Isolation and identification of molecular partners of the proteins encoded by the Drosophila tumor suppressor gene lethal(2)tumorous imaginal discs

Ziel dieser Arbeit war es, die funktionelle Bedeutung des Drosophila melanogaster tumor suppressor Gens lethal(2)tumorous imaginal discs (l(2)tid) durch die Identifikation von molekularen Partnern der vom Gen kodierten Proteine zu etablieren. Mit dem Screening einer Expressionsbibliothek mittels des Hefe-Di-Hybrid-Systems wurde das Protein Patched (Ptc) als ein neues Tid-bindendes Protein identifiziert. Ptc ist ein Zentralregulator der Hedhehog-Signalkette. Diese ist in der Entwicklung konserviert und in manchen humanen Krebsarten verwickelt. Die Tid/Ptc-Interaktion wurde mittels unabhängigen biochemischen Methoden wie dem GST-pulldown-Test oder der Immunopräzipitation überprüft. Außerdem ergaben funktionelle Studien in tumorosen Imaginalscheiben einen möglichen inhibitorischen Effekt von Tid über die Hh Signaltransduktion.Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen Tid und dem E-APC-Protein (Adenomatous polyposis coli) bewiesen. Polakis und seine Gruppe zeigten durch Studien mit dem Hefe-Di-Hybrid-System und in vitro, dass das hTid mit dem APC-Protein interagiert. Um dies auch auf Drosophila-Ebene zu überprüfen, wurden Immunopräzipitation-Studien mit den Drosophila-Gegenstücken durchgeführt. Diese Studien zeigen zum ersten Mal eine direkte Interaktion beider Proteine in vivo.

A molecular dynamics study of the influence of chain branching on the properties of polymer systems

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluß von Kettenverzweigungen unterschiedlicher Topologien auf die statischen Eigenschaften von Polymeren. Diese Untersuchungen werden mit Hilfe von Monte-Carlo- und Molekular-Dynamik-Simulationen durchgeführt.Zunächst werden einige theoretische Konzepte und Modelle eingeführt, welche die Beschreibung von Polymerketten auf mesoskopischen Längenskalen gestatten. Es werden wichtige Bestimmungsgrößen eingeführt und erläutert, welche zur quantitativen Charakterisierung von Verzweigungsstrukturen bei Polymeren geeignet sind. Es wird ebenso auf die verwendeten Optimierungstechniken eingegangen, die bei der Implementierung des Computerprogrammes Verwendung fanden. Untersucht werden neben linearen Polymerketten unterschiedliche Topolgien -Sternpolymere mit variabler Armzahl, Übergang von Sternpolymeren zu linearen Polymeren, Ketten mit variabler Zahl von Seitenketten, reguläre Dendrimere und hyperverzweigte Strukturen - in Abhängigkeit von der Lösungsmittelqualität. Es wird zunächst eine gründliche Analyse des verwendeten Simulationsmodells an sehr langen linearen Einzelketten vorgenommen. Die Skalierungseigenschaften der linearen Ketten werden untersucht in dem gesamten Lösungsmittelbereich vom guten Lösungsmittel bis hin zu weitgehend kollabierten Ketten im schlechten Lösungsmittel. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Bestätigung der Korrekturen zum Skalenverhalten des hydrodynamischen Radius Rh. Dieses Ergebnis war möglich aufgrund der großen gewählten Kettenlängen und der hohen Qualität der erhaltenen Daten in dieser Arbeit, insbesondere bei den linearen ketten, und es steht im Widerspruch zu vielen bisherigen Simulations-Studien und experimentellen Arbeiten. Diese Korrekturen zum Skalenverhalten wurden nicht nur für die linearen Ketten, sondern auch für Sternpolymere mit unterchiedlicher Armzahl gezeigt. Für lineare Ketten wird der Einfluß von Polydispersität untersucht.Es wird gezeigt, daß eine eindeutige Abbildung von Längenskalen zwischen Simulationsmodell und Experiment nicht möglich ist, da die zu diesem Zweck verwendete dimensionslose Größe eine zu schwache Abhängigkeit von der Polymerisation der Ketten besitzt. Ein Vergleich von Simulationsdaten mit industriellem Low-Density-Polyäthylen(LDPE) zeigt, daß LDPE in Form von stark verzweigten Ketten vorliegt.Für reguläre Dendrimere konnte ein hochgradiges Zurückfalten der Arme in die innere Kernregion nachgewiesen werden.

