Isolation and identification of molecular partners of the proteins encoded by the Drosophila tumor suppressor gene lethal(2)tumorous imaginal discs

Ziel dieser Arbeit war es, die funktionelle Bedeutung des Drosophila melanogaster tumor suppressor Gens lethal(2)tumorous imaginal discs (l(2)tid) durch die Identifikation von molekularen Partnern der vom Gen kodierten Proteine zu etablieren. Mit dem Screening einer Expressionsbibliothek mittels des Hefe-Di-Hybrid-Systems wurde das Protein Patched (Ptc) als ein neues Tid-bindendes Protein identifiziert. Ptc ist ein Zentralregulator der Hedhehog-Signalkette. Diese ist in der Entwicklung konserviert und in manchen humanen Krebsarten verwickelt. Die Tid/Ptc-Interaktion wurde mittels unabhängigen biochemischen Methoden wie dem GST-pulldown-Test oder der Immunopräzipitation überprüft. Außerdem ergaben funktionelle Studien in tumorosen Imaginalscheiben einen möglichen inhibitorischen Effekt von Tid über die Hh Signaltransduktion.Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen Tid und dem E-APC-Protein (Adenomatous polyposis coli) bewiesen. Polakis und seine Gruppe zeigten durch Studien mit dem Hefe-Di-Hybrid-System und in vitro, dass das hTid mit dem APC-Protein interagiert. Um dies auch auf Drosophila-Ebene zu überprüfen, wurden Immunopräzipitation-Studien mit den Drosophila-Gegenstücken durchgeführt. Diese Studien zeigen zum ersten Mal eine direkte Interaktion beider Proteine in vivo.

Charakterisierung der Vinorin-Synthase aus Rauvolfia serpentina durch Reinigung, Expression, Mutation und Kristallisation

ABSTRACTDie vorliegende Arbeit befasste sich mit der Reinigung,heterologen Expression, Charakterisierung, molekularenAnalyse, Mutation und Kristallisation des EnzymsVinorin-Synthase. Das Enzym spielt eine wichtige Rolle inder Ajmalin-Biosynthese, da es in einerAcetyl-CoA-abhängigen Reaktion die Umwandlung desSarpagan-Alkaloids 16-epi-Vellosimin zu Vinorin unterBildung des Ajmalan-Grundgerüstes katalysiert. Nach der Reinigung der Vinorin-Synthase ausHybrid-Zellkulturen von Rauvolfia serpentina/Rhazya strictamit den fünf chromatographischen TrennmethodenAnionenaustauschchromatographie an SOURCE 30Q, HydrophobeInteraktionen Chromatographie an SOURCE 15PHE,Chromatographie an MacroPrep Ceramic Hydroxyapatit,Anionenaustauschchromatographie an Mono Q undGrößenausschlußchromatographie an Superdex 75 konnte dieVinorin-Synthase aus 2 kg Zellkulturgewebe 991fachangereichert werden.Das nach der Reinigung angefertigte SDS-Gel ermöglichte eineklare Zuordnung der Protein-Bande als Vinorin-Synthase.Der Verdau der Enzymbande mit der Endoproteinase LysC unddie darauffolgende Sequenzierung der Spaltpeptide führte zuvier Peptidsequenzen. Der Datenbankvergleich (SwissProt)zeigte keinerlei Homologien zu Sequenzen bekannterPflanzenenzyme. Mit degenerierten Primern, abgeleitet voneinem der erhaltenen Peptidfragmente und einer konserviertenRegion bekannter Acetyltransferasen gelang es, ein erstescDNA-Fragment der Vinorin-Synthase zu amplifizieren. Mit derMethode der RACE-PCR wurde die Nukleoidsequenzvervollständigt, was zu einem cDNA-Vollängenklon mit einerGröße von 1263 bp führte, der für ein Protein mit 421Aminosäuren (46 kDa) codiert.Das Vinorin-Synthase-Gen wurde in den pQE2-Expressionsvektorligiert, der für einen N-terminalen 6-fachen His-tagcodiert. Anschließend wurde sie erstmals erfolgreich in E.coli im mg-Maßstab exprimiert und bis zur Homogenitätgereinigt. Durch die erfolgreiche Überexpression konnte dieVinorin-Synthase eingehend charakterisiert werden. DerKM-Wert für das Substrat Gardneral wurde mit 20 µM, bzw.41.2 µM bestimmt und Vmax betrug 1 pkat, bzw. 1.71 pkat.Nach erfolgreicher Abspaltung des His-tags wurden diekinetischen Parameter erneut bestimmt (KM- Wert 7.5 µM, bzw.27.52 µM, Vmax 0.7 pkat, bzw. 1.21 pkat). Das Co-Substratzeigt einen KM- Wert von 60.5 µM (Vmax 0.6 pkat). DieVinorin-Synthase besitzt ein Temperatur-Optimum von 35 °Cund ein pH-Optimum bei 7.8.Homologievergleiche mit anderen Enzymen zeigten, dass dieVinorin-Synthase zu einer noch kleinen Familie von bisher 10Acetyltransferasen gehört. Alle Enzyme der Familie haben einHxxxD und ein DFGWG-Motiv zu 100 % konserviert. Basierendauf diesen Homologievergleichen und Inhibitorstudien wurden11 in dieser Proteinfamilie konservierte Aminosäuren gegenAlanin ausgetauscht, um so die Aminosäuren einer in derLiteratur postulierten katalytischen Triade(Ser/Cys-His-Asp) zu identifizieren.Die Mutation aller vorhandenen konservierten Serine undCysteine resultierte in keiner Mutante, die zumvollständigen Aktivitätsverlust des Enzyms führte. Nur dieMutationen H160A und D164A resultierten in einemvollständigen Aktivitätsverlust des Enzyms. Dieses Ergebniswiderlegt die Theorie einer katalytischen Triade und zeigte,dass die Aminosäuren H160A und D164A exklusiv an derkatalytischen Reaktion beteiligt sind.Zur Überprüfung dieser Ergebnisse und zur vollständigenAufklärung des Reaktionsmechanismus wurde dieVinorin-Synthase kristallisiert. Die bis jetzt erhaltenenKristalle (Kristallgröße in µm x: 150, y: 200, z: 200)gehören der Raumgruppe P212121 (orthorhombisch primitiv) anund beugen bis 3.3 Å. Da es bis jetzt keine Kristallstruktureines zur Vinorin-Synthase homologen Proteins gibt, konntedie Struktur noch nicht vollständig aufgeklärt werden. ZurLösung des Phasenproblems wird mit der Methode der multiplenanomalen Dispersion (MAD) jetzt versucht, die ersteKristallstruktur in dieser Enzymfamilie aufzuklären.

