Methodische Entwicklung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für Grenzbereiche der Polymeranalytik

Zusammenfassung der DoktorarbeitDie MALDI-TOF-Massenspektrometrie (Matrix Assisted Laser Desorption and Ionisation–Time Of Flight) ist in der Lage, Moleküle mit einem Molekulargewicht bis zu mehreren Hunderttausend Da intakt in die Gasphase zu überführen. Dabei wird die Fragmentierung des Analyten stark eingeschränkt bzw. gänzlich vermieden. Diese Methode findet daher zunehmend Verwendung für die Charakterisierung von Biopolymeren und synthetischen Polymeren. Ziel dieser Arbeit war, die MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur Charakterisierung von Makromolekülen einzusetzen, bei denen die konventionellen polymeranalytischen Methoden nur unzureichende Informationen oder gar falsche bzw. gar keine Ergebnisse liefern. Mittels einer methodischen Entwicklung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie gelang es, die bisherigen Grenzen der Methode zu erweitern und neue Anwendungsbereiche der Polymeranalytik aufzuzeigen. Anhand der erzielten Ergebnisse wurden darüber hinaus neue Erklärungsansätze formuliert, die zu einem besseren Verständnis des noch immer ungeklärten MALDI-Prozesses beitragen können. Besonders vielversprechend sind zum einen die Ergebnisse der Fragmentionenanalyse synthetischer Polymere und zum anderen die Charakterisierung von unlöslichen PAHs (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons). Die Möglichkeiten und Aussagekraft der Fragmentionenanalyse wurde an synthetischen Polymeren getestet. Mit Hilfe dieser neuen Technik konnte die komplizierte Endgruppenverteilung einer Polycarbonat-Probe sowie die Zusammensetzung eines Poly-para-phenylenethynylen-b-Polyethylenoxid-Diblock-Copolymers eindeutig bestimmen werden, während die konventionellen MALDI-Massenspektren nur über einen wesentlich geringeren Informationsgehalt verfügten. Auf dem Gebiet der Analytik von unlöslichen PAHs wurde mit der Entwicklung einer neuen MALDI-Probenvorbereitung eine Methode gefunden, die über die PAH Analytik hinaus von großem Nutzen ist. Diese erstmalig angewendete Probenvorbereitung unterscheidet sich von den üblichen MALDI-Probenpräparationen, indem sie auf die Beteiligung eines Lösungsmittels vollkommen verzichtet. Damit konnte speziell ein unlöslicher, zuvor nicht nachweisbarer PAH von ca. 2700 Da mit MALDI eindeutig charakterisiert werden.

Methodische Entwicklung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie für Grenzbereiche der Makromolekülanalytik