Molecular cloning, heterologous expression and characterization of Strictosidine Glucosidase from Rauvolfia serpentina cell suspension cultures

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die enzymatische Deglucosylierung von Strictosidin in Zellsuspensionskulturen von Rauvolfia serpentina zu charakterisieren.Ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Strictosidin aus pflanzlicher Zellkulturen wurde entwickelt. Zwei somatische Hybridzellkulturen zwischen R. serpentina und Rhazya stricta wurden als potenzielle Quelle dieses Glucoalkaloides untersucht. Der Sekundärstoffwechsel der pflanzlichen Zellen wurde mit Methyljasmonat induziert und 15 Stoffe wurden identifiziert, u. a. das neue Indolalkaloid 3-Oxo-rhazinilam. Die Gehaltsänderung von 7 Indolalkaloiden nach Behandlung mit Methyljasmonat wurde untersucht.Deglucosylierung von Strictisidin bei in E. coli exprimierter Raucaffricin Glucosidase wurde detektiert.Die Strictosidin Glucosidase kodierende cDNA wurde aus R. serpentina Zellsuspensionskulturen cloniert und in E. coli exprimiert. Das Enzyme wurde mit Hilfe des Inteintages gereinigt und seine Eigenschaften wurden untersucht, u. a. optimale Temperatur und pH Wert und Substratspezifität.Die Produkte von der enzymatischen Strictosidinhydrolyse wurden als Cathenamin (unter normalen Bedingungen) und Sitsirikin und Isositsirikin (im Gegenwart von Reduktoren) identifiziert. Das neue Indolalkaloid 3-Isocorreantin A wurde nach der enzymatischen Deglucosylierung von Dolichantosid (Nß-Methylstrictosidin) gebildet.

Novel isolates of Cydia pomonella granulovirus (CpGV): deciphering the molecular mechanism for overcoming CpGV resistance in codling moth (Cydia pomonella)

During the last twenty years, Cydia pomonolla granulovirus (CpGV, Baculoviridae) has become the most important biological control agent for the codling moth (CM) in organic and integrated apple production. All registered products in Europe are based on the isolate CpGV-M, which was discovered 1964 in Mexico. A serious threat to future application of CpGV is the occurrence of CM field populations resistant to CpGV. Since 2003, populations with up to 10,000-fold reduced susceptibility were reported from orchards in Germany, France, Italy, Switzerland, Austria and the Netherlands. A putative alternative to CpGV-M are novel CpGV isolates which are able to overcome CM resistance. This thesis focuses on the identification and characterisation of resistance overcoming CpGV isolates and the analysis of their molecular difference to CpGV-M.rnSixteen CpGV isolates were tested against CM lab strains in bioassays. Hereby, five isolates were identified which were able to completely overcome resistance. The genomes of these isolates were compared to CpGV-M by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. To identify the molecular factor responsible for improved virulence of some CpGV isolates, major genomic differences were sequenced and analysed. A 0.7 kb insertion was found in CpGV-I01, -I12 and -E2, but not in other resistance overcoming isolates. Analysis of the insertions sequence revealed that it might be due to a transposition event, but not involved in overcoming resistance. rnFor unequivocal identification of CpGV isolates, a new method based on molecular analysis was established. Partial sequencing of the conserved polyhedrin/granulin (polh/gran), late expression factor-8 (lef-8) and late expression factor-9 (lef-9) genes revealed single nucleotide polymorphisms (SNPs). SNP analysis correlated with the grouping obtained by RFLP analysis. A phylogenetic classification due to different genome types A-E is proposed. Phylogenetic analysis suggested that CpGV-M was the phylogenetically youngest of the tested CpGV isolates.rnWhole genome sequencing of two resistance overcoming isolates CpGV-I12 (type D genome) and -S (type E genome) and CpGV-M (type A genome) was performed. Comparison of the three genomes revealed a high sequence identity. Several insertions and deletions ranging from 1-700 nucleotides (nt) were found. Comparison on open reading frame (ORF) level revealed that CpGV-I12 and -S shared only one protein alteration when compared to CpGV-M: a stretch of 24 nt present in ORF cp24 was not found in any of the resistance overcoming isolates. Cp24 codes for the early gene pe38. Combined with the results of phylogenetic analysis, it is proposed that these 24 nt are a recent insertion into the CpGV-M genome. The role of pe38 in overcoming resistance was investigated by knocking out pe38 of a CpGV-M based bacmid and swapping of CpGV-I12 pe38 of into the k.o. bacmid. When pe38 of CpGV-I12 was inserted into the k.o. bacmid, the infectivity could not be rescued, suggesting that the genomic portion of pe38 might play a role in its function.rnIt can be concluded that the recently observed CpGV resistance in CM is only related to type A genomes. RFLP and SNP analysis provide tools for identifying and characterising different CpGV isolates reliably, a pre-condition for a future registration of CpGV products based on novel CpGV isolates.rnrnrn