optomotor-blind and the horizontal and vertical system cells of the drosophila optic lobes

The horizontal and vertical system neurons (HS and VS cells) are part of a conserved set of lobula plate giant neurons (LPGNs) in the optic lobes of the adult brain. Structure and physiology of these cells are well known, predominantly from studies in larger Dipteran flies. Our knowledge about the ontogeny of these cells is limited and stems predominantly from laser ablation studies in larvae of the house fly Musca domestica. These studies suggested that the HS and VS cells stem from a single precursor, which, at least in Musca, has not yet divided in the second larval instar. A regulatory mutation (In(1)omb[H31]) in the Drosophila gene optomotor-blind (omb) leads to the selective loss of the adult HS and VS cells. This mutation causes a transient reduction in omb expression in what appears to be the entire optic lobe anlage (OLA) late in embryogenesis. Here, I have reinitiated the laser approach with the goal of identifying the presumptive embryonic HS/VS precursor cell in Drosophila. The usefulness of the laser ablation approach which has not been applied, so far, to cells lying deep within the Drosophila embryo, was first tested on two well defined embryonic sensory structures, the olfactory antenno-maxillary complex (AMC) and the light-sensitive Bolwing´s organ (BO). In the case of the AMC, the efficiency of the ablation procedure was demonstrated with a behavioral assay. When both AMCs were ablated, the response to an attractive odour (n-butanol) was clearly reduced. Interestingly, the larvae were not completely unresponsive but had a delayed response kinetics, indicating the existence of a second odour system. BO will be a useful test system for the selectivity of laser ablation when used at higher spatial resolution. An omb-Gal4 enhancer trap line was used to visualize the embryonic OLA by GFP fluorescence. This fluorescence allowed to guide the laser beam to the relevant structure within the embryo. The success of the ablations was monitored in the adult brain via the enhancer trap insertion A122 which selectively visualizes the HS and VS cell bodies. Due to their tight clustering, individual cells could not be identified in the embryonic OLA by conventional fluorescence microscopy. Nonetheless, systematic ablation of subdomains of the OLA allowed to localize the presumptive HS/VS precursor to a small area within the OLA, encompassing around 10 cells. Future studies at higher resolution should be able to identify the precursor as (an) individual cell(s). Most known lethal omb alleles do not complement the HS/VS phenotype of the In(1)omb[H31] allele. This is the expected behaviour of null alleles. Two lethal omb alleles that had been isolated previously by non-complementation of the omb hypomorphic allele bifid, have been reported, however, to complement In(1)omb[H31]. This report was based on low resolution paraffin histology of adult heads. Four mutations from this mutagenesis were characterized here in more detail (l(1)omb[11], l(1)omb[12], l(1)omb[13], and l(1)omb[15]). Using A122 as marker for the adult HS and VS cells, I could show, that only l(1)omb[11] can partly complement the HS/VS cell phenotype of In(1)omb[H31]. In order to identify the molecular lesions in these mutants, the exons and exon/intron junctions were sequenced in PCR-amplified material from heterozygous flies. Only in two mutants could the molecular cause for loss of omb function be identified: in l(1)omb[13]), a missense mutation causes the exchange of a highly conserved residue within the DNA-binding T-domain; in l(1)omb[15]), a nonsense mutation causes a C-terminal truncation. In the other two mutants apparently regulatory regions or not yet identified alternative exons are affected. To see whether mutant OMB protein in the missense mutant l(1)omb[13] is affected in DNA binding, electrophoretic shift assays on wildtype and mutant T-domains were performed. They revealed that the mutant no longer is able to bind the consensus palindromic T-box element.