Ziel dieser Arbeit war die methodische Entwicklung der Matrix-unterstützten Laserdesorptions/Ionisations- (MALDI-) Time-of-Flight- (TOF-) Massenspektrometrie (MS) zur Charakterisierung von Makromolekülen. Durch geeignete Experimente und unter Berücksichtigung der Ergebnisse ergänzender analytischer Methoden wurden neue Möglichkeiten der MALDI-TOF-MS-Methode erarbeitet, deren bisherige Grenzen genauer definiert und auf Basis eines besseren Verständnisses der limitierenden Faktoren in vielen Fällen auch überwunden.Die MALDI-Probenpräparation gestaltet sich generell sehr komplex. Es konnte gezeigt werden, dass die lösungsmittelfreie Probenpräparation die MALDI-Analytik in der Art verbessert, dass erzielte Ergebnisse qualitativ (z.B. Auflösung, Genauigkeit) und quantitativ (z.B. Reproduzierbarkeit) zuverlässiger sind. Wichtige Vorteile der lösungsmittelfreien MALDI-TOF-MS konnten bei einem breiten Spektrum unterschiedlicher Analyten herausgearbeitet werden. Fragmentierungslabile Analyte waren charakterisierbar, da weniger Laserleistung für den Desorptionsschritt in das Probengemisch eingebracht werden musste. Oxidationslabile bzw. thermolabile Substanzen (z.B. Pigmente) konnten charakterisiert werden, da auf den Löseschritt verzichtet werden konnte, der zu unerwünschten Veränderungen des Analyten führen kann. Generell konnte gezeigt werden, dass diese Probenpräparation geeignet ist, um schwer- und unlösliche Substanzen wie z.B. Poly(dithiathianthren)e und Poly(fluoren)e zu charakterisieren. Entmischungseffekte (z.B. bei Poly(etherimid)en und Poly(dimethylsiloxan)en), die in der konventionellen Probenpräparation während des Verdampfungsschrittes des Lösungsmittels zu einer inhomogenen Kristallisation des MALDI-Probengemisches führen, können überwunden werden, da vollständig auf Lösungsmittel verzichtet wird. So konnten beispielsweise nur durch den gezielten Einsatz der lösungsmittelfreien MALDI-TOF-MS Polystyrol-Proben analysiert werden, bei denen trotz optimierter Bedingungen die lösungsmittelbasierende MALDI-TOF-MS aufgrund unerwünschter Lösungsmitteleinflüsse fälschliche Ergebnisse lieferte. Die lösungsmittelfreie Probenpräparation ist eine wichtige Ergänzung zur Charakterisierung von Makromolekülen und erschließt neue Bereiche der Analytik, insbesondere bei unlöslichen Verbindungen und bei Analyt Matrix-Entmischungsphänomenen. Das bisherige Verständnis des zugrundeliegenden MALDI-Prozesses postuliert den homogenen Einbau des Analyten in den Matrixkristall. Die äußerst positiven experimentellen Ergebnisse der lösungsmittelfreien MALDI-TOF-MS widersprechen jedoch dieser Modellvorstellung, da bei der angewendeten Probenpräparation eine Homogenisierung auf molekularer Ebene auszuschließen ist. Durch die lösungsmittelfreie MALDI-TOF-MS am Modellanalyten Cytochrom C konnte nachgewiesen werden, dass der Einbau eines Analyten in einen Matrixkristall nicht zwingend notwendig, sondern aufgrund der erhöhten einzubringenden Laserleistung sogar eher von Nachteil ist. Der MALDI-Prozess verläuft umso effektiver, je geringer die (Rest)-Kristallinität und je inniger der Kontakt zwischen Analyt und Matrix sind. Methodische Aspekte der Fragmentionenanalyse wurden zunächst an einfachen Homopolymeren erarbeitet. Durch den gezielten Einsatz der MALDI-Fragmentionenanalytik konnte im Folgenden z.B. erstmals direkt die Sequenzanalyse eines statistischen Copolymers und eines Triblockcopolymers durchgeführt werden. Abschließend wurden bei anwendungsorientierten Untersuchungen zur Charakterisierung problematischer Analyten mittels MALDI-TOF-MS zunächst die individuellen Schwachstellen festgelegt. Durch geeignete Probenpräparations- und Messbedingungen wurde dann die MALDI-TOF-MS-Methode zur direkten Analyse schwer charakterisierbarer, labiler bzw. unlöslicher Analyten und Substanzgemische ermöglicht (z.B. Dendrimere, Polyzyklische Aromatische Kohlenwasserstoffe, umweltrelevantes Poly(vinylpyrrolidon)). Dabei wurden qualitative und quantitative Aspekte berücksichtigt. Außerdem wurden die analytischen Möglichkeiten und Limitierungen zur Charakterisierung von supramolekularen Komplexen anhand geeigneter Modellsysteme (z.B. Cyclodextrine) ermittelt.

Untersuchungen zur Position der MALDI-TOF Massenspektrometrie in der Analytik von synthetischen Polymeren

Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Anwendung der MALDI-TOF Massenspektrometrie auf annähernd monodisperse und eng verteilte Verbindungen polymerer Gestalt beschrieben. Dazu werden mit Polyphenylendendrimeren, Polybutadien-Sternpolymeren, Propionylethyleniminen und Polyethylmethylsiloxanen weniger gängige Verbindungen ausgewählt, für deren Analyse keine Standardmethodik vorliegt. Dabei wird gezeigt, dass andere Analysemethoden (wie z.B. GPC oder NMR) der MALDI-TOF Massenspektrometrie oftmals deutlich unterlegen sind - in einigen Fällen werden deren Ergebnisse gar widerlegt. In anderen Fällen wird allerdings auch festgestellt, dass diese Methoden die Massenspektrometrie unterstützen oder ergänzen können. Im darauf folgenden Teil werden durch Mischen eng verteilter Polymerstandards breite Verteilung simuliert, um so die Gründe für die Limitierung der Anwendbarkeit der MALDI-TOF Massenspektrometrie auf breite Verteilungen zu ermitteln. Die Problematik der Messung von breiten Verteilungen wird oftmals durch eine vorherige Fraktionierung mit der GPC gelöst. Auch dieses Verfahren wird in dieser Arbeit an Hand von simulierten breiten Verteilungen untersucht und bewertet. Neben qualitativen Untersuchungen mit der MALDI-TOF Massenspektrometrie wird in dieser Arbeit abgeschätzt, inwieweit diese Methode auch zur quantitativen Analyse eingesetzt werden kann. Dazu werden die Untersuchungen von Oligo(para-phenylene) (OPP) und von Cyclodehydrierungsprodukten sehr großer Dendrimere (C385, C474) beschrieben. Dabei stellt sich heraus, das neben der direkten UV-Absorption (im Falle der OPPs) auch die zunehmende Ionisierungswahrscheinlichkeit und die sinkende Desorptionswahrscheinlichkeit mit fortschreitender Cyclodehydrierung eine Quantifizierung problematisch gestalten. In einem abschließenden Kapitel wird der Versuch beschrieben, aus polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAHs) durch den Beschuss mit den UV-Strahlen des MALDI-TOF Massenspektrometers Fullerene zu erzeugen. Der Einsatz von NaCl als sogenannte Inertmatrix führt zu vielversprechenden ersten Ergebnissen.