Molecular dynamics simulations of sheared brush-like systems

Mit Hilfe von Molekulardynamik-Simulationen untersuchen wir bürstenartige Systeme unter guten Lösungsmittelbedingungen. Diese Systeme sind, dank ihren vielfältigen Beschaffenheiten, die von Molekularparametern und äußeren Bedingungen abhängig sind, wichtig für viele industrielle Anwendungen. Man vermutet, dass die Polymerbürsten eine entscheidende Rolle in der Natur wegen ihrer einzigartigen Gleiteigenschaften spielen. Ein vergröbertes Modell wird verwendet, um die strukturellen und dynamischen Eigenschaften zweier hochkomprimierter Polymerbürsten, die eine niedrige Reibung aufweisen, zu untersuchen. Allerdings sind die Lubrikationseigenschaften dieser Systeme, die in vielen biologischen Systemen vorhanden sind, beeinflußt. Wir untersuchen so-genannte "weiche Kolloide", die zwischen den beiden Polymerbürsten eingebettet sind, und wie diese Makroobjekte auf die Polymerbürsten wirken.rnrnNicht-Gleichgewichts-Molekulardynamik-Simulationen werden durchgeführt, in denen die hydrodynamischen Wechselwirkungen durch die Anwendung des DPD-Thermostaten mit expliziten Lösungsmittelmolekülen berücksichtigt werden. Wir zeigen, dass die Kenntnis der Gleichgewichtseigenschaften des Systems erlaubt, dynamische Nichtgleichgewichtsigenschaften der Doppelschicht vorherzusagen.rnrnWir untersuchen, wie die effektive Wechselwirkung zwischen kolloidalen Einschlüßen durch die Anwesenheit der Bürsten (in Abhängigkeit der Weichheit der Kolloide und der Pfropfdichte der Bürsten) beeinflußt wird. Als nächsten Schritt untersuchen wir die rheologische Antwort von solchen komplexen Doppelschichten auf Scherung. Wir entwickeln eine Skalen-Theorie, die die Abhängigkeit der makroskopischen Transporteigenschaften und der lateralen Ausdehnung der verankerten Ketten von der Weissenberg Zahl oberhalb des Bereichs, in dem die lineare Antwort-Theorie gilt, voraussagt. Die Vorhersagen der Theorie stimmen gut mit unseren und früheren numerischen Ergebnissen und neuen Experimenten überein. Unsere Theorie bietet die Möglichkeit, die Relaxationszeit der Doppelschicht zu berechnen. Wenn diese Zeit mit einer charakteristischen Längenskala kombiniert wird, kann auch das ''transiente'' (nicht-stationäre) Verhalten beschrieben werden.rnrnrnWir untersuchen die Antwort des Drucktensors und die Deformation der Bürsten während der Scherinvertierung für grosse Weissenberg Zahlen. Wir entwickeln eine Vorhersage für die charakteristische Zeit, nach der das System wieder den stationären Zustand erreicht.rnrnrnElektrostatik spielt eine bedeutende Rolle in vielen biologischen Prozessen. Die Lubrikationseigenschaften der Polymerbürsten werden durch die Anwesenheit langreichweitiger Wechselwirkungen stark beeinflusst. Für unterschiedliche Stärken der elektrostatischen Wechselwirkungen untersuchen wir rheologische Eigenschaften der Doppelschicht und vergleichen mit neutralen Systemen. Wir studieren den kontinuierlichen Übergang der Systemeigenschaften von neutralen zu stark geladenen Bürsten durch Variation der Bjerrumlänge und der Ladungsdichte.

