this work new approaches are developed to characterize the structure of folded, unfolded and partially folded membrane proteins. These approaches combine site-directed spin labeling and pulse EPR techniques. The major plant light harvesting complex LHCIIb was used as a model system. Measurements of longitudinal and transversal relaxation times of electron spins and of hyperfine couplings to neighboring nuclei by electron spin echo envelope modulation(ESEEM) provide complementary information about the local environment of a single spin label. By double electron electron resonance (DEER) distances in the nanometer range between two spin labels can be determined. The results are analyzed in terms of relative water accessibilities of different sites in LHCIIb and its geometry. They reveal conformational changes as a function of micelle composition. This arsenal of methods is used to study protein folding during the LHCIIb self assembly and a spatially and temporally resolved folding model is proposed. The approaches developed here are potentially applicable for studying structure and folding of any protein or other self-assembling structure if site-directed spin labeling is feasible and the time scale of folding is accessible to freeze-quench techniques.

RAB3GAP1 und RAB3GAP2 (RAB3 GTPase-activating Protein 1/2) beeinflussen die Autophagie in C. elegans und humanen Zellen

Die Proteinhomöostase wird in der Zelle von drei Stoffwechselwegen reguliert: den molekularen Chaperonen, dem Ubiquitin-Proteasom-System und dem autophagosomalen Abbauweg. Die (Makro)Autophagie verpackt und transportiert zytosolische Komponenten in Autophagosomen zu den Lysosomen, wo sie abgebaut werden. Eine Störung dieses Abbauwegs wirkt auf die Proteostase.rnIn dieser Dissertation wurde C. elegans als Modellorganismus zur Erforschung von Proteinstabilität genutzt. In einer RNAi-vermittelten Proteostase-Analyse von Chromosom I und ausgewählter zusätzlicher Gene wurde ein Wurmstamm, der ein Luc::GFP-Konstrukt im Muskel exprimiert, genutzt. Dieses Reporterprotein aggregiert unter Hitzestressbedingungen und diese Aggregation kann durch Modulatoren der Proteostase beeinflusst werden. Dabei wurden mögliche neue Faktoren der Proteinhomöostase entdeckt. Durch weitere Experimente bei denen die Aggregation von PolyQ35::YFP im AM140-System, der Paralyse-Phänotyp und die Akkumulation Thioflavin S-gefärbter Aggregate von Aβ42 im CL2006-Wurmstamm und die Effekte auf die Autophagie mittels eines GFP::LGG1-Konstrukt analysiert wurden, konnten rbg-1 und rbg-2 als neue Modulatoren der Proteinhomöostase, insbesondere der Autophagie, identifiziert werden.rnIm Säuger bilden beide Orthologe dieser Gene, RAB3GAP1 und RAB3GAP2 den heterodimeren RAB3GAP-Komplex, der bisher nur bekannt war für die Stimulation der Umwandlung der GTP-gebundenen aktiven Form zur GDP-gebundenen inaktiven Form der RAB GTPase RAB3. In Immunoblot-Analysen und mikroskopischen Darstellungen im Säugersystem konnte gezeigt werden, dass die Effekte auf die Proteostase über den autophagosomalen Abbauweg wirken. RAB3GAP1/2 wirken als positive Stimulatoren, wenn die Lipidierung von LC3-I und der autophagische Flux von LC3-II und p62/SQSTM1 betrachtet werden. Diese Effekte werden aber nicht über die RAB GTPase RAB3 vermittelt. Die Proteine FEZ1 und FEZ2 haben einen antagonistischen Effekt auf die Autophagie und wenn alle vier Komponenten RAB3GAP1, RAB3GAP2, FEZ1 und FEZ2 zusammen herunter- oder hochreguliert werden, heben sich diese Effekte auf. In Co-Immunopräzipitationen und proteomischen Analysen konnte keine direkte Interaktion zwischen dem RAB3GAP-Komplex und FEZ1/2 oder zu anderen Autophagie-Genen nachgewiesen werden.rnHier konnte der RAB3GAP-Komplex funktionell mit Proteostase und Autophagie in C. elegans und Säugerzellen assoziiert werden. Dieser Komplex zeigt Einflüsse auf die autophagosomale Biogenese indem sie die Proteostase und die Bildung von (prä)autophagosomalen Strukturen in C. elegans und die Lipidierung von LC3 und damit den autophagischen Flux der Autophagiesubstrate LC3-II und p62/SQSTM1 in Säugerzellen beeinflusst. Darüber hinaus wirkt RAB3GAP der komplexen Autophagie-Unterdrückung durch FEZ1 und FEZ2 entgegen. Somit konnte gezeigt werden, dass RAB3GAP als neuartiger Faktor auf die autophagosomale Biogenese und somit auf die Proteostase wirkt.rn

A biomimetic model membrane system on oxidic surfaces designed for the investigation of cytochrome c oxidase and other membrane proteins by fluorescence and waveguide spectroscopy