From MALDI-TOF mass spectrometry to soft-landing for electronics

Within this PhD thesis matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) has been used as a reliable tool for the quantitative characterization of giant molecules, such as alkyl substituted and unsubstituted large polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), which cannot be characterized by conventional analytic techniques due to their lack of solubility. The use of the MALDI solvent-free technique for the sample preparation and the application of the standard addition method have allowed the quantitative characterization of synthetic PAH mixtures. The knowledge, acquired by studying these representative systems, has been then transferred to the quantitative analyses of complex and slightly soluble natural PAH mixtures, such as mesophase pitch. Moreover, the possibility to ionize intractable and insoluble molecules via mass spectrometry has been recognized to be not only a powerful analytical method, but also to represent a unique change to handle giant aromatic systems and to deposit them on a surface for further investigations, in a process, which is defined as “soft-landing”. Within this novel deposition technique, ions of the desired analytes or analyte mixtures are generated by means of an MS ionization source, discriminated by their different mass to charge ratios via a mass analyzer and landed with retention of their structure on a desired surface. This soft-deposition is guaranteed by the use of decelerating potentials, which have in this work been recognized to influence the final packing of the analyte molecules reaching the landing surface. For a more detailed study of the electrical field action on disc-like and rod-like molecules, soft-landing-independent experiments have been additionally carried out. As a result unidirectionally ordered films of the analyte molecules have been obtained due to the application of an external electrical strength. This versatile alignment technique has then been used for obtaining ordered layers of semiconducting materials for the fabrication of organic field effect transistors (OFET) with improved performances.

Charakterisierung und Funktionalisierung von Polyphenylen-Dendrimeren

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese, Funktionalisierung und Charakterisierung hochverzweigter Polyphenylen-Dendrimere. Dendrimere sind sternförmig aufgebaute Makromoleküle mit regelmäßig verzweigten Armen. Trotz der Herstellung einer Vielfalt von unterschiedlichen Dendrimertypen bleibt die Herstellung steifer formpersistenter nanometergroßer Dendrimere eine Herausforderung. Ein Ansatz zur Herstellung von form- und größenstabilen 'Nanoobjekten' wird in dieser Arbeit vorgestellt. Grundlage der Synthese der in dieser Arbeit hergestellten Polyphenylen-Dendrimere ist die Diels-Alder-Cycloaddition zwischen Tetraphenylcyclopentadienonen und Ethinylderivaten. Auf diese Weise können monodisperse Makromoleküle mit Molekularmassen größer 20 kDa und Durchmessern von 6 nm erhalten werden. Funktionalisiert werden die Dendrimere mit Funktionen wie z. B. Alkyl, Hydroxy oder Carboxy. Die Charakterisierung erfolgt u. a. mit Hilfe der NMR, GPC, Lichtstreuung oder MALDI-TOF Massenspektrometrie, aber auch mit abbildenden Methoden, wie z. B. der AFM und TEM und der Kristallstrukturanalyse. Die Dynamik der vorgestellten Dendrimere wird zum einen mit molekulardynamischen Berechnungen, zum anderen mit der Festkörper-NMR untersucht.Die Ergebnisse der Untersuchungen beweisen, dass Polyphenylen-Dendrimere nanometergroße steife formstabile Moleküle sind. Sie besitzen in erster Näherung eine globuläre Form, die große Hohlräume enthalten, in die Gastmoleküle eindringen können. Weiterhin erlauben sie eine bezüglich der Anzahl und Position definierte Funktionalisierung.

Kinetische Untersuchungen zur Synthese von Blockcopolymeren mit Methacrylatsegmenten durch neue anionische Polymerisationssysteme

Ein metallfreies Reaktionssystem mit Bis(triphenylphosphoranyliden)ammonium-Kationen als Gegenionen sowie das Additiv Lithium-2-methoxyethoxid wurden auf ihre Eignung zur anionischen Synthese von Blockcopolymeren mit (Meth)acrylatsegmenten bei moderaten Temperaturen im Strömungsrohr-Reaktor untersucht. Das metallfreie System ist zur lebenden Polymerisation von Methacrylaten in THF mit engen Molekulargewichtsverteilungen bei Reaktionszeiten < 1 s bis zu Temperaturen von 0 °C geeignet. In Gegenwart von Metallionen (Li+) findet eine Verlangsamung der Polymerisation unter Verlust der Reaktionskontrolle statt, Lithiumenolate verursachen nun breite, multimodale Molekulargewichtsverteilungen. Eine lebende Polymerisation von Acrylaten ist nicht möglich, massenspektroskopische Untersuchungen der Produkte weisen auf einen komplexen Reaktionsmechanismus mit Abbruch- und Übertragungsreaktionen hin. Die Synthese von Poly(styrol)-block-Poly(1,4-butadien)-block-Poly(methylmethacrylat)-Copolymeren in Toluol ist mit Lithium-2-methoxyethoxid als Additiv für die MMA-Polymerisation bei moderaten Mischtemperaturen (T < 0 °C) im Strömungsrohr-Reaktor möglich, die Effektivität des Wechselschritts von Polybutadien zu PMMA beträgt im Durchschnitt ca. 50 %. Untersuchungen verschiedener Reaktionsparameter, wie z.B. der Endfunktionalisierung des Polybutadiens mit 1,1-Diphenylethylen und der Temperatur während der Verkappung und der MMA-Polymerisation, geben keine eindeutigen Hinweise auf die Ursache dieses Phänomens. MALDI-TOF-Massenspektren des unreagierten Polybutadien Precursors zeigen die Anlagerung von 1-3 Molekülen Methylmethacrylat und keinen Abbruch durch Backbiting, was auf die Ausbildung stabiler Aggregate hindeutet.

