DNA block copolymers - synthesis, morphologies and applications

The last decades have witnessed significant and rapid progress in polymer chemistry and molecular biology. The invention of PCR and advances in automated solid phase synthesis of DNA have made this biological entity broadly available to all researchers across biological and chemical sciences. Thanks to the development of a variety of polymerization techniques, macromolecules can be synthesized with predetermined molecular weights and excellent structural control. In recent years these two exciting areas of research converged to generate a new type of nucleic acid hybrid material, consisting of oligodeoxynucleotides and organic polymers. By conjugating these two classes of materials, DNA block copolymers are generated exhibiting engineered material properties that cannot be realized with polymers or nucleic acids alone. Different synthetic strategies based on grafting onto routes in solution or on solid support were developed which afforded DNA block copolymers with hydrophilic, hydrophobic and thermoresponsive organic polymers in good yields. Beside the preparation of DNA block copolymers with a relative short DNA-segment, it was also demonstrated how these bioorganic polymers can be synthesized exhibiting large DNA blocks (>1000 bases) applying the polymerase chain reaction. Amphiphilic DNA block copolymers, which were synthesized fully automated in a DNA synthesizer, self-assemble into well-defined nanoparticles. Hybridization of spherical micelles with long DNA templates that encode several times the sequence of the micelle corona induced a transformation into rod-like micelles. The Watson-Crick motif aligned the hydrophobic polymer segments along the DNA double helix, which resulted in selective dimer formation. Even the length of the resulting nanostructures could be precisely adjusted by the number of nucleotides of the templates. In addition to changing the structural properties of DNA-b-PPO micelles, these materials were applied as 3D nanoscopic scaffolds for organic reactions. The DNA strands of the corona were organized by hydrophobic interactions of the organic polymer segments in such a fashion that several DNA-templated organic reactions proceeded in a sequence specific manner; either at the surface of the micelles or at the interface between the biological and the organic polymer blocks. The yields of reactions employing the micellar template were equivalent or better than existing template architectures. Aside from its physical properties and the morphologies achieved, an important requirement for a new biomaterial is its biocompatibility and interaction with living systems, i.e. human cells. The toxicity of the nanoparticles was analyzed by a cell proliferation assay. Motivated by the non-toxic nature of the amphiphilic DNA block copolymers, these nanoobjects were employed as drug delivery vehicles to target the anticancer drug to a tumor tissue. The micelles obtained from DNA block copolymers were easily functionalized with targeting units by hybridization. This facile route allowed studying the effect of the amount of targeting units on the targeting efficacy. By varying the site of functionalization, i.e. 5’ or 3’, the outcome of having the targeting unit at the periphery of the micelle or in the core of the micelle was studied. Additionally, these micelles were loaded with an anticancer drug, doxorubicin, and then applied to tumor cells. The viability of the cells was calculated in the presence and absence of targeting unit. It was demonstrated that the tumor cells bearing folate receptors showed a high mortality when the targeting unit was attached to the nanocarrier.

Electrostatically self-assembled nanoparticles based on biomolecules

In this work, two different systems were investigated to develop fundamental understanding of the self-assembly behavior of polyelectrolytes and small organic counterions with a certain geometry. Complexes formed were characterized by light scattering in solution, as well as UV-Vis spectroscopy, analytical ultracentrifugation, gel electrophoresis, zeta potential and IR spectroscopy. The morphologies of the aggregates were observed by AFM in dried state on surface. The charge ratio, the valence and the structure of the counterion were shown to represent key parameters in the complexation. The influence of polyelectrolyte type and molecular weights was also determined for the structure formed.rnrnOne system was mainly focused on the association of double-strand DNA with non-intercalating divalent and tetravalent organic counterions. The other model system involved linear NaPSS and oligolysines. In addition, various influences on the morphology of the charged self-assembly complexes in AFM studies were discussed. It was shown that electrostatic self-assembly of DNA and non-intercalating counterions as well as of a linear synthetic polyelectrolyte with oligolysine counterions that can build mutual hydrogen bonds can yield supramolecular aggregates of a defined size. Various morphologies (flower-like, rod-like, toroidal and spherical) of the assemblies were obtained for different combinations of polyelectrolyte and counterions. Results presented in this work are of importance for the fundamental understanding of the association behavior of various polyelectrolytes and organic counterions. The selection of biopolymers for the study may give an opportunity to transfer the basic research results into biological applications, such as gene therapy or drug delivery.rn