Die transmembrane Potenzialdifferenz Δφm ist direkt mit der katalytischen Aktivität der Cytochrom c Oxidase (CcO) verknüpft. Die CcO ist das terminale Enzym (Komplex IV) in der Atmungskette der Mitochondrien. Das Enzym katalysiert die Reduktion von O2 zu 2 H2O. Dabei werden Elektronen vom natürlichen Substrat Cytochrom c zur CcO übertragen. Der Eleltronentransfer innerhalb der CcO ist an die Protonentranslokation über die Membran gekoppelt. Folglich bildet sich über der inneren Membrane der Mitochondrien eine Differenz in der Protonenkonzentration. Zusätzlich wird eine Potenzialdifferenz Δφm generiert.rnrnDas Transmembranpotenzial Δφm kann mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie unter Einsatz eines potenzialemfindlichen Farbstoffs gemessen werden. Um quantitative Aussagen aus solchen Untersuchungen ableiten zu können, müssen zuvor Kalibrierungsmessungen am Membransystem durchgeführt werden.rnrnIn dieser Arbeit werden Kalibrierungsmessungen von Δφm in einer Modellmembrane mit inkorporiertem CcO vorgestellt. Dazu wurde ein biomimetisches Membransystem, die Proteinverankerte Doppelschicht (protein-tethered Bilayer Lipid Membrane, ptBLM), auf einem transparenten, leitfähigem Substrat (Indiumzinnoxid, ITO) entwickelt. ITO ermöglicht den simultanen Einsatz von elektrochemischen und Fluoreszenz- oder optischen wellenleiterspektroskopischen Methoden. Das Δφm in der ptBLM wurde durch extern angelegte, definierte elektrische Spannungen induziert. rnrnEine dünne Hydrogelschicht wurde als "soft cushion" für die ptBLM auf ITO eingesetzt. Das Polymernetzwerk enthält die NTA Funktionsgruppen zur orientierten Immobilisierung der CcO auf der Oberfläche der Hydrogels mit Hilfe der Ni-NTA Technik. Die ptBLM wurde nach der Immobilisierung der CcO mittels in-situ Dialyse gebildet. Elektrochemische Impedanzmessungen zeigten einen hohen elektrischen Widerstand (≈ 1 MΩ) der ptBLM. Optische Wellenleiterspektren (SPR / OWS) zeigten eine erhöhte Anisotropie des Systems nach der Bildung der Doppellipidschicht. Cyklovoltammetriemessungen von reduziertem Cytochrom c bestätigten die Aktivität der CcO in der Hydrogel-gestützten ptBLM. Das Membranpotenzial in der Hydrogel-gestützten ptBLM, induziert durch definierte elektrische Spannungen, wurde mit Hilfe der ratiometrischen Fluoreszenzspektroskopie gemessen. Referenzmessungen mit einer einfach verankerten Dopplellipidschicht (tBLM) lieferten einen Umrechnungsfaktor zwischen dem ratiometrischen Parameter Rn und dem Membranpotenzial (0,05 / 100 mV). Die Nachweisgrenze für das Membranpotenzial in einer Hydrogel-gestützten ptBLM lag bei ≈ 80 mV. Diese Daten dienen als gute Grundlage für künftige Untersuchungen des selbstgenerierten Δφm der CcO in einer ptBLM.

Functional characterization of the placenta specific protein PLAC1 and its use for cancer immunotherapy

Summary Antibody-based cancer therapies have been successfully introduced into the clinic and have emerged as the most promising therapeutics in oncology. The limiting factor regarding the development of therapeutical antibody vaccines is the identification of tumor-associated antigens. PLAC1, the placenta-specific protein 1, was categorized for the first time by the group of Prof. Sahin as such a tumor-specific antigen. Within this work PLAC1 was characterized using a variety of biochemical methods. The protein expression profile, the cellular localization, the conformational state and especially the interacting partners of PLAC1 and its functionality in cancer were analyzed. Analysis of the protein expression profile of PLAC1 in normal human tissue confirms the published RT-PCR data. Except for placenta no PLAC1 expression was detectable in any other normal human tissue. Beyond, an increased PLAC1 expression was detected in several cancer cell lines derived of trophoblastic, breast and pancreatic lineage emphasizing its properties as tumor-specific antigen. rnThe cellular localization of PLAC1 revealed that PLAC1 contains a functional signal peptide which conducts the propeptide to the endoplasmic reticulum (ER) and results in the secretion of PLAC1 by the secretory pathway. Although PLAC1 did not exhibit a distinct transmembrane domain, no unbound protein was detectable in the cell culture supernatant of overexpressing cells. But by selective isolation of different cellular compartments PLAC1 was clearly enriched within the membrane fraction. Using size exclusion chromatography PLAC1 was characterized as a highly aggregating protein that forms a network of high molecular multimers, consisting of a mixture of non-covalent as well as covalent interactions. Those interactions were formed by PLAC1 with itself and probably other cellular components and proteins. Consequently, PLAC1 localize outside the cell, where it is associated to the membrane forming a stable extracellular coat-like structure.rnThe first mechanistic hint how PLAC1 promote cancer cell proliferation was achieved identifying the fibroblast growth factor FGF7 as a specific interacting partner of PLAC1. Moreover, it was clearly shown that PLAC1 as well as FGF7 bind to heparin, a glycosaminoglycan of the ECM that is also involved in FGF-signaling. The participation of PLAC1 within this pathway was approved after co-localizing PLAC1, FGF7 and the FGF7 specific receptor (FGFR2IIIb) and identifying the formation of a trimeric complex (PLAC1, FGF7 and the specific receptor FGFR2IIIb). Especially this trimeric complex revealed the role of PLAC1. Binding of PLAC1 together with FGF7 leads to the activation of the intracellular tyrosine kinase of the FGFR2IIIb-receptor and mediate the direct phosphorylation of the AKT-kinase. In the absence of PLAC1, no FGF7 mediated phosphorylation of AKT was observed. Consequently the function of PLAC1 was clarified: PLAC1 acts as a co-factor by stimulating proliferation by of the FGF7-FGFR2 signaling pathway.rnAll together, these novel biochemical findings underline that the placenta specific protein PLAC1 could be a new target for cancer immunotherapy, especially considering its potential applicability for antibody therapy in tumor patients.