Charakterisierung und Stabilität von Arthropoden-Hämocyanin

Hämocyanine sind große, multimere Sauerstofftransport- proteine, die frei gelöst in der Hämolymphe von Arthropoden und Mollusken vorkommen.Zur Charakterisierung verschiedener Arthropoden-hämocyanine wurden deren molare Massen bestimmt. Die mit einer Vielwinkel-Laser-Lichtstreuapparatur ermittelten Molekulargewichte zeigten eine grosse Schwankungsbreite. Dies konnte auf Ungenauigkeiten der zur Berechnung der Molekulargewichte verwendeten spezifischen Extinktions- koeffizienten und Brechungsindex-Inkremente zurückgeführt werden.Mit der Methode der Massenspektrometrie (MALDI-TOF) bestimmte Molekulargewichte einzelner Untereinheiten des Hämocyanins der Vogelspinne Eurypelma californicum zeigten eine sehr gute Übereinstimmung mit aus der Sequenz errechneten Werten.Für das 24-mere Spinnenhämocyanin von Eurypelma californicum wurde die Stabilität gegenüber GdnHCl und der Temperatur auf den verschiedenen strukturellen Ebenen des Proteins untersucht.Viele Stabilitätsuntersuchungen werden an kleinen Proteinen durchgeführt, deren Entfaltung kooperativerfolgt. Bei größeren Proteinen mit unterschiedlichen strukturellen Bereichen (Domänen) ist der Entfaltungs-prozess weitaus komplexer. Ziel war es, durch die Denaturierung des Spinnen-Hämocyanins Erkenntnisse über die Stabilität und Entfaltung der verschiedenen strukturellen Ebenen eines so großen Proteinkomplexes zu gewinnen.Ein wichtiges Charakteristikum für die Interpretation der Entfaltungsexperimente ist die starke Löschung der Tryptophanfluoreszenz im oxygenierten Spinnen-Hämocyanin. Die Löschung kann vollständig durch Förster-Transfer erklärt werden kann. Sie bleibt auf die einzelnen Untereinheiten beschränkt und stellt somit ein reines O₂-Beladungssignal dar.Unter Einwirkung von GdnHCl dissoziiert das native, 24-mere Spinnen-Hämocyanin ohne die Entstehung langlebiger Inter- mediate. Die Untereinheiten werden durch das Oligomer stabilisiert. Die Entfaltung eines Monomers, der Unter- einheit e, folgt einer Hierarchie der verschiedenen strukturellen Ebenen des Moleküls. Die Entfaltung beginnt zunächst von außen mit der Auflockerung der Tertiärstruktur. Der Kern von Domäne II mit dem aktiven Zentrum weist hingegen eine besondere Stabilität auf.Die ausgeprägte Hitzestabilität des Eurypelma-Hämocyanins hängt vom Oligomerisierungsgrad, dem verwendeten Puffer und dessen Ausgangs-pH-Wert ab und spiegelt offensichtlich die extremen Lebensbedingungen im Habitat wider.

Development of a comprehensive on-line multidimensional high performance column liquid chromatography system for protein and peptide mapping with integrated size selective sample fractionation

Aufbau einer kontinuierlichen, mehrdimensionalen Hochleistungs-flüssigchromatographie-Anlage für die Trennung von Proteinen und Peptiden mit integrierter größenselektiver ProbenfraktionierungEs wurde eine mehrdimensionale HPLC-Trennmethode für Proteine und Peptide mit einem Molekulargewicht von <15 kDa entwickelt.Im ersten Schritt werden die Zielanalyte von höhermolekularen sowie nicht ionischen Bestandteilen mit Hilfe von 'Restricted Access Materialien' (RAM) mit Ionenaustauscher-Funktionalität getrennt. Anschließend werden die Proteine auf einer analytischen Ionenaustauscher-Säule sowie auf Reversed-Phase-Säulen getrennt. Zur Vermeidung von Probenverlusten wurde ein kontinuierlich arbeitendes, voll automatisiertes System auf Basis unterschiedlicher Trenngeschwindigkeiten und vier parallelen RP-Säulen aufgebaut.Es werden jeweils zwei RP-Säulen gleichzeitig, jedoch mit zeitlich versetztem Beginn eluiert, um durch flache Gradienten ausreichende Trennleistungen zu erhalten. Während die dritte Säule regeneriert wird, erfolgt das Beladen der vierte Säule durch Anreicherung der Proteine und Peptide am Säulenkopf. Während der Gesamtanalysenzeit von 96 Minuten werden in Intervallen von 4 Minuten Fraktionen aus der 1. Dimension auf die RP-Säulen überführt und innerhalb von 8 Minuten getrennt, wobei 24 RP-Chromatogramme resultieren.Als Testsubstanzen wurden u.a. Standardproteine, Proteine und Peptide aus humanem Hämofiltrat sowie aus Lungenfibroblast-Zellkulturüberständen eingesetzt. Weiterhin wurden Fraktionen gesammelt und mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie untersucht. Bei einer Injektion wurden in den 24 RP-Chromatogrammen mehr als 1000 Peaks aufgelöst. Der theoretische Wert der Peakkapazität liegt bei ungefähr 3000.