The calcite(10-14) surface: a versatile substrate for molecular self-assembly

This thesis presents a detailed and successful study of molecular self-assembly on the calcite CaCO3(10-14) surface. One reason for the superior applicability of this particular surface is given by reflecting the well-known growth modes. Layer-by-layer growth, which is a necessity for the formation of templated two-dimensional (2D) molecular structures, is particularly favoured on substrates with a high surface energy. The CaCO3(10-14) surface is among those substrates and, thus, most promising. rnrnAll experiments in this thesis were performed using the non-contact atomic force microscope (NC-AFM) under ultra-high vacuum conditions. The acquisition of drift-free data became in this thesis possible owing to the herein newly developed atom-tracking system. This system features a lateral tip-positioning precision of at least 50pm. Furthermore, a newly developed scan protocol was implemented in this system, which allows for the acquisition of dense three-dimensional (3D) data under room-temperature conditions. An entire 3D data set from a CaCO3(10-14) surface consisting of 85x85x500 pixel is discussed. rnrnThe row-pairing and (2x1) reconstructions of the CaCO3(10-14) surface constitute most interesting research subjects. For both reconstructions, the NC-AFM imaging was classified to a total of 12 contrast modes. Eight of these modes were observed within this thesis, some of them for the first time. Together with literature findings, a total of 10 modes has been observed experimentally to this day. Some contrast modes presented themselves as highly distance-dependent and at least for one contrast mode, a severe tip-termination influence was found. rnrnMost interestingly, the row-pairing reconstruction was found to break a symmetry element of the CaCO3(10-14) surface. With the presence of this reconstruction, the calcite (10-14) surface becomes chiral. From high-resolution NC-AFM data, the identification of the enantiomers is here possible and is presented for one enantiomer in this thesis. rnrnFive studies of self-assembled molecular structures on calcite (10-14) surfaces are presented. Only for one system, namely HBC/CaCO3(10-14), the formation of a molecular bulk structure was observed. This well-known occurence of weak molecule-insulator interaction hinders the investigation of two-dimensional molecular self-assembly. It was, however, possible to force the formation of an island phase for this system upon following a variable-temperature preparation. rnFor the C60/CaCO3(10-14) system it is most notably that no branched island morphologies were found. Instead, the first C60 layer appeared to wet the calcite surface. rnrnIn all studies, the molecules arranged themselves in ordered superstructures. A templating effect due to the underlying calcite substrate was evident for all systems. This templating strikingly led either to the formation of large commensurate superstructures, such as (2x15) with a 14 molecule basis for the C60/CaCO3(10-14) system, or prevented the vast growth of incommensurate molecular motifs, such as the chicken-wire structure in the trimesic acid (TMA)/CaCO3(10-14) system. rnrnThe molecule-molecule and the molecule-substrate interaction was increased upon choosing molecules with carboxylic acid moieties in the third, fourth and fifth study, using terephthalic acid, TMA and helicene molecules. In all these experiments, hydrogen-bonded assemblies were created. rnrnDirected hydrogen bond formation combined with intermolecular pi-pi interaction is employed in the fifth study, where the formation of uni-directional molecular "wires" from single helicene molecules succeeded. Each "wire" is composed of heterochiral helicene pairs, well-aligned along the [01-10] substrate direction and stabilised by pi-pi interaction.