Induktion und Signaltransduktion bei der Expression des Chemokins MCP-1 in Monozyten

Das Chemokin 'Monocyte Chemoattractant Protein-1' (MCP-1) spielt bei inflammatorischen Erkrankungen eine wesentliche Rolle. Verschiedene Zelltypen produzieren MCP-1. Es interessierte, welche Stimuli in Monozyten MCP-1 induzieren können und welche Signaltransduktionskaskaden daran beteiligt sind. Darüber hinaus sollte die Rolle einzelner Transkriptionsfaktoren und Promotorregionen des MCP-1-Gens untersucht werden.Komponenten Gram-positiver und -negativer Bakterien, Phorbolester und Substanzen, die die intrazelluläre Calciumkonzentration erhöhen, induzierten die MCP-1-Expression in einer humanen myelomonozytären Zellinie (THP-1) und in frisch isolierten Monozyten. Die mit Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte MCP-1-Expression war stark von der MAPK/ERK-Kinase (MEK)-1/-2 und von I-kappaB Kinasen beziehungsweise NF-kappaB abhängig, dagegen scheinen Calcineurin, Calmodulinkinasen und die 'Mitogen-Activated Protein Kinase' p38 keine entscheidende Rolle zu spielen. Die Thapsigargin (TG)-induzierte MCP-1-Bildung durch Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration war zusätzlich von Calcineurin und Calmodulinkinasen abhängig. Als nukleäre Transkriptionsfaktoren wurden bei der LPS-Stimulation NF-kappaB sowie AP-1 und zusätzlich NF-ATc3 bei Stimulation durch TG nachgewiesen. Die Untersuchung des MCP-1-Promotors konnte eine Bindung von NF-kappaB- und AP-1-Mitglieder an eine bislang nicht untersuchte distale Region und eine AP-1-Bindung an eine proximale Region nachweisen. Die Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß die Aktivierung der MCP-1-Expression durch verschiedene Stimuli unter Beteiligung teilweise unterschiedlicher Signaltransduktionswege abläuft und sowohl eine proximale als auch eine distale Promotorregion des MCP-1-Gens daran beteiligt ist.

On the cellular stress response to Staphylococcus aureus alpha-toxin

Staphylococcus aureus alpha-hemolysin was the first bacterial toxin recognized to form pores in the plasma membrane of eukaryotic cells. It is secreted as a water-soluble monomer that upon contact with target membranes forms an amphiphatic heptameric beta-barrel which perforates the bilayer. As a consequence, red cells undergo colloidosmotic lyses, while some nucleated cells may succumb to necrosis or programmed cell death. However, most cells are capable of repairing a limited number of membrane lesions, and then respond with productive transcriptional activation of NF-kB. In the present study, by using microarray and semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), data from a previously performed serial analysis of gene expression (SAGE) were extended and verified, revealing that immediate early genes (IEGs) such as c-fos, c-jun and egr-1 are strongly induced at 2-8 h after transient toxin treatment. Activating protein 1 (AP-1: c-Fos, c-Jun) binding activity was increased accordingly. As IEGs are activated by growth factors, these findings led to the discovery that -toxin promotes cell cycle progression of perforated cells in an EGFR-dependent fashion. Although the amount of c-fos mRNA rose rapidly after toxin treatment, c-Fos protein expression was observed only after a lag of about 3 h. Since translation consumes much ATP, which transiently drops after transient membrane perforation, the suspicion arised that membrane-perforation caused global, but temporary downregulation of translation. In fact, eIF2α became heavily phosphorylated minutes after cells had been confronted with the toxin, resulting in shutdown of protein synthesis before cellular ATP levels reached the nadir. GCN2 emerged as a candidate eIF2α kinase, since its expression rapidly increased in toxin-treated cells. Two hours after toxin treatment, GADD34 transcripts, encoding a protein that targets the catalytic subunit of protein phosphatase 1 (PP1) to the endoplasmic reticulum, were overexpressed. This was followed by dephosphorylation of eIF2α and resumption of protein synthesis. Addition of tautomycetin, a specific inhibitor of PP1, led to marked hyperphosphorylation of eIF2α and significantly reduced the drop of ATP-levels in toxin-treated cells. A novel link between two major stress-induced signalling pathways emerged when it was found that both translational arrest and restart were under the control of stress-activated protein kinase (SAPK) p38. The data provide an explanation for the indispensible role of p38 for defence against the archetypal threat of membrane perforation by agents that produce small transmembrane-pores.

LRP1 modulates APP trafficking and APP metabolism within compartments of the secretory pathway. Increased AICD generation is ineffective in nuclear translocation and transcriptional activation