Vorkommen und Charakterisierung von Ecdysiotropinen bei männlichen Imagines der Mittelmeerfeldgrille Gryllus bimaculatus de Geer

Das Vorkommen von Häutungshormonen in adulten Insekten, insbesondere solcher, die eine lange Imaginalphase durchlaufen, wirft die Frage nach der Regulation der Ecdysteroidsynthese außerhalb der Prothorakaldrüse auf. Unter diesem Gesichtspunkt kann Gryllus bimaculatus mit einem ausgesprochen langen Adultstadium und rapiden zeitlichen Veränderungen des Ecdysontiters als ein geeignetes Versuchsobjekt angesehen werden.Der vorliegenden Dissertation liegt die Arbeitshypothese zugrunde, daß die Ecdysteroid-Synthese bzw. Sekretion von Adultgeweben in männlichen Imagines der Mittelmeerfeldgrille durch Neuropeptide hormonell reguliert wird. Als Quelle für die Ecdysteroidsynthese wurde auf Grund immunohistochemischer Befunde sowie der Ergebnisse von Sekretionsprofil-Analysen unter anderem die Oenocyten in Betracht gezogen.Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde ein in vitro Bioassay entwickelt, der es ermöglichte, die Wirkung von extrahierten Substanzen auf die Hormonsynthese mittels RIA/HPLC zu bestimmen. Aus Köpfen adulter G. bimaculatus ließen sich durch HP-SEC Faktoren isolieren, die die Ecdysteroidsekretion in Oenocyten und Tergiten stimulierten, die aber keinen Einfluß auf die Hormonsekretion von Fettgewebe sowie der Prothorakaldrüsen hatten. Die Wirkung des aufgereinigten Extraktes in Oenocyten war zeit- und dosis-abhängig. Die ecdysiotropen Faktoren besaßen ein Molekulargewicht zwischen 26,5 und 30 kDa. Die Größe der Molmasse der ecdysiotropen Faktoren entsprach somit bei adulten männlichen Grillen etwa dem des Neurohormons PTTH bei Lepidopteren. Dennoch zeigten Antikörper, die gegen PTTH von Bombyx mori gerichtet waren im Western-Blot keine Bindung an Gryllus bimaculatus Kopfextrakte. Die Sekretionsprodukte von Oenocyten, die mit Ecdysiotropinen behandelt waren, wurden durch RP- und NP-HPLC identifiziert. Es konnten zwei zusätzliche Peaks neben einem deutlichen Anstieg von 20-Hydroxyecdyson nachgewiesen werden. Auf Grund identischer Retentionszeiten mit Referenzsubstanzen handelt es sich bei einem Peak vermutlich um Makisteron A.Obwohl die Applikation von Azadirachtin in G. bimaculatus zu einer Senkung des Hämolymph-Ecdysteroidgehalts führte, konnte keine Anreicherung von Ecdysiotropinen erzielt werden.Die die Ecdysteroidsekretion-beeinflussenden Faktoren waren resistent gegen Kochen und Alkylierung aber nicht stabil gegen Reduzierung durch DTT und Behandlung mit Neuramidase. Damit konnte gezeigt werden, daß das Vorhandensein von Disulfidbrücken und Oligosaccharidketten für die biologische Aktivität notwendig ist.Die Aminosäuresequenz-Analyse und der enzymatische Verdau der stimulierenden Faktoren durch Exopeptidasen wiesen auf geschützte N- und C-Termini hin. Ferner wurden einige interne Peptidfragmente von fünf Proteinbanden sequenziert, die keine Homologie zu bereits bekannten regulatorischen Neuropeptiden zeigten. Als einziges bekanntes Protein aus diesem Bereich konnte das „14-3-3-like Protein“ mit Hilfe MALDI-MS identifiziert werden.Die Stimulierung der Ecdysteroidsekretion in Oenocyten von G. bimaculatus durch Oenocyten-stimulierende Faktoren (OSF) aus Kopfextrakten konnte mittels Signalstoff-Effektoren in vitro nachgeahmt werden. Außerdem wurde mit Hilfe eines RRA nachgewiesen, daß der intrazelluläre cAMP-Spiegel von Oenocyten durch OSF erhöht wird. Daraus kann geschlossen werden, daß cAMP als „Second Messenger“ an der Wirkung der OSF beteiligt ist. Calcium-Ionen schienen für die Ecdysteroidsekretion notwendig zu sein. Allerdings führte eine artifizielle Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration durch das Ionophor Ionomycin zu einer Hemmung der Sekretion. Schließlich wird ein Modell zur Erklärung des Wirkmechanismus von OSF in Gryllus bimaculatus postuliert und diskutiert.

