Analysis of zinc oxide nanoparticles as a potential mutagen of respiratory epithelia

Metallische Nanopartikel und ihre Oxide (z.B. ZnO NP, TiO2 NP und Fe2O3 NP) werden aufgrund ihrer chemischen und physikalischen Eigenschaften häufig als Additive in der Reifenproduktion, in Katalysatoren, Lebensmitteln, Arzneimitteln und Kosmetikprodukten verwendet. Künftig wird ein kontinuierlicher Anstieg der industriellen Anwendung (~ 1663 Tonnen im Jahr 2025) mit gesteigerter Freisetzung in die Umwelt erwartet, was zwangsläufig zu einer vermehrten Aufnahme über das respiratorische Epithel führt. Metalldampffieber ist als gesundheitsschädigender Effekt von Metalloxid-haltigen Aerosolen (z.B. ZnO) nach Inhalation bekannt. Immunreaktionen, wie beispielsweise Entzündungen, werden häufig mit der Entstehung von Sauerstoffradikalen (ROS) in Verbindung gebracht, die wiederum zu DNA-Schäden führen können. Drei mögliche Ursachen der Genotoxität werden angenommen: direkte Interaktion von Nanopartikeln mit intrazellulären Strukturen, Interaktion von Ionen dissoziierter Partikel mit intrazellulären Strukturen sowie die Entstehung von ROS initiiert durch Partikel oder Ionen.rnDie vorliegende Studie befasst sich mit den Mechanismen der Genotoxizität von ZnO Nanopartikeln (ZnO NP), als Beispiel für metallische Nanopartikel, im respiratorischen Epithel. In der Studie wurde gezielt die intrazelluläre Aufnahme und Verteilung von ZnO NP, deren Toxizität, deren DNA schädigendes Potential sowie die Aktivierung der DNA damage response (DDR) analysiert.rnEs konnten kaum internalisierte ZnO NP mittels TEM detektiert werden. Innerhalb der ersten Sekunden nach Behandlung mit ZnO NP wurde spektrofluorometrisch ein starker Anstieg der intrazellulären Zn2+ Konzentration gemessen. In unbehandelten Zellen war Zn2+ in granulären Strukturen lokalisiert. Die Behandlung mit ZnO NP führte zu einer Akkumulation von Zn2+ in diesen Strukturen. Im zeitlichen Verlauf verlagerten sich die Zn2+-Ionen in das Zytoplasma, sowie in Zellkerne und Mitochondrien. Es wurde keine Kolokalisation von Zn2+ mit den frühen Endosomen und dem endoplasmatischen Retikulum beobachtet. Die Vorbehandlung der Zellen mit Diethylen-triaminpentaessigsäure (DTPA), als extrazellulärem Komplexbildner, verhinderte den intrazellulären Anstieg von Zn2+ nach Behandlung mit den Partikeln.rnDie Behandlung mit ZnO NP resultierte in einer zeit- und dosisabhängigen Reduktion der zellulären Viabilität, während die intrazelluläre ROS-Konzentrationen in den ersten 30 min leicht und anschließend kontinuierlich bis zum Ende der Messung anstiegen. Außerdem verringerte sich das mitochondriale Membranpotential, während sich die Anzahl der frühapoptotischen Zellen in einer zeitabhängigen Weise erhöhte. rnDNA Doppelstrangbrüche (DNA DSB) wurden mittels Immunfluoreszenz-Färbung der γH2A.X foci sichtbar gemacht und konnten nach Behandlung mit ZnO NP detektiert werden. Die Vorbehandlung mit dem Radikalfänger N-Acetyl-L-Cytein (NAC) resultierte in stark reduzierten intrazellulären ROS-Konzentrationen sowie wenigen DNA DSB. Die DNA Schädigung wurde durch Vorbehandlung mit DTPA ganz verhindert.rnDie Aktivierung der DDR wurde durch die Analyse von ATM, ATR, Chk1, Chk2, p53 und p21 mittels Western Blot und ELISA nach Behandlung mit ZnO NP überprüft. Der ATR/Chk1 Signalweg wurde durch ZnO NP nicht aktiviert. Die Komplexierung von Zn2+ resultierte in einer verminderten ATM/Chk2 Signalwegaktivierung. Es zeigte sich, dass das Abfangen von ROS keinen Effekt auf die ATM/Chk2 Signalwegaktivierung hatte.rnZusammengefasst wurde festgestellt, dass die Exposition mit ZnO NP in der Entstehung von ROS, reduzierter Viabilität und vermindertem mitochondrialem Membranpotential resultiert, sowie zeitabhängig eine frühe Apoptose initiiert. ZnO NP dissoziierten extrazellulär und wurden schnell als Zn2+ über unbekannte Mechanismen internalisiert. Die Zn2+-Ionen wurden im Zytoplasma, sowie besonders in den Mitochondrien und dem Zellkern, akkumuliert. Die DDR Signalgebung wurde durch ZnO NP aktiviert, jedoch nicht durch NAC inhibiert. Es wurde gezeigt, dass DTPA die DDR Aktivierung komplett inhibierte. Die Behandlung mit ZnO NP induzierte DNA DSB. Die Inhibition von ROS reduzierte die DNA DSB und die Komplexierung der Zn2+ verhinderte die Entstehung von DNA DSB.rnDiese Daten sprechen für die Dissoziation der Partikel und die hierbei freigesetzten Zn2+ als Hauptmediator der Genotoxizität metallischer Nanopartikel. rn