Identifizierung einer Mutation im Exon 2 des C1q-B-Ketten-Gens als Ursache eines hereditären C1q-Defekts mit Ausbildung einer SLE-ähnlichen Symptomatik

Komplementdefizienzen gehen mit einer erhöhten Infektionsanfälligkeit gegenüber bestimmten Krankheitserregern in den ersten Lebensjahren (MBL-Defizienz) und darüber hinaus (C1q- und anderen Komplementdefizienten) einher. Dies unterstreicht die Rolle des Komplementsystems als effektiver Abwehrmechanismus in der Übergangsphase zwischen Verlust des „mütterlichen Nestschutzes“ und Ausreifung der eigenen „erworbenen“ Immunität. Das Auftreten von Autoimmunerkrankungen wie dem SLE-ähnlichen Syndrom bei Defizienzen des Klassischen Weges beleuchten zusätzliche Funktionen des Komplementsystems während der Ausreifung der erworbenen Immunität und als wesentlicher Effektor in der Erkennung apoptotischer Zellen und deren Eliminierung aus dem System.rnHereditäre C1q-Defizienzen gehen mit einer hohen Wahrscheinlichkeit mit einem SLE-ähnlichen Syndrom einher. Sie stellen unter den Defizienzen des Komplementsystems eines Seltenheit dar, ihr klinisches „Gesicht“ ist umso eindrucksvoller. Sie sind von der funktionellen C1q-Defizienz im Rahmen eines erhöhten „turnover“ und in der Folge einer C1q-Autoantokörperbildung abzugrenzen. Ursächlich ist ihnen eine Mutation in einem der drei C1q-Gene, die auf dem Chromosom 1 lokalisiert sind. Homozygote Mutationsträger können den Defekt nicht ausgleichen und zeigen eine C1q-Defizienz mit Verlust der gesamthämolytischen Aktivität CH50. Häufungen treten bei Nachkommen von Geschwister- und Verwandtschaftsehen auf.rnrnIn dieser Arbeit wird der Fall einer Patientin mit einem schweren, frühkindlich einsetzenden, SLE-ähnlichen Syndrom aufgearbeitet. Als Ursache für eine Erkrankung konnte ein hereditärer C1q-Defekt, ohne immunologischem Nachweis eines C1q oer LMQ-C1q, identifiziert werden. Da sich keine der vorab beschriebenen Mutatonsmuster bei der Patientin detektieren ließ, erfolgte die Sequenzierung aller drei C1q-Gene. Dadurch ließ sich ein neues Mutationsmuster darstellen.rnrnDie in dieser Arbeit vorgestellte Mutation unterscheidet sich von den bislang beschriebenen Mutationen dadurch, dass es sich nicht um eine Punktmutation, sonder um eine Deletion von 29 Basen (c283_311) im Exon 2 des C1q-B-Ketten-Gens mit einhergehendem Rasterschub und vorzeitigem Stop-Codon (pMet95TrpfsX8) handelt. Durch die Analyse der Eltern und Geschwister der betroffenen Patientin konnte der Vererbungsweg dargestellt werden. Zudem gelang es die Mutation im Rahmen einer Pränataldiagnostik bei einem „ungeborenen“ Geschwisterkind auszuschließen.rn