Poly(para-phenylenethinylen)e - Synthese, Charakterisierung und Eigenschaften von endfunktionalisierten Polymeren und Stäbchen-Knäuel-Diblockcopolymeren

Der erste Teil der vorliegenden Dissertation beschäftigt sich mit der Eignung des ?,?-dithiolfunktionalisierten Poly(para-phenylenethinylen)s (PPE) als sogenannter „molekularer Draht“ für die molekulare Elektronik. Über die HECK-CASSAR-SONOGASHIRA-Reaktion wurden vollständig endfunktionalisierte, defektfreie Polymere mit durchschnittlichen Polymerisationsgraden von bis zu 45 Repetitionseinheiten synthetisiert. Die starke Aggregationsneigung der PPE, die die Anordnung der Polymerketten zwischen den Goldelektroden unterstützen soll, wurde mittels Rasterkraft- und Rastertunnelmikroskopie untersucht. Für die Untersuchungen zur Dotierbarkeit wurden ESR-, ENDOR-, UPS- und XPS-Messungen durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass sich das PPE reduzieren lässt.Im zweiten Teil der Arbeit wurden die PPE zur Synthese von Stäbchen-Knäuel-Diblockcopolymeren eingesetzt. Die Darstellung erfolgte nach der 'grafting onto'-Methode, indem monocarboxyl-endfunktionalisiertes PPE mit flexiblen monohydroxyl-endfunktionalisiertem Polyethylenglykol, Polydimethylsulfoxid bzw. Polytetrahydrofuran verestert wurde. Den Nachweis der Diblockcopolymerbildung erbrachten die 1H?NMR-Spektroskopie und die für Diblockcopolymere noch wenig angewandte MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Mittels Rasterkraftmikroskopie und Computersimulationen zur Molekularmechanik und -dynamik wurden die Aggregationseigenschaften der Diblockcopolymere untersucht.

Zur Evolution des Cytoskeletts beim Sibirischen Stör Acipenser baeri

Im Rahmen meiner Arbeit wurden erstmals die Intermediärfilament-Proteine (IF-Proteine) des Sibirischen Störs Acipenser baeri (Strahlenflosser, Knorpelganoid) kloniert und sequenziert. Aus einer cDNA-Bank konnten die Sequenzen von 13 IF-Proteine gewonnen werden. Von insgesamt zehn Keratinen codieren sieben für Typ I-Keratine und drei für Typ II. Zusätzlich konnten noch Desmin, Vimentin und ein Lamin identifiziert werden. Je einem Typ I- (K13) und einem Typ-II-Keratin (K2) fehlen wenige Aminosäuren in der Head-Domäne.Cytoskelett-Präparationen aus Epidermis, Mitteldarm, Magen und Kieme wurden mittels 2D-PAGE aufgetrennt. Durch Einsatz des CKBB-Test und Immunoblots wurden die verschiedenen Typ I und II-Keratine sowie Desmin und Vimentin identifiziert. Die gewebsspezifische Expression der Keratine ermöglichte zumeist ihre Einteilung in 'E' (epidermal) und 'S' ('simple epithelial').Die MALDI-MS-Analyse einer 2D-PAGE-Koelektrophorese von Seitenflosse und Mitteldarm zeigte, daß die 34 vorhandenen Proteinflecke auf nur 13 verschiedene IF-Proteine zurückgehen. Neun dieser Flecke konnten Sequenzen zugewiesen werden. Zusammen mit den verbleibenden vier Proteinflecken ergeben sich für den Stör nunmehr insgesamt 17 bekannte IF-Proteine. Von drei biochemisch identifizierten IS-Keratinen kommt eines nur im Mitteldarm vor und nur einem konnte eine Sequenz zugeordnet werden (K18). Dem einzigen Typ IIS-Keratin konnte keine Sequenz zugeordnet werden, wahrscheinlich handelt es sich um dabei um das K8-Orthologe. Jedem der fünf Typ IE-Proteine konnte eine Sequenz zugeordnet werden (K10 bis K14), ebenso wie dem einzigen identifizierten Typ IIE-Keratin (K2). Von den Typ III-Proteinen wurden Desmin und Vimentin ihren Proteinflecken zugeordnet. Die nicht zugeordnete Sequenz aba-k1 codiert möglicherweise für ein IIE-Keratin, während aba-k15 vermutlich die Sequenz für ein IE-Keratin enthält. Bei den Proteinflecken, denen eine Sequenz zugeordnet werden konnten, kann für Aba-K2 die Zugehörigkeit zum IIE-Typ angenommen werden, während es sich bei Aba-K10 wahrscheinlich um ein IE-Keratin handelt.Durch Datenbankvergleiche und molekulare Stammbäume konnte die Zugehörigkeit der identifizierten Lamin-Sequenz zum B3-Subtyp der Vertebraten gezeigt werden.Die Daten der Biochemie und indirekten Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen, daß Keratine in Epithelien und Vimentin in mesenchymalen Geweben vorkommen. Es existieren starke Hinweise, daß im letzten Gewebetyp Keratine auch koexprimiert werden. Desmin kommt in großen Mengen im Magen und im Mitteldarm vor und stellt dort das prominenteste Protein.Mit den gewonnenen Sequenzdaten wurden molekulare Stammbäume und Sequenzidentitäten berechnet. Die daraus resultierenden Konsequenzen für die Verwandtschaftsverhältnisse der verschiedenen IF-Proteine sowie der Wirbeltiere werden diskutiert.