LRP1 modulates APP trafficking and metabolism within compartments of the secretory pathway The amyloid precursor protein (APP) is the parent protein to the amyloid beta peptide (Abeta) and is a central player in Alzheimer’s disease (AD) pathology. Abeta liberation depends on APP cleavage by beta- and gamma-secretases. To date, only a unilateral view of APP processing exists, excluding other proteins, which might be transported together and/or processed dependent on each other by the secretases described above. The low density lipoprotein receptor related protein 1 (LRP1) was shown to function as such a mediator of APP processing at multiple steps. Newly synthesized LRP1 can interact with APP, implying an interaction between these two proteins early in the secretory pathway. Therefore, we wanted to investigate whether LRP1 can mediate APP trafficking along the secretory pathway, and, if so, whether it affects APP processing. Indeed, we demonstrate that APP trafficking is strongly influenced by LRP1 transport through the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi compartments. LRP1-constructs with ER- and Golgi-retention motifs (LRP-CT KKAA, LRP-CT KKFF) had the capacity to retard APP trafficking at the respective steps in the secretory pathway. Here, we provide evidence that APP metabolism occurs in close conjunction with LRP1 trafficking, highlighting a new role of lipoprotein receptors in neurodegenerative diseases. Increased AICD generation is ineffective in nuclear translocation and transcriptional activity A sequence of amyloid precursor protein (APP) cleavages gives rise to the APP intracellular domain (AICD) together with amyloid beta peptide (Abeta) and/or p3 fragment. One of the environmental factors identified favouring the accumulation of AICD appears to be a rise in intracellular pH. This accumulation is a result of an abrogated cleavage event and does not extend to other secretase substrates. AICD can activate the transcription of artificially expressed constructs and many downstream gene targets have been discussed. Here we further identified the metabolism and subcellular localization of the constructs used in this well documented gene reporter assay. We also co-examined the mechanistic lead up to the AICD accumulation and explored possible significances for its increased expression. We found that most of the AICD generated under pH neutralized conditions is likely that cleaved from C83. Furthermore, the AICD surplus is not transcriptionally active but rather remains membrane tethered and free in the cytosol where it interacts with Fe65. However, Fe65 is still essential in AICD mediated transcriptional transactivation although its exact role in this set of events is unclear.

Struktur und Funktion des Lipoproteins von Nereis virens (Annelida)

Ein discoidales Lipoprotein aus dem Polychaeten Nereis virens (Annelida) wurde eingehend charakterisiert. Im Vordergrund standen dabei die transportierten Lipide, sowie die Ultrastruktur des Partikels. Das Nereis-Lipoprotein besitzt eine für Invertebraten atypische Lipidzusammensetzung: Außer den Phospholipiden gibt es keine klar dominierende Lipidklasse. Die Charakterisierung der Apolipoproteine zeigt Gemeinsamkeiten mit den Apolipophorinen der Insekten: Wie diese besitzt das Nereis-Lipoprotein zwei Apolipoproteine, die in einer 1:1-Stöchiometrie angeordnet sind. Das größere Protein (ApoNvLp I) ist dabei stärker zum wässrigen Medium exponiert ist als das kleinere (ApoNvLp II). Beide Proteinuntereinheiten sind N-glycosyliert. ApoNvLp II ist zusätzlich noch O-glycosyliert. Bei den Sekundärstrukturen dominieren β-Strukturen (35%) gegenüber α-Helices (14%); 28% waren ungeordnete Strukturen. Die Masse wurde mit verschiedenen Methoden bestimmt: sie liegt zwischen ~800 kDa (Gelfiltration) und ~860 kDa (Analytische Ultrazentrifugation). Der Sedimentationskoeffizient beträgt 9,7 S. Der zelluläre Lipoproteinrezeptor wurde aus einer großen Anzahl von Zellen und Geweben isoliert. Die biochemische Charakterisierung des Rezeptormoleküls zeigte es als ein monomeres, integrales, N- und O-glycosyliertes Membranprotein mit einer Masse von ~114 kDa. Die Bindungscharakteristika (Abhängigkeit von Ca2+, Disulfidbrücken) weisen es als Mitglied der LDLR-Superfamilie aus. In vitro-Inkubationsversuche mit fluoreszenzmarkierten Lipoproteinen zeigten die Aufnahme sowohl in Oocyten als auch in freie Coelomzellen (Elaeocyten) sowie in Spermatogonien- und Tetradenstadien. Auffällig war, dass die Lipide zusammen mit den Apolipoproteinen in die Dottergranula der Eizellen eingelagert wurden und nicht direkt in die Lipidtropfen. Auch bei den Elaeocyten wurden die Lipide nicht direkt in den Lipidtropfen eingelagert. Intakte Lipoproteine konnten per Dichtegradienten-Ultrazentrifugation nur aus Spermatogonien isoliert werden. Die isolierten Lipoproteine hatten die gleiche ‚Morphologie’ wie die aus der Coelomflüssigkeit isolierten, zeigten jedoch sehr viele Peptidfragmente im SDS-Gel, was auf eine beginnende Degradation hinweist. Es wird ein Modell für den Lipidtransport in Nereis virens vorgeschlagen, bei dem den Elaeocyten eine entscheidende Rolle im Lipidstoffwechsel zufällt.