Sensing applications of biofunctionalised plasmonic gold nanoparticles

Plasmonische Metallnanopartikel bündeln, verstärken und beeinflussen Licht auf nanoskopischer Ebene. Diese grundlegende Eigenschaft kommt von koheränten, kollektiven Schwingungen der Leitungsbandelektronen, die von einfallendem Licht resonant angeregt und lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) oder ‚Partikelplasmonen‘ genannt werden. Plasmonen in Metallnanopartikeln wurden bisher z.B. zur Erkennen von pathogenen Biomolekülen, bei der photothermischen Therapie und zur Verbesserung der Effizienz von Solarzellen verwendet. In dieser Arbeit werde ich meinen Fokus auf die Synthese und Funktionalisierung von Goldnanopartikeln zur Anwendung als Sensoren legen.rnrnKürzliche Verbesserungen in der nasschemischen Synthese haben zur Herstellung von Goldnanopartikel mit unterschiedlichen Formen und Größen geführt, die sich in ihren Sensoreigenschaften unterscheiden. Unter den unterschiedlichen Sensorgeometrien sind Goldnanostäbchen die bevorzugte Form zur Biomolekül-Sensorik durch LSPR. Nanostäbchen werden durch eine positiv geladene CTAB-Schicht stabilisiert, die Proteine bei neutralem pH-Wert anziehen kann. Die Adsorption und Desorption von Proteinen an der Nanopartikeloberfläche und damit die Bindungskinetiken von Proteinen kann auf Einzelmolekülebene erforscht werden. Ich zeige hier eine Studie mit hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung um einzelne Bindungsereignisse von Fibronectin auf Goldnanostäbchen darzustellen.rnrnGoldnanostäbchen müssen mit spezifischen biologischen Erkennungselementen funktionalisiert werden um eine Analyterkennung oder Proteinwechselwirkung zu erreichen. Ich funktionalisiere Goldnanostäbchen mit kurzen DNA-Sequenzen (Aptamer-Sequenzen und NTA konjugierten Polihymidinen) und habe anhand diese unterschiedlich sensitiven Partikel eine Studie mit verschiedenen Analyten (oder Protein-Protein Wechselwirkungen) erfolgreich durchgeführt.rn rnPlasmonen von Nanopartikel-Clustern koppeln miteinander, was ihre Resonanzenergie ändert. Der kontrollierte Zusammenbau von Nanopartikeln zu Dimeren oder höher geordneten Strukturen wie ‚Core-Satellites‘ können dazu dienen ihre Sensitivität zu erhöhen. Diese Cluster bieten eine hohe Sensitivität auf Grund der Anwesenheit von plasmonischen Hotspots in der Lücke zwischen zwei Partikeln. Die Plasmonkopplung ist ein Phänomen, das abhängig vom Abstand zweier Partikel zueinander ist und bildet somit die Basis von sogenannten Plasmon-Linealen. Ich habe eine Strategie entwickelt um Dimere aus Hsp90 funktionalisierten Goldnanosphären zu bilden. Diese Technik wird nicht durch Ausbleichen oder das Blinken von Farbstoffen limitiert und ich zeige zum ersten Mal wie man dadurch dynamische Proteinkonformationen untersuchen kann.rn

Analysis of zinc oxide nanoparticles as a potential mutagen of respiratory epithelia