Gespeicherte Ionen in der Paulfalle: Voruntersuchungen zur Lebensdauermessung des metastabilen 6D-3/2-Zustands des 226 Ra +, Speichereigenschaften von 138 Ba + und 28 N 2 + bei Variation des Puffergasdrucks

Auf Paulfallen basierende Experimente spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen Bereichen der Physik, z.B. der Atomphysik zum Test theoretischer Modelle und der Massenspektroskopie. Die vorliegende Arbeit widmet sich beiden Themengebieten und gliedert sich entsprechend in zwei Teilbereiche: 1) Erdalkali-Ionen sind aufgrund ihrer Energieniveaus optimale Kandidaten für Laserspektroskopie-Experimente mit Ionenfallen und bestens geeignet, um mittels der spektroskopischen Daten die theoretischen Modelle zu testen. Lediglich für Ra+ fehlen bislang als einzigem Erdalkali-Ion diese Daten wie z.B. die Lebensdauern der metastabilen Niveaus. Diese wären auch von Interesse für bereits geplante Radium-Experimente zur Paritätsverletzung. Im ersten Teil dieser Arbeit wird der Aufbau eines Laser-Paulfallenexperiments zur Messung der Lebensdauer des 6D3/2 Zustands von 226Ra+ dokumentiert und es werden Testmessungen mit 138Ba+ vorgestellt. 2) Für die Verwendung der Paulfalle in der Massenspektroskopie und zur Analyse von Reaktionsprodukten ist die Kenntnis der Lage der im Speicherbereich auftretenden nichtlinearen Resonanzen wesentlich, ebenso wie deren Veränderung durch Dämpfung und Raumladung. Im zweiten Teil dieser Arbeit werden detaillierte Untersuchungen der Speicherung großer puffergasgekühlter Ionenwolken an zwei unterschiedlichen Paulfallen-Experimenten vorgestellt. Am ersten wurden 138Ba+-Ionenwolken kontinuierlich durch Laserspektroskopie bzw. über einen elektronischen Nachweis beobachtet, während das zweite N2+-Molekülionen automatisiert destruktiv nachwies. Am N2+-Experiment wurden zwei hochaufgelöste Messungen des ersten Speicherbereichs durchgeführt, die erstmals eine direkte Überprüfung der theoretisch berechneten Verläufe der Resonanzen mit experimentellen Daten erlauben. Die Nachweiseichung ermöglichte dabei zum ersten Mal die Angabe absoluter Ionenzahlen. Im Gegensatz zu vergleichbaren früheren Messungen wurden hierbei die sich überlagernden Speicherbereiche von 4 simultan gespeicherten Ionensorten beobachtet und zur Analyse der Resonanzen herangezogen. Die nichtlinearen Resonanzen wurden untersucht bei Variation von Puffergasdruck und Ionenzahl, wobei kollektive Resonanzen ohne zusätzliche externe Anregung beobachtet wurden. Die gemessenen Raumladungsverschiebungen wurden mit theoretischen Modellen verglichen. Bei Variation des Puffergasdrucks wurde mit Bariumionen die räumliche Ausdehnung der Ionenwolke gemessen und mit Stickstoffionen die Verschiebung des Punktes optimaler Speicherung bestimmt. Dabei wurde festgestellt, daß der zum Ioneneinfang optimale Puffergasdruck kleiner ist als der, bei dem die längsten Speicherdauern erzielt werden. Mit gespeicherten N2+-Ionen wurde die Position extern angeregter kollektiver und individueller Resonanzen im Frequenzspektrum bei Änderung der Parameter Ionenzahl, Puffergasdruck und Dauer der Anregung untersucht, ebenso wie die Resonanzform, die mit theoretischen Linienformen verglichen wurde. Bei Änderung der Fallenparameter wurden verstärkende Effekte zwischen nahen kollektiven Resonanzen festgestellt. Die Beobachtung, welche der im Frequenzspektrum vorher identifizierten Bewegungs-Resonanzen sich bei Variation der Fallenparameter a bzw. q überlagern, ermöglicht eine bislang nicht beschriebene einfache Methode der Bestimmung von nichtlinearen Resonanzen im Stabilitätsdiagramm.