Ortsaufgelöster Nachweis von Elementspuren mittels Laserablation und Resonanzionisations-Massenspektrometrie und Untersuchungen zur Laserablations-Dynamik

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine neue Methode für einen empfindlichen und isotopenselektiven Elementnachweis entwickelt. Unter Einsatz von Laserablation geschieht der Probenaufschluß direkt und mit einer Ortsauflösung von unter 30 m. Hierzu wurde ein hochauflösendes MALDI-TOF-Massenspektrometer, welches üblicherweise für biochemische Fragestellungen eingesetzt wird, mit einem spektroskopischen Aufbau zur resonanten Ionisation von Elementgehalten modifiziert. Die Methode ist somit insbesondere für die Untersuchung von Elementspuren in Festkörperproben mit mikroskopischer Struktur konzipiert. Methodische Entwicklungsarbeiten wurden anhand des Elements Gadolinium durchgeführt. Durch die Verwendung gepulster Farbstofflaser stehen ausreichend hohe Laserfelder zur Verfügung, um unabhängig von Hyperfeinstruktur und Isotopieverschiebung Übergänge aller Isotope im Rahmen des Resonanzionisations-Verfahrens zu sättigen. Darauf konnte eine Isotopenverhältnisanalyse mit einer Genauigkeit im Prozentbereich verwirklicht werden. Verschiedene Anregungsleitern wurden untersucht, und mit elementspezifischen Resonanzüberhöhungen bis zu zwei Größenordnungen über dem nicht-resonant gebildeten Untergrund konnte eine Nachweiseffizienz von über 10-4 (entsprechend sub-fg/g-Niveau) erzielt werden. Dazu wurden Simulationsrechnungen zum atomaren Sättigungsverhalten in starken resonanten Laserfeldern durchgeführt. Erste Anwendungen des Laserablationsverfahrens waren Proben kosmologischer Herkunft. Der physikalische Prozeß der Laserablation bei Metallen wurde unter Hochvakuum-Bedingung systematisch in Abhängigkeit der Laserfluenz untersucht. In der ablatierten Plasmaphase erwies sich der Neutralanteil als besonders geeignet für geschwindigkeitsselektive Laserionisations-Messungen. Eine bimodale Struktur wurde beobachtet, bestehend aus einer thermischen und einer schockwellen-induzierten Komponente. Der ionische Anteil der ablatierten Dampfphase konnte über variable elektrische Feldpulse untersucht werden. Laserablation unter Atmosphärenbedingung wurde an einem beschichteten Messingtarget untersucht. Dabei wurde die Entstehung von permanenten Oberflächenstrukturen beobachtet, welche sich durch Nichtgleichgewichts-Prozesse in der Dampfphase erklären lassen.

Design, synthesis and photochemical studies of stilbenoid dendrimers

Stilbenoid dendrimers with stilbene in the periphery and stilbene in periphery as well as core were synthesized by convergent approach except 2nd generation dendrimer with stilbene in the periphery as well as in core (D-5). All dendrimers were characterized by standard techniques such as 1H NMR, 13C NMR, MS and IR spectroscopy. The MALDI-TOF technique proved to be very helpful in the identification of the 2nd generation dendrimer (D-5) with a mass of 3231 a.m.u. The dendrimers were designed in such a way that an intramolecular photochemical CC bond formation was favored. As two stilbene units of the same molecule were close enough so they preferred an intramolecular cyclic process except for zero generation dendrimers. Apart from the cycloaddition, some E/Z isomerization and oligomer formation was also observed on irradiation. These processes were observed by 1H NMR and MALDI-TOF MS. The photochemical behavior was also studied by UV absorption spectroscopy. Irradiating by monochromatic light led to an initial E/Z isomerization and by prolonged irradiation, an irreversible cyclic structure was formed. The choice of the wavelength of incident light is very important as irradiation at 320 nm leads to a reversible E/Z isomerization and a non-reversible cyclobutane formation, but irradiation at 340 nm favors the one-way process E Z. The [2+2] cycloaddition of molecule Tm2De was also studied by irradiating thin films on a quartz surface. An AFM image was taken before irradiation, after 3 sec irradiation and after long irradiation (1 hour). AFM studies show that a short irradiation leads to a cyclic structure as formation of hills of about 20-30 nm on the surface. A prolonged irradiation leads to a CC cross linking which can be monitored on AFM images as disappearance of hills. The roughness goes back to an almost smooth surface. These results prove a very complex material transport, which accompanies the reaction in the surface region.