Biomimetic bilayer membranes made from polymers and lipids

Amphiphile Blockcopolymere sind in der Lage in Wasser Morphologien auszubilden, die analog sind zur hydrophil-hydrophob-hydrophil-Struktur von natürlichen Lipiddoppelschichten. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal die Präparation und Charakterisierung von oberflächengestützten Polymerdoppelschichten aus Polybutadien-b-Polyethylenoxid (PB-PEO) beschrieben. Für die Herstellung dieser Strukturen wurden zwei unterschiedliche Präparationsstrategien verfolgt. Der erste Weg besteht aus einer zweistufigen Methode, bei der im ersten Schritt organisierte Monoschichten mittels Langmuir-Blodgett-Transfer auf Gold übertragen und kovalent angebunden werden. Im zweiten Schritt werden hydrophobe Wechselwirkungen ausgenutzt, um über Langmuir-Schaefer-Transfer eine weitere Schicht aufzubringen. Somit wurden homogene Architekturen erzeugt, die oberflächengestützten Lipiddoppelschichten gleichen. Als alternativer, einstufiger Ansatz zur Herstellung von Polymerdoppelschichten wurde das Spreiten von Polymervesikeln auf Gold verfolgt. Auch hierdurch ließen sich Doppelschichtstrukturen mit einer vollständigen Oberflächenbedeckung erzeugen. Die hergestellten Polymerdoppelschichten besitzen eine Dicke von 11-14 nm, die von der Präparationsmethode abhängt. Die Polymerstrukturen weisen bei Trocknung für 1.5 h eine Stabilität gegenüber Luft auf. Bei längeren Trocknungszeiten von ca. 12 h kommt es zu einer Reorganisation der Oberfläche. Dies deutet darauf hin, dass Wasser dazu notwendig ist die Strukturen auf lange Sicht zu stabilisieren. Um die Biokompatibilität der Polymerschichten nachzuweisen, wurden die Wechselwirkungen mit dem membranaktiven Peptid Polymyxin B und dem Transmembranprotein α-Haemolysin gezeigt. Mobilität ist ein wichtiger Faktor für die korrekte Funktion vieler Transmembranproteine. Um die laterale Diffusionsdynamik innerhalb der künstlichen Strukturen zu untersuchen, wurde die Mobilität eines integralen Modellpeptids und von fluoreszierenden Membransonden gemessen. Es konnte mit einzelmolekülempfindlichen Techniken gezeigt werden, dass das α-helikale Peptid und die kleinen Fluoreszenzfarbstoffe frei im hydrophoben Kern der Polymerdoppelschicht diffundieren können. Die Diffusion von beiden Spezies scheint stark von der Fluidität der Polymermatrix beeinflusst zu sein. Ein weiterer Teil dieser Arbeit widmet sich der Entwicklung eines angemessenen, lipidbasierten Referenzsystems für zukünftige Proteinuntersuchungen. Hierzu wurde eine neue Methode zu Herstellung von peptidgestützten Lipiddoppelschichtmembranen entwickelt. Dies wurde durch kovalente Befestigung eines Thiopeptids an einen Goldfilm und darauffolgende Anbindung eines Lipids erreicht. Zur Ausbildung der Lipiddoppelschicht auf dem Lipopeptidunterbau wurder der Rapid Solvent Exchange verwendet. Die Ausbildung der Lipiddoppelschicht wurde sowohl auf microskopischer als auch auf makroskopischer Ebene nachgewiesen. Im letzten Schritt wurde die Anwendbarkeit des Modelsystems für elektrochemische Messungen durch den funktionalen Einbau des Ionentransporters Valinomycin unter Beweis gestellt.

Induction of RAGE shedding by activation of G-protein-coupled receptors

The multiligand Receptor for Advanced Glycation End products (RAGE) is involved in various pathophysiological processes, including diabetic inflammatory conditions and Alzheimers disease. Full-length RAGE, a cell surface-located type I membrane protein, can proteolytically be converted by metalloproteinases ADAM10 and MMP9 into a soluble RAGE form. Moreover, administration of recombinant soluble RAGE suppresses activation of cell surface-located RAGE by trapping RAGE ligands. Therefore stimulation of RAGE shedding might have a therapeutic value regarding inflammatory diseases. We aimed to investigate whether RAGE shedding is inducible via ligand-induced activation of G protein-coupled receptors (GPCRs). We chose three different GPCRs coupled to distinct signaling cascades: the V2 vasopressin receptor (V2R) activating adenylyl cyclase, the oxytocin receptor (OTR) linked to phospholipase Cβ, and the PACAP receptor (subtype PAC1) coupled to adenylyl cyclase, phospholipase Cβ, calcium signaling and MAP kinases. We generated HEK cell lines stably coexpressing an individual GPCR and full-length RAGE and then investigated GPCR ligand-induced activation of RAGE shedding. We found metalloproteinase-mediated RAGE shedding on the cell surface to be inducible via ligand-specific activation of all analyzed GPCRs. By using specific inhibitors we have identified Ca2+ signaling, PKCα/PKCβI, CaMKII, PI3 kinases and MAP kinases to be involved in PAC1 receptor-induced RAGE shedding. We detected an induction of calcium signaling in all our cell lines coexpressing RAGE and different GPCRs after agonist treatment. However, we did not disclose a contribution of adenylyl cyclase in RAGE shedding induction. Furthermore, by using a selective metalloproteinase inhibitor and siRNAmediated knock-down approaches, we show that ADAM10 and/or MMP9 are playing important roles in constitutive and PACAP-induced RAGE shedding. We also found that treatment of mice with PACAP increases the amount of soluble RAGE in the mouse lung. Our findings suggest that pharmacological stimulation of RAGE shedding might open alternative treatment strategies for Alzheimers disease and diabetes-induced inflammation.

Biologischer Lichtsammler (LHCII) für Halbleiternanokristalle (Quantum Dots)