Metallische Nanopartikel und ihre Oxide (z.B. ZnO NP, TiO2 NP und Fe2O3 NP) werden aufgrund ihrer chemischen und physikalischen Eigenschaften häufig als Additive in der Reifenproduktion, in Katalysatoren, Lebensmitteln, Arzneimitteln und Kosmetikprodukten verwendet. Künftig wird ein kontinuierlicher Anstieg der industriellen Anwendung (~ 1663 Tonnen im Jahr 2025) mit gesteigerter Freisetzung in die Umwelt erwartet, was zwangsläufig zu einer vermehrten Aufnahme über das respiratorische Epithel führt. Metalldampffieber ist als gesundheitsschädigender Effekt von Metalloxid-haltigen Aerosolen (z.B. ZnO) nach Inhalation bekannt. Immunreaktionen, wie beispielsweise Entzündungen, werden häufig mit der Entstehung von Sauerstoffradikalen (ROS) in Verbindung gebracht, die wiederum zu DNA-Schäden führen können. Drei mögliche Ursachen der Genotoxität werden angenommen: direkte Interaktion von Nanopartikeln mit intrazellulären Strukturen, Interaktion von Ionen dissoziierter Partikel mit intrazellulären Strukturen sowie die Entstehung von ROS initiiert durch Partikel oder Ionen.rnDie vorliegende Studie befasst sich mit den Mechanismen der Genotoxizität von ZnO Nanopartikeln (ZnO NP), als Beispiel für metallische Nanopartikel, im respiratorischen Epithel. In der Studie wurde gezielt die intrazelluläre Aufnahme und Verteilung von ZnO NP, deren Toxizität, deren DNA schädigendes Potential sowie die Aktivierung der DNA damage response (DDR) analysiert.rnEs konnten kaum internalisierte ZnO NP mittels TEM detektiert werden. Innerhalb der ersten Sekunden nach Behandlung mit ZnO NP wurde spektrofluorometrisch ein starker Anstieg der intrazellulären Zn2+ Konzentration gemessen. In unbehandelten Zellen war Zn2+ in granulären Strukturen lokalisiert. Die Behandlung mit ZnO NP führte zu einer Akkumulation von Zn2+ in diesen Strukturen. Im zeitlichen Verlauf verlagerten sich die Zn2+-Ionen in das Zytoplasma, sowie in Zellkerne und Mitochondrien. Es wurde keine Kolokalisation von Zn2+ mit den frühen Endosomen und dem endoplasmatischen Retikulum beobachtet. Die Vorbehandlung der Zellen mit Diethylen-triaminpentaessigsäure (DTPA), als extrazellulärem Komplexbildner, verhinderte den intrazellulären Anstieg von Zn2+ nach Behandlung mit den Partikeln.rnDie Behandlung mit ZnO NP resultierte in einer zeit- und dosisabhängigen Reduktion der zellulären Viabilität, während die intrazelluläre ROS-Konzentrationen in den ersten 30 min leicht und anschließend kontinuierlich bis zum Ende der Messung anstiegen. Außerdem verringerte sich das mitochondriale Membranpotential, während sich die Anzahl der frühapoptotischen Zellen in einer zeitabhängigen Weise erhöhte. rnDNA Doppelstrangbrüche (DNA DSB) wurden mittels Immunfluoreszenz-Färbung der γH2A.X foci sichtbar gemacht und konnten nach Behandlung mit ZnO NP detektiert werden. Die Vorbehandlung mit dem Radikalfänger N-Acetyl-L-Cytein (NAC) resultierte in stark reduzierten intrazellulären ROS-Konzentrationen sowie wenigen DNA DSB. Die DNA Schädigung wurde durch Vorbehandlung mit DTPA ganz verhindert.rnDie Aktivierung der DDR wurde durch die Analyse von ATM, ATR, Chk1, Chk2, p53 und p21 mittels Western Blot und ELISA nach Behandlung mit ZnO NP überprüft. Der ATR/Chk1 Signalweg wurde durch ZnO NP nicht aktiviert. Die Komplexierung von Zn2+ resultierte in einer verminderten ATM/Chk2 Signalwegaktivierung. Es zeigte sich, dass das Abfangen von ROS keinen Effekt auf die ATM/Chk2 Signalwegaktivierung hatte.rnZusammengefasst wurde festgestellt, dass die Exposition mit ZnO NP in der Entstehung von ROS, reduzierter Viabilität und vermindertem mitochondrialem Membranpotential resultiert, sowie zeitabhängig eine frühe Apoptose initiiert. ZnO NP dissoziierten extrazellulär und wurden schnell als Zn2+ über unbekannte Mechanismen internalisiert. Die Zn2+-Ionen wurden im Zytoplasma, sowie besonders in den Mitochondrien und dem Zellkern, akkumuliert. Die DDR Signalgebung wurde durch ZnO NP aktiviert, jedoch nicht durch NAC inhibiert. Es wurde gezeigt, dass DTPA die DDR Aktivierung komplett inhibierte. Die Behandlung mit ZnO NP induzierte DNA DSB. Die Inhibition von ROS reduzierte die DNA DSB und die Komplexierung der Zn2+ verhinderte die Entstehung von DNA DSB.rnDiese Daten sprechen für die Dissoziation der Partikel und die hierbei freigesetzten Zn2+ als Hauptmediator der Genotoxizität metallischer Nanopartikel. rn