Identifizierung, Quantifizierung und Hemmung von ausgewählten Hefen im Wein

Hefen stellen einen großen und wichtigen Teil der Mikrobiota während der Weinbereitung dar, da ohne ihre alkoholische Fermentation die Umwandlung von Most und Wein nicht möglich wäre. Ferner ist es ihre Vielzahl an Stoffwechselprodukten, die dem Aroma des fertigen Weines eine zusätzliche Komplexität verleihen. Auf der anderen Seite steht durch den Metabolismus verschiedenster so genannter Wildhefen die Gefahr von Qualitätsabstufungen der Weine, was allgemein als „Weinfehler“ betrachtet wird. Ziel dieser Arbeit war zum einen die taxonomische Einordnung von Saccharomyces-Spezies, sowie die Quantifizierung und Hemmung von ausgewählten Wildhefen während der Weinbereitung.rnEin Teil dieser Arbeit umfasste die Identifizierung der nahverwandten Mitglieder der Saccharomyces sensu stricto-Gruppe. Durch den Einsatz des DNA-Fingerpinting-Systems SAPD-PCR konnten alle die Gruppe umfassenden Spezies anhand spezifischer Bandenmuster nachgewiesen werden, wodurch eine Einordnung dieser schwer zu differenzierenden Arten möglich war. Die Differenzierung zwischen den einzelnen Spezies war in jedem Fall deutlicher als dies die Sequenzierung der 5.8S rDNA und ihre flankierenden ITS-Regionen vermochte. Die SAPD-PCR zeichnete sich zudem durch eine geringe Muster-Varianz bei verschiedenen Stämmen einer Art aus und konnte zuverlässig unbekannte Stämme bestimmen und bereits hinterlegte Stämme neu klassifizieren. Zudem konnte mit Hilfe dieses Systems Hybride aus Saccharomyces cerevisiae und S. bayanus bzw. S. cerevisiae und S. kudriavzevii detektiert werden, wenn diese Hybride aus relativ gleichen genomischen Anteilen der Eltern bestanden. rnZusätzlich wurde ein quantitatives PCR-System entwickelt, um die Gattungen Saccharomyces, Hanseniaspora und Brettanomyces in Most und Wein detektieren und quantifizieren zu können. Die hierfür entwickelten Primer zeigten sich spezifisch für die untersuchten Arten. Durch die serielle Verdünnung definierter DNA-Mengen konnte für alle drei Systeme eine Kalibrierungskurve erstellt werden, mit Hilfe derer die tatsächlichen Quantifizierungen durchgeführt wurden. Die qPCR-Analyse lieferte ähnliche Zellzahlen wie Lebendzellzahl-Bestimmungen und wurde nicht von anderen Spezies und von Traubensaft gestört. Die maximal detektierbare Zellzahl betrug 2 x 107 Zellen/ml, während die minimale Detektionsgrenze je nach Art zwischen 1 x 102 Zellen/ml und 1 x 103 Zellen/ml lag. Allerdings konnte eine effektive DNA-Isolierung dieser geringen Zellzahlen nur erreicht werden, wenn die Zellzahl durch artfremde Hefen künstlich erhöht wurde. Die Analyse einer Most-Vergärung mit den drei Spezies zeigte schlussendlich, dass die quantitative PCR sicher und schnell Veränderungen und Sukzessionen detektiert und so ein geeignetes Mittel darstellt, um Populationsdynamiken während der Weinherstellung zu beobachten. rnDer letzte Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Inhibierung von Schadhefen durch zellwand-hydrolysierende Enzyme. Es konnte hierbei eine endoglykosidisch wirkende β-1,3-Glucanase aus dem Bakterium Delftia tsuruhatensis isoliert werden. Diese besaß eine ungefähre Masse von 28 kDa, einen isolektrischen Punkt von ca. 4,3 und wirkte mit einer spezifischen Aktivität von 10 U/mg Protein gegen das Glucan Laminarin. Zudem zeigte das Enzym ein Temperaturoptimum von 50 °C und ein pH-Optimum bei pH 4,0. Weinparameter wie erhöhte Konzentrationen an Ethanol, Phenolen und Sulfit beeinflussten die Wirkung des Enzyms nicht oder nur wenig. Neben der allgemeinen Wirkung gegen β-1,3-Glucane konnte hier auch gezeigt werden, dass ebenso gut die β-1,3-Glucane in der Zellwand verschiedener Hefen hydrolysiert wurden. Fluoreszenz- und rasterelektronen-mikroskopische Aufnahmen von Hefezellen nach Inkubation mit der β-1,3-Glucanase zeigten zusätzlich die Zerstörung der Zelloberfläche der Hefen. Die lytische Wirkung des Enzyms wurde an verschiedenen weintypischen Hefen getestet. Hierbei zeigten sich stammspezifische Unterschiede in der Sensitivität gegenüber dem Enzym. Außerdem konnte festgestellt werden, dass sowohl Wachstumsphase als auch Medium der Hefen Einfluss auf deren Zellwand hat und somit auch auf die Wirkung des Enzyms.rn

