Phylogenetische Charakterisierung von Mikroorganismen aus dem Intestinaltrakt von Insekten

Zusammenfassung Die komplexe Lebensgemeinschaft des Termitendarms fasziniert die Biologen schon seit langem. Es ist bekannt, dass Termiten ihre Nahrung mit Hilfe von symbiontischen Bakterien und Protozoen verdauen können. Ohne ihre Symbionten würden sie verhungern. Das Zusammenspiel von Termiten und darmbewohnenden Mikroorganismen, zu denen Flagellaten, Bakterien, Archaebakterien und Hefen gehören, ist trotz moderner Untersuchungstechniken keineswegs vollständig aufgeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurden:1) Einige kultivierte und nicht-kultivierte Bakterien charakterisiert, die an der Darmwand von Mastotermes darwiniensis lokalisiert sind. Die Darmwandbakterien wurden entweder nach Kultivierung oder direkt von der Darmwand für die Analyse der 16S rDNA verwendet. Die Sequenzierung erfolgte entweder nach DGGE oder nach Klonierung der PCR-Produkte. Die identifizierten Bakterien kann man in 7 Gruppen teilen:1: Gram-positive Bakterien mit hohem GC-Gehalt 2: Gram-positive Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt 3: Fusobakterien-ähnliche Bakterien 4: ß-Proteobakterien5: Verrucomicrobien6: Bacteroides-ähnliche Bakterien7: Methanogene Bakterien 2) Aufgrund des Vorhandenseins des Coenzyms Deazaflavin-Derivats F420, kann man Methanbakterien mikroskopisch identifizieren und von anderen Bakterien unterscheiden, weil Methanbakterien im kurzwelligen Blaulicht blaugrün aufleuchten. Untersuchungen haben gezeigt, dass mindestens zwei Morphotypen von Methanbakterien an der Darmwand von M. darwiniensis vorkommen. Sie wurden auch über 16S rDNA Sequenzanalyse identifiziert. Ihre Lokalisierung an der Darmwand wurde durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridsierung mit spezifischen Oligonukleotiden nachgewiesen. Schließlich konnte gezeigt werden, dass pro Gramm Termite 2,6 µg Methan pro Stunde produziert werden. 3) Bis jetzt wurden aus verschiedenen Termiten sulfatreduzierende Bakterien (SRB) isoliert. Deshalb wurde in dieser Arbeit die Verbreitung der SRB in verschiedenen Insekten untersucht. Insgesamt wurden zwei Sequenzen aus Libellenlarven (FSBO4 und FSBRO2), drei Sequenzen aus Zuckmückenlarven (FSCI, FSCII und FSC4), eine Sequenz aus Rosenkäfern (FSPa4-5) und ebenfalls eine Sequenz aus Eintagsfliegenlarven (FSB6) identifiziert. Alle identifizierten Bakterien ausser Klon FSB6, gehören zur Gattung Desulfovibrio. Klon FSB6 gehört zu der Gram-positiven Gattung Desulfotomaculum.Außerdem wurde die Sulfatreduktionsrate der SRB im Darm von Rosenkäfern (Pachnoda marginata), Holz- bzw. Sulfat-gefütterten Termiten (Mastotermes darwiniensis) und einer Reinkultur von Desulfovibrio intestinalis gemessen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Aktivität pro Zelle in Holz-gefütterten Termite am höchsten ist (4,9 nmol/107 Bakterien x h).