Glycopeptidliganden von Zelladhäsionsrezeptoren mit sulfatierter Arabino-Lewis a-Struktur

Selektine sind eine Gruppe von Transmembranglycoproteinen, welche als Adhäsionsmoleküle innerhalb des vaskulären Systems Zelladhäsionsprozesse zwischen Leukozyten und Endothelzellen vermitteln. Das Sialyl-Lewisa Epitop und verwandte Kohlenhydratstrukturen wurden als Liganden der E- und P-Selektine identifiziert. Durch die chemische Synthese verwandter Strukturen verspricht man sich, die im Laufe inflammatorischer Prozesse exprimierten Rezeptoren gezielt blockieren zu können und dadurch pathologische Abläufe wie hämatogene Metastasierungen oder Abstoßungsreaktionen zu bekämpfen. Einige Bereiche der Aminosäuresequenz des E-Selektin-Ligand-1 (ESL-1) treten hochkonservativ auch in anderen Selektinliganden wie MG160 oder PSGL-1 auf und wurden deshalb für die N-Glycosylierung mit einem sulfatierten Oligosaccharid ausgewählt (11). -Val665-Glu-Cys-Arg-Asp-Ile-Val-Gly-Asn(Sulfo-Lea)-Leu-Tyr-Glu-Leu-Glu-Ser-Glu-Asp-Ile682- 11 Im ersten Teil der Arbeit wurde eine Strategie ausgearbeitet, das sulfatierte Trisaccharid 60 im Multigrammaßstab zu synthetisieren. Der endogene Ligand 2 wurde an drei Positionen modifiziert: Austausch der α-L-Fucose gegen die biologisch stabilere α-D-Arabinose, Einführung einer Sulfatgruppe anstelle der N-Acetylneuraminsäure sowie Übergang von O- zu N-glykosidischer Verknüpfung. Die hochregioselektive Einführung der Sulfatgruppe gelingt in sehr guten Ausbeuten durch Vorkomplexierung mit Dibutylzinnoxid und anschließende Umsetzung mit Schwefeltrioxid/Trimethylamin. Durch die Verwendung des anomeren Azids als permanente Schutzgruppe kann das Trisaccharid nach schonender Reduktion zum Amin an ein Asparaginsäurederivat angekuppelt und in einer linearen Synthese nach Fmoc-Strategie als N-Glycosylaminosäure in die Synthese eingebracht werden. Das in der Arbeitsgruppe Kunz entwickelte PTMSEL-Ankersystem 20a erlaubt sowohl die problemlose Synthese als auch die Abspaltung vom polymeren Träger unter sehr milden Bedingungen. Nach dem Entfernen der Benzylester und -ether durch Pd(0) – katalysierte Hydrierung können sulfatierte Glycopeptidsequenzen des Typs 11 über NMR-Spektroskopie (korrelierte Spektren) und Massenspektroskopie (ESI, MALDI) identifiziert werden.

Benzothiazoliumsalze als Photoinitiatoren für kationische Epoxidpolymerisationen

In dieser Arbeit wurden neuartige substituierte N-Benzylbenzothiazoliumhexa-fluorophosphate und –antimonate synthetisiert und hinsichtlich ihre Wirksamkeit als photo- und thermolatente Initiatoren für Epoxidpolymerisationen untersucht. Zur Synthese der Benzothiazoliumderivate wurden zunächst substituierte Benzothiazole nach verschiedenen Verfahren hergestellt, diese mit den entsprechenden Benzylbromiden quaternisiert und die N-quaternären Bromide zu den Hexafluorophosphaten bzw. –antimonaten umgesalzt. Neben den niedermolekularen Benzothiazoliumsalzen wurden auch Copolymere mit dieser Struktur in der Seitenkette durch radikalische Copolymerisation vinylsubstituierter N-quaternärer Benzothiazoliumsalze mit MMA hergestellt. Sowohl die niedermolekularen als auch die polymergebundenen Benzothiazoliumhexafluorophosphate erwiesen sich als effektive direkte kationische Photo- und Thermoinitiatoren für die Polymerisation von Epoxiden. Durch die Einführung auxochromer Ethergruppierungen konnte eine bathochrome Verschiebung der UV-Absorptionswellenlänge des energieärmsten elektronischen Überganges erreicht werden. Kinetische IR-Studien der kationischen Polymerisation von Glycidylphenylether (GPE) im Nassfilm unter Bestrahlung in Gegenwart der hergestellten Benzothiazoliumsalze als Photoinitiatoren zeigten dass durch die so erreichte verbesserte Ausnutzung der einwirkenden Strahlung die kationische Photoinitiatoreffektivität deutlich gesteigert werden konnte. Der Zusatz eines photolytischen Radikalbildners führte zu einer weiteren Steigerung der Photopolymerisationsgeschwindigkeit und zu einer Umkehr der beobacheteten Initiatoreffektivitäten. UV-, 1H NMR-, sowie MALDI-TOF- Untersuchungen, sowie die vollständige Unterdrückung der Photopolymerisation durch den Protonenfänger DBP deuten auf die photolytische Generierung von Protonen als initiierende Spezies der photokationischen Polymerisation und DSC- und 1H-NMR Ergebnisse auf die thermische Generierung von Benzylkationen als initiierende Spezies der thermischen Polymerisation hin.