Untersuchung der physiologischen Rolle des Wilms-Tumorgens 1 (WT1) im Rahmen der Generierung muriner in-vivo-Modelle für die Wilms-Tumorerkrankung

Der Wilms-Tumor ist eine embryonale Tumorerkrankung der Niere, als deren Ursprung Nierenvorläuferzellen des metanephrischen Mesenchyms gelten, deren Differenzierung während der frühen Nephrogenese ausbleibt und aus denen nachfolgend durch eine maligne Transformation Wilms-Tumore entstehen. Zwei Gene, die an der Wilms-Tumorgenese beteiligt zu sein scheinen, sind WT1 (Wilms-Tumorgen 1) und CTNNB1 (Catenin, cadherin-associated protein, beta 1). Während WT1 u.a. die Differenzierung des metanephrischen Mesenchyms steuert, begünstigen aktivierende Mutationen von CTNNB1 und eine dadurch bedingte Akkumulation seines Proteins β-Catenin die Tumorgenese vieler Organe. So verwundert es nicht, dass eine alleinige heterozygote Keimbahnmutation von WT1, die einen dominant-negativen Effekt auf funktionsfähiges WT1 ausübt, häufig zur Entstehung von Wilms-Tumoren in Patienten mit Denys-Drash-Syndrom (DDS) führt, sowie in etwa 15 % aller sporadischen Wilms-Tumore WT1 und CTNNB1 mutiert sind.rnDer Mechanismus der Entstehung von Wilms-Tumoren ist weitgehend unbekannt, was u.a. daran liegt, dass homozygote Wt1-Mutationen in der Maus embryonal (~ Tag 13,5 d.p.c.) letal sind. In der vorliegenden Arbeit sollten daher mit Hilfe einer Wt1 k.o.-Effektormaus (WE2) vier murine konditional reversible Wilms-Tumor-Modelle auf Basis des Tet off-Systems hergestellt werden. Dadurch lag in den zu generierenden Tieren Wt1 durch die Integration des WE2-Transgens zwar nur heterozygot mutiert vor, doch durch den endogenen Wt1-Promotor des Transgens sollte es zur zeitlichen und räumlichen Wt1-analogen Expression eines tetrazyklinabhängigen Transaktivators (tTA) kommen, der ohne die Gabe von Doxycyclin Tet-regulierbare Transgene in Wt1-exprimierenden Zellen aktivieren kann, die einen positiven Einfluss auf die Wilms-Tumorgenese haben könnten. So sollte durch das WE2 DDS-Modell ein DDS simuliert werden und es in Tieren der Modelle WE2 TC bCat∆Ex3, WE2 LC bCat∆Ex3 und WE2 Wnt1 zur Akkumulation von β-Catenin in Wt1-exprimierenden Nierenvorläuferzellen kommen, so dass deren Differenzierung ausbleibt und es durch eine maligne Transformation zur Entstehung eines Wilms-Tumors kommt.rnrnMit Hilfe von histologischen Analysen an entsprechenden Responder-Linien konnte zunächst gezeigt werden, dass die embryonale und adulte Expressionsdomäne des WE2-Effektors mit der von endogenen Wt1 übereinstimmt. Gleichzeitig wurden aber auch neue Expressionsorte von Wt1 nachgewiesen. So konnte die Expression des WE2-Effektors z.B. im Endothel der dorsalen Aorta detektiert werden, der als Entstehungsort von hämatopoetischen Stammzellen gilt. Anschließende hier vorgestellte Experimente zeigten, dass Wt1 direkt an diesem Prozess beteiligt ist und belegten eine noch nicht beschriebene Funktion von Wt1 in der frühen Hämatopoese.rnEs war jedoch mit keinem System möglich, eine Wilms-Tumorerkrankung zu simulieren. Während Tiere des WE2 DDS-Modells trotz nachweisbarer Induktion keinen Phänotyp aufwiesen, war wohl in den anderen Modellen eine konstitutive β-Catenin-Aktivierung in der Frühschwangerschaft nicht mit dem embryonalen Überleben vereinbar. Dabei schienen alle tripeltransgenen bzw. doppeltransgenen Embryonen, in denen durch einen frühen Doxycyclinentzug die Entstehung von Wilms-Tumoren möglich gewesen wäre, intrauterin zu sterben. Wurde dagegen Doxycyclin erst in der dritten Lebenswoche entzogen, so entwickelten die Tiere durch eine Wt1-vermittelte β-Catenin-Aktivierung Granulosazelltumore, polyzystische Nieren und Veränderungen der Hoden. Da alle diese organischen Veränderungen während der prä- bis frühen postnatalen Phase induziert wurden, schien die Doxycyclinmenge nicht auszureichen, um eine β-Catenin-Aktivierung zu verhindern. Es hätte also auch zur Entstehung von Wilms-Tumoren kommen können, so dass diese Ergebnisse darauf hinweisen, dass eine β-Catenin-Aktivierung wahrscheinlich nicht der physiologisch entscheidende Schritt bei der Entstehung eines Wilms-Tumors ist.rnrnDie Charakterisierung der WE2-Effektormaus und die Herstellung und Analysen der Systeme geben damit Einblick in die WT1- bzw. WT1/CTNNB1-assoziierte Wilms-Tumorgenese und ermöglichen die weitere Erforschung von Granulosazelltumoren, polyzystsischen Nieren, Veränderungen von Hoden und der Rolle von WT1 in der frühen Hämatopoese.rn