Der light harvesting complex II (LHCII) ist ein pflanzliches Membranprotein, das in seiner trimeren Form über 40 Chlorophylle bindet. In der Pflanze kann er besonders effizient Licht sammeln und die Anregungsenergie anschließend fast verlustfrei über andere chlorophyll-bindende Proteine an die Reaktionszentren weiterleiten. Aufgrund dieser besonderen Eigenschaften war es ein Ziel dieser Arbeit, rekombinanten LHCII mit synthetischen Komponenten zu kombinieren, die zur Ladungstrennung befähigt sind. Zu diesem Zweck wurden unter anderem Halbleiternanokristalle (Quantum Dots, QDs) ausgewählt, die je nach Zusammensetzung sowohl als Energieakzeptoren als auch als Energiedonoren in Frage kamen. Durch Optimierung des Puffers gelang es, die Fluoreszenzquantenausbeute der QDs in wässriger Lösung zu erhöhen und zu stabilisieren, so dass die Grundvoraussetzungen für die spektroskopische Untersuchung verschiedener LHCII-QD-Hybridkomplexe erfüllt waren.rnUnter Verwendung bereits etablierter Affinitätssequenzen zur Bindung des LHCII an die QDs konnte gezeigt werden, dass die in dieser Arbeit verwendeten Typ-I QDs aus CdSe und ZnS sich kaum als Energie-Donoren für den LHCII eignen. Ein Hauptgrund lag im vergleichsweise kleinen Försterradius R0 von 4,1 nm. Im Gegensatz dazu wurde ein R0 von 6,4 nm für den LHCII als Donor und Typ-II QDs aus CdTe, CdSe und ZnS als Akzeptor errechnet, wodurch in diesem System eine höhere Effizienz des Energietransfers zu erwarten war. Fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen von Hybridkomplexen aus LHCII und Typ-II QDs ergaben eine hohe Plausibilität für einen Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) vom Lichtsammler auf die QDs. Weitere QD-Affinitätssequenzen für den LHCII wurden identifiziert und deren Bindekonstanten ermittelt. Versuche mit dem Elektronenakzeptor Methylviologen lieferten gute Hinweise auf eine LHCII-sensibilisierte Ladungstrennung der Typ-II QDs, auch wenn dies noch anhand alternativer Messmethoden wie z.B. durch transiente Absorptionsspektroskopie bestätigt werden muss. rnEin weiteres Ziel war die Verwendung von LHCII als Lichtsammler in dye-sensitized solar cells (DSSC). Geeignete dotierte TiO2-Platten wurden ermittelt, das Verfahren zur Belegung der Platten optimiert und daher mit wenig Aufwand eine hohe LHCII-Belegungsdichte erzielt. Erste Messungen von Aktionsspektren mit LHCII und einem zur Ladungstrennung fähigen Rylenfarbstoff zeigen eine, wenn auch geringe, LHCII sensibilisierte Ladungstrennung. rnDie Verwendung von Lanthanide-Binding-Tags (LBTs) ist ein potentielles Verfahren zur in vivo-Markierung von Proteinen mit Lanthanoiden wie Europium und Terbium. Diese Metalle besitzen eine überdurchschnittlich lange Lumineszenzlebensdauer, so dass sie leicht von anderen fluoreszierenden Molekülen unterschieden werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang es, eine LBT in rekombinanten LHCII einzubauen und einen Lumineszenz Resonanz Energietransfer (LRET) vom Europium auf den LHCII nachzuweisen.rn

Glukose-konjugierte Hemmstoffe als Strategie der gezielten Hemmung des DNA-Reparaturproteins O 6 -Methylguanin-DNA-Methyltransferase in Tumorzellen und der Einfluss von ATP-binding cassette Transportern

Das DNA-Reparaturprotein O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase [MGMT] ist der Hauptresistenzfaktor gegenüber der zytotoxischen Wirkung von SN1-alkylierenden Zytostatika in der Tumortherapie. Die Verwendung der MGMT-Hemmstoffe O6-Benzylguanin [O6BG] und O6-(4-Bromothenyl)guanin [O6BTG] führte zu einer Sensibilisierung des Normalgewebes, was eine Dosis-Reduktion der Zytostatika erforderlich machte und die erhoffte Therapieverbesserung verhinderte. Aus diesem Grund ist eine Strategie der selektiven Hemmung des MGMT-Proteins (Targeting-Strategie) erforderlich, um die systemische Toxizität in der Kombinationsbehandlung zu reduzieren. In dieser Arbeit wurde die Anwendbarkeit der Glukose-Konjugation als Targeting-Strategie untersucht, da Tumorzellen einen erhöhten Glukoseverbrauch aufweisen und demzufolge Glukosetransporter überexprimieren. Die Glukose-Konjugate O6BG-Glu und O6BTG-Glu inhibierten MGMT in Tumorzellen und sensibilisierten die Zellen gegenüber den alkylierenden Agenzien Temozolomid [TMZ] und Lomustin [CCNU]. Des Weiteren inaktivierten die Glukose-Konjugate die MGMT-Aktivität im Tumor eines Xenograft-Mausmodells und reduzierten das Tumorwachstum nach einer TMZ-Behandlung im gleichen Ausmass wie die Inhibitoren O6BG und O6BTG. Trotzdem war auch mit den Glukose-Konjugaten keine Steigerung der Zytostatika-Dosis im Mausmodell möglich. Die Untersuchungen der Aufnahme von O6BG-Glu und O6BTG-Glu wiederlegten eine Involvierung der Glukosetransporter. Der Einsatz von spezifischen Glukosetransporter-Inhibitoren und Kompetitions-Experimenten führte zu keiner Verminderung der MGMT-Hemmung oder Aufnahme vom radioaktiven H3-O6BTG-Glu in die Zelle. Dies legt nahe, dass die Glukose-Konjugate über einen unspezifischen Mechanismus (aktiv) in die Zellen gelangen. Der Grund für eine mögliche unselektive Aufnahme könnte im hydrophoben Alkyllinker, der für die Konjugation des Glukosemoleküls verwendet wurde, begründet sein. Dies führt zur Generierung von amphipathischen Konjugaten, die eine initiale Bindung an die Plasmamembran aufweisen und eine Aufnahme über den Flip-Flop-Mechanismus (transbilayer transport) wahrscheinlich machen. Die amphipathische Molekülstruktur der Glukose-Konjugate führte zu einer Partikelbildung in wässrigen Lösungen, die eine Reduktion der Menge an aktiven Monomeren von O6BG-Glu und O6BTG-Glu bewirken, die zur Hemmung von MGMT zur Verfügung stehen. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Rolle von ABC-Transportern hinsichtlich einer Targeting-Strategie von MGMT-Hemmstoffen. Obwohl eine hohe Expression dieser ABC-Transporter in Tumoren zur Resistenzentwicklung gegenüber Zytostatika führt, wurde ihr Einfluss auf MGMT-Hemmstoffe oder einer MGMT-Targeting-Strategie niemals untersucht. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal ein aktiver Efflux von MGMT-Hemmstoffen durch ABC-Transporter nachgewiesen. Die Inhibition von ABC-Transportern bewirkte eine schnellere Inaktivierung von MGMT durch die Glukose-Konjugate. Des Weiteren zeigten Kompetitions-Experimente mit den MGMT-Hemmstoffen eine verminderte Efflux-Rate von Fluoreszenzfarbstoffen, die spezifisch von ABC-Transportern exportiert werden. ABC-Transporter reduzieren die wirksame Konzentration des Hemmstoffes in der Zelle und beeinträchtigen somit die Effektivität der MGMT-Inhibition. Eine simultane Hemmung der ABC-Transporter P-glycoprotein (P-gp), multi resistance protein 1 (MRP1) and breast cancer resistance protein (BCRP) erhöhte die Effektivität der MGMT-Hemmstoffe (O6BG, O6BTG, O6BG-Glu, O6BTG-Glu) und verstärkte auf diese Weise die TMZ-induzierte Toxizität in Tumorzelllinien. Die Involvierung von ABC-Transportern in der intrazellulären Speicherung von MGMT-Hemmstoffen ist wahrscheinlich die Ursache für die beobachteten Unterschiede in der Sensibilisierung verschiedener Tumorzelllinien gegenüber Zytostatika durch das Glukose-Konjugat O6BG-Glu. Eine Strategie, den Einfluss von ABC-Transportern zu reduzieren und zukünftliche MGMT-Targeting-Strategien effizienter umzusetzen, ist die Verwendung von O6BTG als Ausgangssubstanz. Die höhere Inhibitionsfähigkeit der Bromthiophenmoleküle vermindert die erforderliche intrazelluläre Konzentration für eine vollständige MGMT-Hemmung und reduziert auf diese Weise den Einfluss von ABC-Transportern.