Metallic nanoparticles including their oxides (e.g., ZnO NP, TiO2 NP, and Fe2O3 NP) are widely used as additives in rubber industry, catalysts, foods, pharmaceuticals and cosmetics, because of their chemical and physical properties. Prospectively, a continuous rise of industrial application (~1663 tons in 2025) is estimated with an increasing release into the environment, and further unavoidable intake by humans e.g., through the respiratory epithelia. Acute metal fume fever is known as an adverse health effect of aerosol inhalation containing metal oxides (e.g., ZnO). Immune responses such as inflammation are often associated with the generation of reactive oxygen species (ROS), which possibly initiate DNA damages. Three reasons of genotoxicity are assumed: direct interaction of nanoparticles with intracellular structures, interactions of dissociated ions from particles, and the generation of ROS initiated by the particles or ions.rnThe present study paid particular attention to the mechanisms of genotoxicity in respiratory epithelia exposed to zinc oxide nanoparticles (ZnO NP), as example for metallic nanoparticles. The study aimed to investigate the intracellular ZnO NP uptake and distribution, toxicity, DNA damaging potential, and DNA damage response (DDR) activation.rnInternalized ZnO NP were infrequently detected by TEM. Strongly increased intracellular Zn2+ levels were measured in the first seconds after treatment with ZnO NP by spectrofluorometry. In untreated cells Zn2+ is located in granular structures at basal levels. Treatment with ZnO NP led to an accumulation of Zn2+ in these structures. In the period of time, Zn2+ shifted to the cytoplasm, nucleus, and mitochondria. No co-localization of Zn2+ with early endosomes and endoplasmatic reticulum was detected. Pretreatment of the cells with the extracellular chelator diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA) prevented intracellular Zn2+ increase after particle treatment.rnZnO NP treatment resulted in a time- and concentration-dependent reduction of cellular viability, while ROS-levels increased slightly in first 30 min and continuously afterwards until end of measurement. Furthermore, the mitochondrial membrane potential decreased whereas the amount of early apoptotic cells raised in a time-dependent manner.rnDNA double strand breaks (DNA DSB) were detected after ZnO NP treatment by visualization of γH2A.X foci. Pretreatment with the ROS scavenger N-acetyl-L-cysteine (NAC) resulted in strongly decreased intracellular ROS-levels as well as reduced DNA DSB. However, pretreatment with DTPA prevented DNA damages entirely. rnThe activation of the DDR was shown by analysis of ATM, ATR, Chk1, Chk2, p53, and p21 after ZnO NP exposure performing Western blots and ELISA measurements. In contrast, the ATR/Chk1 pathway was not activated by ZnO NP. The complexation of Zn2+ resulted in impaired ATM/Chk2 pathway activation. However, ROS scavenging had no effect on ATM/Chk2 pathway activation, i.e., signaling remained activated. rnAltogether, it was found that ZnO NP treatment resulted in increased intracellular ROS-levels, reduced viability and decreased mitochondrial membrane potential, and they initiated early apoptosis in a time-dependent manner. ZnO NP dissociated extracellular and Zn2+ were quickly internalized by an unknown mechanism. The Zn2+ ions were accumulated in the cytoplasm, the nucleus, and the mitochondria. DDR signaling was activated by ZnO NP but not inhibited by NAC, while a completely inhibition of DDR activation was shown after pretreatment with DTPA. Treatment with ZnO NP generated DNA DSB. ROS scavenging reduced DNA DSB, and Zn2+ complexation prevented DNA DSB. rnThese data suggest particle dissociation and the released Zn2+ seems to be the main mechanism of metallic nanoparticle genotoxicity. rn