Akkumulation von Splenozyten mit immunsuppressiven Eigenschaften in mastzelllosen Mäusen mit Kit-W-sh-Mutation

Mutationen, die zu einer reduzierten Aktivität der Tyrosinkinase c-Kit führen, können zum Verlust von Mastzellen führen, weshalb entsprechende Mausstämme intensiv zur Erforschung von Mastzellfunktionen verwendet werden. C-Kit ist der Rezeptor für den in der Hämatopoese essentiellen Stammzellfaktor (SCF) und die vorliegende Arbeit hatte daher das Ziel, mögliche weitere Auswirkungen der Mutation KitW-sh auf die Hämatopoese in Mäusen zu untersuchen. Es zeigte sich, dass die KitW-sh-Mutation zu einer ausgeprägten extramedullären Hämatopoese in der Milz führt. Dies ist durch das vermehrte Vorkommen von hämatopoetischen Stammzellen und Vorläufern der myeloiden Zellreihe charakterisiert, die alle eine reduzierte Expression von c-Kit aufweisen. Detailiert untersucht wurde eine massiv expandierte Zellpopulation mit dem Phänotyp neutrophiler Granulozyten in den Milzen naiver KitW-sh-Mäuse. Es handelt sich hierbei jedoch um Zellen mit immunsuppressiven Eigenschaften, die in Wildtypmäusen typischerweise während der Entwicklung von Tumoren expandieren und als "myeloid-derived suppressor cells" (MDSC) angesprochen werden, eine phänotypisch und funktionell heterogene Zellgruppe. Die entsprechenden Zellen aus naiven KitW sh-Mäusen wurden als granulozytär-(G)-MDSC-ähnlichen Zellen bezeichnet, da sie in der Lage sind, in vitro die Proliferation von T-Zellen durch die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies zu hemmen und nach Transfer in tumortragende Wildtypmäuse das Tumorwachstum zu begünstigen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit unserer Beobachtung, dass der Transfer einer Karzinom-Zelllinie in KitW-sh-Mäusen zur Bildung größerer Tumore führt als in entsprechenden Wildtyp-Kontrolltieren, unabhängig von der Abwesenheit von Mastzellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen einen starken Einfluss der KitW-sh-Mutation nicht nur auf die Entwicklung von Mastzellen, sondern auch auf die extramedulläre Myelopoese. Die Expansion G-MDSC-ähnlicher Zellen mit potentiell immunsuppressiven Eigenschaften kann die Verwendung von KitW-sh-Mäusen für die gezielte Untersuchung Mastzell-spezifischer Phänomene einschränken.