Molecular plating of thin lanthanide layers with improved material properties for nuclear applications

In der vorliegenden Arbeit werden Experimente beschrieben, die zu einem vertieften Verständnis fundamentaler Prozesse bei der elektrochemischen Herstellung von Dünnschichten, sog. Targets, für kernphysikalische und -chemische Studien führten. Targets wurden mittels 'Molecular Plating' (MP) hergestellt, indem eine Elektrodeposition aus organischem Medium in der Regel bei konstantem Strom in Zwei-Elektroden-Zellen. Die Resultate erlaubten, optimierte Herstellungs-bedingungen zu ermitteln, welche die Produktion deutlich verbesserter Targets erlaubten. MP bei konstantem Strom ist ein massentransportkontrollierter Prozess. Der angelegte Strom wird durch einen konstanten Fluss elektroaktiver Spezies zur Kathode – auf der die Schicht wächst – und Anode aufrechterhalten. Die Untersuchungen zeigten, dass das Zellenpotential des Elektrodepositionsystems immer durch den Ohm'schen Spannungsabfall auf Grund des Widerstandes der verwendeten Lösung dominiert wurde. Dies erlaubte die Herleitung einer Beziehung zwischen dem Zellenpotential und der Konzentration der elektroaktiven Spezies. Die Beziehung erlaubt die Erklärung des gemessenen zeitlichen Verlaufs des Zellenpotentials während der Abscheidung als Funktion der Elektrolytkonzentration. Dies dient als Basis, auf der nun ein umfassenderes Bild der Prozesse, die für die charakteristischen Minima im Potentialverlauf einer Abscheidung verantwortlich sind, gewonnen werden kann. Es konnte gezeigt werden, dass die Minima mit der fast vollständigen Entfernung (durch Abscheidung) der aus einem gelösten Salz erzeugten Nd-Ionen korrespondieren. Die abgeschiedene Spezies wurde als Nd3+ identifiziert, vermutlich als Carboxylat, Oxid oder Hydroxid, was auf Grund der hohen negative Werte des Standardredoxpotentials der Lanthanide verständlich erscheint. Von den vorliegenden elektroaktiven Spezies tragen die Nd3+ Ionen nur zu knapp 20% zum Gesamtstrom bei. Durch Elektrolyse tragen auch die Lösungsmittelkomponenten zu diese Strom bei. Die Gegenwart von elektrolysiertem Lösungsmittel wurde in Analysen der Dünnschichten bestätigt. Diese waren immer mit chemi- und physisorbierten Lösungsmittelmolekülen bedeckt. Die Analyse der Dünnschichten zeigte, dass die Oberflächen von einem furchenartiges Netz durchzogen waren, und dass diese während des Trocknen der Schichten nach dem MP entstanden. Ob die Schichten an Luft oder in inerter Atmosphäre trockneten, hatte keinen Einfluss. Es wurden Experimente mit mehreren Lösungsmitteln durchgeführt, die sich deutlich in ihren physikalischen Eigenschaften, v.a. dem Siedepunkt, unterschieden. Furchenfreie Dünnschichten konnten insbesondere bei MP in N,N-dimethylformamide (DMF) erzeugt werden. Die Verwendung von DMF in Kombination mit einer Abscheidung auf sehr glatten Substraten erlaubte die Produktion von sehr homogenen, glatten und defektfreien Schichten. Diese waren vermutlich geringeren inneren Spannungen während des Trocknens ausgesetzt, als Schichten auf raueren Substraten oder solche, die aus flüchtigeren Lösungsmitteln hergestellt wurden. Die Oberflächenrauigkeit des Substrats und das gewählte Lösungsmittel wurden so als Schlüsselfaktoren für die Produktion hochqualitativer Schichten identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass mit MP eine sehr effiziente Methode zur Herstellung homogener Schichten mit exzellenter Ausbeute ist. In weiteren Experimenten mit dem primordialen Alpha-Emitter 147Sm als Modellisotop wurde die Eignung solcher Schichten als Alpha-Quelle untersucht. Sowohl die Energieauflösung als auch der Anteil der Alpha-Teilchen, die den Detektor erreichten, waren von den Quelleneigenschaften abhängig. Die Effekte wurden verschiedenen Variablen der Dünnschicht zugeordnet, welche die Alpha-Spektren beeinflussten. Dominant war die Wahl des Lösungsmittels und die Rauigkeit des Substrats. Dies beeinflusste Schichtdicke und -morphologie sowie die Art des Schichtwachstums und veränderte die Detektionseffizienz in Alpha-Messungen bis zu 15%. Nur homogene, ebene Schichten, die aus DMF auf glatten Substraten abgeschieden wurden, eignen sich optimal als Alpha-Quelle. Die gewonnenen Ergebnisse erlauben die optimierte Herstellung nuklearer Targets durch MP. Künftige Anwendungen beinhalten insbesondere die Herstellung von Targets für neutroneninduzierte Spaltexperimente und untergrundarmeAlpha-Messungen sehr kleiner Aktivitäten.