Funktionsaufklärung von Atmungsproteinen in Insekten

Globine sind kleine globuläre Proteine mit nahezu ubiquitärem Vorkommen in allen Tiergruppen. Sie weisen eine typische Sandwichstruktur auf, die in der Regel aus acht α-Helices mit einer zentralen prosthetischen Häm-Gruppe besteht und die Proteine zur Bindung gasförmiger Liganden befähigt. Die Funktionen der Globine reichen von O2-Transport und – Speicherung, über eine Beteiligung bei der Entgiftung reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies bis hin zu sensorischen physiologischen Aufgaben. Innerhalb der Klasse der Insekten schien das Vorhandensein von Globinen zunächst auf Insekten mit offensichtlich hypoxischen Habitaten beschränkt zu sein. Die Entdeckung des Globins glob1 in Drosophila melanogaster deutete jedoch eine sehr viel weitere Verbreitung der Globine in Insekten an, die sich durch die Identifizierung von Globingenen in einer Vielzahl von normoxisch lebenden Insekten, wie z.B. Apis mellifera oder Aedes aegypti bestätigte. D. melanogaster besitzt drei Globine, glob1, glob2 und glob3. Glob1 ist eng mit anderen intrazellulären Insektenglobinen verwandt, was zu der Annahme führte, dass es sich bei glob1 um das ursprüngliche und bei glob2 und glob3 um abgeleitete D. melanogaster Globine handelt. Glob1 wird in allen Entwicklungsstadien exprimiert, wobei die Hauptexpressionsorte der Fettkörper und das Tracheensystem sind. Die Transkription des glob1 startet von zwei alternativen Promotoren (Promotor I und II), wodurch in Kombination mit alternativem Splicing vier Transkriptvarianten (Isoform A-D) entstehen, deren Translation jedoch in einer Proteinvariante (glob1) resultiert. Hypoxische Bedingungen führen zu einer vermutlich HIF (=‚hypoxia-inducible factor‘) -vermittelten Abnahme der glob1 Genexpression, wohingegen Hyperoxie eine leichte Zunahme der glob1 mRNA Menge bewirkt. Der mithilfe des UAS/Gal4- Systems erzeugte, RNAi-vermittelte glob1 Knockdown führt zu einer schlechteren Überlebensrate adulter Fliegen unter hypoxischen Bedingungen, einer verkürzten Erholungszeit nach hypoxischem Stupor in Weibchen sowie zu einer erhöhten Resistenz gegenüber dem ROS (=‘reactive oxygen species‘) -generierenden Herbizid Paraquat in Larven und adulten Weibchen. Diese Beobachtungen sprechen für eine Funktion des Drosophila glob1 innerhalb der O2-Versorgung. Unter hyperoxischen Bedingungen hingegen wurde kein Unterschied zwischen Fliegen mit wildtypischer und manipulierter glob1-Expression festgestellt, wodurch eine Beteiligung des glob1 bei der Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies als mögliche Funktion vorerst ausscheidet. Bei glob2 und glob3 handelt es sich um duplizierte Gene. Auf phylogenetischen Rekonstruktionen basierend konnte die Entstehung der Globin-Duplikate auf ein Duplikationsereignis vor der Radiation des Subgenus Sophophora vor mindestens 40 Millionen Jahren zurückgeführt werden. Die durchgeführten Analysen zur molekularen Sequenzevolution der Globin-Duplikate deuten darauf hin, dass glob2 und glob3 nach der Duplikation eine Kombination aus Sub- und Neo-Funktionalisierungsprozessen durchlaufen haben. Glob2 und glob3 zeigen eine deckungsgleiche mRNA Expression, die auf die männliche Keimbahn beschränkt ist. Aufgrund des hohen Konservierungsgrads der für die Häm- und O2-Bindung essentiellen Aminosäuren kann von der Funktionalität beider Proteine ausgegangen werden. Die streng auf die männliche Keimbahn begrenzte Expression von glob2 und glob3 deutet auf eine Rolle der Globin-Duplikate innerhalb der Spermatogenese hin, die möglicherweise in einem Schutz der Spermatogenese vor oxidativem Stress besteht. Auch eine Beteiligung beim korrekten Ablauf der Spermien-Individualisierung, beispielsweise durch Regulation von Apoptoseprozessen wäre denkbar.