Biochemische Untersuchungen des Lichtsammlerprotein (LHCP) im Komplex mit seinem Chaperon, dem plastidären Signalerkennungspartikel cpSRP

Das Lichtsammlerprotein (light harvesting chlorophyll a/b-binding protein, LHCP) ist das Apoprotein des Haupt-Lichtsammelkomplexes (LHCII) und stellt das häufigste Membranprotein der Erde dar. Nicht nur aufgrund seiner Abundanz, sondern auch wegen seiner speziellen Translokation als stark hydrophobes Membranprotein durch hauptsächlich wässrige Milieus von cytosolischen Ribosomen bis in die Thylakoidmembran der Chloroplasten ist der Biogeneseweg dieses Proteins von besonderem Interesse. LHCP ist kernkodiert und wird nach seinem Import in Chloroplasten als Transitkomplex mit dem stromalen Signalerkennungsprotein (cpSRP) zur Thylakoide geleitet. Der cpSRP-Komplex besteht aus dem cpSRP43 mit Chaperonfunktion für das LHCP sowie dem Co-Chaperon cpSRP54, welches eine entscheidende Rolle in der stromalen Zielführung des Transitkomplexes spielt. Sowohl die Proteinkonformation des LHCP während seiner Biogenese als auch der in vivo Faltungsablauf während der Thylakoidinsertion sind noch völlig unklar. Mithilfe der Elektronen-paramagnetischen Resonanz (EPR-)Spektroskopie sollte in dieser Arbeit der Faltungszustand des LHCP im Transitkomplex mit dem cpSRP oder in Teilkomplexen davon ermittelt werden.rnKopplungen von cpSRP43 und LHCP bestätigten, dass das Chaperon als Minimaleinheit zur quantitativen Solubilisierung des Membranproteins genügt. Gelfiltrationschromatographische (GFC-) Untersuchungen solcher Komplexe wiesen jedoch mit einem apparenten MW von ≥ 600 kDa ein sehr hochmolekulares Laufverhalten auf. Variierende Proteinstöchiometrien im Komplex zeigten in densitometrischen Auswertungen eine undefinierte Aggregation. Zusätze von Agenzien zur Vermeidung unspezifischer Wechselwirkungen wie z.B. Detergentien oder auch Salzzugabe zeigten keinen Einfluss auf die Aggregate. Volllängen-Transitkomplexe dagegen wiesen trotz unterschiedlichem Angebot von Einzelproteinen reproduzierbar definierte Stöchiometrien auf. Diese zeigten eine LHCP:cpSRP43-Stöchiometrie von 1,25. Dennoch hatten diese Komplexe mit einem apparenten MW von > 300 kDa einen mindestens dimeren Assemblierungsgrad. Eine Voraussetzung für eindeutige EPR-spektroskopische Distanzmessungen zwischen definierten Positionen im LHCP ist jedoch dessen monomolekularisiertes Vorliegen im Chaperonkomplex. Die Darstellung von ternären Transitkomplexen mit einem zu erwartenden apparenten MW von ~175 kDa war auch durch Zusatz verschiedener Proteinaggregationshemmer nicht möglich. Transitkomplexe mit einer verkürzten Version des cpSRP54 zeigten schließlich eine definierte 1:1-Komplexstöchiometrie bei gleichzeitiger polydisperser Komplexzusammensetzung. Es konnten ~60% dieser sogenannten 54M-Transitkomplexe nach GFC-Daten und densitometrischer Auswertung als potentiell ternär eingeschätzt werden. Darüber hinaus gelang es solche Ansätze durch GFC-Fraktionierung zusätzlich von oligomerisierten Spezies aufzureinigen. Dennoch zeigten die Präparate vor GFC-Fraktionierung ein (noch) zu hohes Aggregationssignal im Hintergrund und nach Fraktionierung ein zu schwaches Signal, um eine eindeutige Aussage der EPR-Daten zuzulassen. Dennoch bietet dieses ausgearbeitete Komplexbildungsprotoll in Verbindung mit der Verwendung von verkürztem cpSRP54 eine solide Basis, um weitere Versuche zu EPR-Messungen an cpSRP-gebundenem LHCP durchzuführen. rn