Molecular mechanisms of shikonin and its derivatives in cancer therapy

The identification of molecular processes involved in cancer development and prognosis opened avenues for targeted therapies, which made treatment more tumor-specific and less toxic than conventional therapies. One important example is the epidermal growth factor receptor (EGFR) and EGFR-specific inhibitors (i.e. erlotinib). However, challenges such as drug resistance still remain in targeted therapies. Therefore, novel candidate compounds and new strategies are needed for improvement of therapy efficacy. Shikonin and its derivatives are cytotoxic constituents in traditional Chinese herbal medicine Zicao (Lithospermum erythrorhizin). In this study, we investigated the molecular mechanisms underlying the anti-cancer effects of shikonin and its derivatives in glioblastoma cells and leukemia cells. Most of shikonin derivatives showed strong cytotoxicity towards erlotinib-resistant glioblastoma cells, especially U87MG.ΔEGFR cells which overexpressed a deletion-activated EGFR (ΔEGFR). Moreover, shikonin and some derivatives worked synergistically with erlotinib in killing EGFR-overexpressing cells. Combination treatment with shikonin and erlotinib overcame the drug resistance of these cells to erlotinib. Western blotting analysis revealed that shikonin inhibited ΔEGFR phosphorylation and led to corresponding decreases in phosphorylation of EGFR downstream molecules. By means of Loewe additivity and Bliss independence drug interaction models, we found erlotinb and shikonin or its derivatives corporately suppressed ΔEGFR phosphorylation. We believed this to be a main mechanism responsible for their synergism in U87MG.ΔEGFR cells. In leukemia cells, which did not express EGFR, shikonin and its derivatives exhibited even greater cytotoxicity, suggesting the existence of other mechanisms. Microarray-based gene expression analysis uncovered the transcription factor c-MYC as the commonly deregulated molecule by shikonin and its derivatives. As validated by Western blotting analysis, DNA-binding assays and molecular docking, shikonin and its derivatives bound and inhibited c-MYC. Furthermore, the deregulation of ERK, JNK MAPK and AKT activity was closely associated with the reduction of c-MYC, indicating the involvement of these signaling molecules in shikonin-triggered c-MYC inactivation. In conclusion, the inhibition of EGFR signaling, synergism with erlotinib and targeting of c-MYC illustrate the multi-targeted feature of natural naphthoquinones such as shikonin and derivatives. This may open attractive possibilities for their use in a molecular targeted cancer therapy.