Eigenschaften heterotypisch interagierender Transmembranhelices ermittelt durch den Einsatz einer kombinatorischen DNS-Bibliothek

Membranproteine sind für Medizin und Forschung von großer Bedeutung. Allerdings gestaltet sich die Forschung an diesen Proteinen oft umständlich und schwierig. Da Membranproteine nur in geringem Maße wasserlöslich sind, können konventionelle biochemische Methoden zur Proteinanalyse nur begrenzt Anwendung finden. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein Reportersystem entwickelt, das zur Analyse von transmembranen Proteinen eingesetzt werden kann. Das System ermöglicht die Untersuchung von Interaktionstendenzen transmembraner, helicaler Proteinelemente in der biologischen Membran des Bakteriums Escherichia coli. Interaktionen transmembraner α-Helices sind bei der Signalweiterleitung über die zelluläre Membran von Bedeutung. So spielt beispielsweise bei vielen membranständigen Rezeptoren die Zusammenlagerung von einzelnen Einheiten zu Oligomeren für den Informationsfluss eine wichtige Rolle. Auch für die Faltung von Membranproteinen sind Interaktionen transmembraner α-Helices relevant. rnEine Validierung des Reportersystems wurde durch gezielte Untersuchungen an dem bakteriellen Aquaglyceroporin GlpF vorgenommen. Bereits vorliegende Strukturdaten für GlpF ließen eine Interaktion der Helices 1 und 2 sowie 1 und 4 des Kanals vermuten, was mit Hilfe des entwickelten Reportersystems bestätigt werden konnte. Eine moderate Interaktionstendenz konnte für beide Helix-Helix-Paarungen festgestellt werden. In der weiterführenden Anwendung des Systems wurden die Eigenschaften der Helix-Helix-Kontaktfläche von heterotypisch interagierenden Transmembranhelices in Bezug auf deren Aminosäurekomposition betrachtet. Dazu wurde zunächst eine auf Plasmiden basierende, kombinatorische DNS-Bibliothek angelegt, die für transmembrane Helices mit zufällig auftretenden Aminosäureresten codierte. Die Anordnung der variablen Seitenketten erfolgte so, dass in Verbindung mit dem Reportersystem eine Helix-Helix-Kontaktfläche randomisierter Aminosäurereste generiert wurde. Um Paare interagierender Helices zu erhalten, wurde ein Selektionsdruck auf E. coli-Zellen erzeugt, in denen die Expression der Transmembranhelices erfolgte. Nur in Zellen mit interagierenden Helices kam es zu einer Aktivierung von Stoffwechselgenen, die das Wachstum in einem Minimalmedium gestattete. Infolge konnten Aminosäurereste und Interaktionsmotive identifiziert werden, die für heterotypische Interaktionen von α-Helices in Membranen eine bedeutende Rolle spielen. Den höchsten Grad an Überrepräsentation an der Helix-Helix-Kontaktfläche zeigten Glycinseitenketten. Weiterhin überrepräsentiert waren Phenylalanin-, Cystein- und Alaninreste. Auch zeigte sich sowohl die Bedeutung des aus dem humanen Glycophorin A (GpA) bekannten Aminosäure-Sequenzmotivs GxxxG, als auch die des Interaktionsmotivs [klein]xxx[klein], in dem Glycin-, Alanin- oder Serinreste in Positionen getrennt durch drei unbestimmte Seitenketten enthalten sind. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass bei der Ausbildung eines Helix-Helix-Dimers bestimmte Seitenketten häufiger als andere helixübergreifend in geringer Distanz zueinander auftraten. Hierbei hob sich in besonderem Maße die Paarung Glycin/Glycin hervor. Auch konnten die Paarungen Glycin/Cystein und Phenylalanin/Phenylalanin häufig vorgefunden werden. Darüber hinaus weist das häufige Auftreten von Glycinresten in geringer Distanz auf ein neuartiges Interaktionsmotiv hin. Anders als beim GxxxG-Motiv sind hierbei zwei Glycinreste nicht innerhalb einer Helix, sondern in zwei verschiedenen, interagierenden Transmembranhelices in geringem Abstand zueinander lokalisiert. Die Anwesenheit dieser kurzen Seitenketten in bestimmten Positionen könnte, ähnlich wie das GxxxG-Motiv, den Abstand zweier Helices zueinander verringern und so interhelicale Wechselwirkungen anderer Seitenketten begünstigen.