Tandem repetitive DNA: Stabilität und Wirkung auf die Genexpression im transgenen System

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Eigenschaften von tandem repetitiver DNA (trDNA) analysiert. Drei der untersuchten trDNA-Familien (Cla-Elemente, Alu-Elemente, 1,688-Satelliten-DNA) stammen aus der genomischen DNA von Insekten, während ein trDNA-Cluster artifiziell aus Hsp70 Promotoren hergestellt wurde. Untersucht wurde die Stabilität dieser trDNA-Sequenzfamilien innerhalb eines Plasmidvektors in E. coli bzw. nach Integration der trDNA auch im Genom von D. melanogaster. Der Schwerpunkt der Arbeit liegt jedoch in der Analyse des Einflusses von trDNA auf die Expression eines benachbarten Reportergens in D. melanogaster.Ziel der Untersuchungen zur Stabilität war es, Eigenschaften von trDNA-Clustern und Mechanismen aufzuzeigen, die die Stabilität derselben in E. coli und im Genom von D. melanogaster beeinflussen. Mit Ausnahme der Alu-Elemente zeigen alle trDNA-Familien eine deutliche Instabilität in E. coli. Am Beispiel der Cla-Elemente wurde gezeigt, daß spezifische Eigenschaften der trDNA-Familie, wie etwa die sequenzbedingte Krümmung der Helixachse, keinen Einfluß auf die Stabilität des trDNA-Clusters haben, sondern die Orientierung des trDNA-Clusters innerhalb des Vektors ausschlaggebend ist. Ein entscheidender Faktor könnte die Orientierung des trDNA-Clusters relativ zur Wanderungsrichtung der Replikationsgabel in E. coli sein. Am Beispiel des trDNA-Clusters aus artifiziellen Hsp70 Promotoren konnte gezeigt werden, daß verschiedene Rekombinationssysteme an der Instabilität in E. coli beteiligt sind. Die meisten beobachteten Deletionen von trDNA sind RecA-abhängig. Zusätzlich findet jedoch in einem kleinen Teil der Plasmide auch eine RecA-unabhängige Rekombination statt. Sowohl in E. coli als auch in D. melanogaster wurde als vorherrschender Mechanismus der trDNA-Instabilität die homologe Rekombination identifiziert. TrDNA-Cluster, die in E. coli deutlich instabil sind, können jedoch im Genom von D. melanogaster weitgehend stabil sein. Auch Faktoren, die in E. coli die Stabilität eines trDNA-Clusters beeinflussen, wie etwa die Orientierung, zeigen in D. melanogaster keinen Einfluß auf die Stabilität der trDNA-Cluster. Ergebnisse aus Stabilitätsuntersuchungen in E. coli können damit nicht ohne Überprüfung auf andere Organismen übertragen werden. Im Hauptteil der Arbeit sollte geklärt werden, ob trDNA generell die Expression benachbarter Gene beeinflußt und welche Eigenschaften der trDNA für diesen inhibitorischen oder stimulierenden Effekt verantwortlich sind. Keine der untersuchten trDNA-Familien zeigt einen inhibitorischen Effekt auf ein benachbartes Reportergen. Entgegen dem Modell von Dorer und Henikoff (1994) führen trDNA-Cluster nicht per se zu der Entstehung von Heterochromatin. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, daß sowohl ein trDNA-Cluster aus Cla-Elementen als auch aus Hsp70 Promotor-Elementen eine deutliche Steigerung der Expression des miniwhite-Reportergens bewirken. Diese Steigerung ist für beide trDNA-Familien unabhängig von der chromosomalen Lage des Transgens im Euchromatin. In beiden Fällen ist der Effekt von der Orientierung des trDNA-Clusters abhängig und verstärkt sich mit wachsender Kopienzahl der trDNA-Einheiten. Während eines der trDNA-Cluster aus trDNA-Einheiten besteht, die bekanntermaßen eine Promotoraktivität aufweisen (Hsp70 Promotoren), war für die Cla-Elemente kein Einfluß auf die Expression eines benachbarten Gens bekannt. Damit wurde für eine trDNA-Familie aus Chironomus nachgewiesen, daß sie auf ein benachbartes Gen ähnlich wirkt wie zusätzliche Promotoren. Die experimentellen Befunde unterstützen ein Modell, demzufolge die Cla-Elemente in gleicher Weise wie tandem repetitive Promotoren auf ein benachbartes Gen expressionssteigernd wirken. Die TATA-Box ist für das Modell ein wichtiges Strukturelement, da diese in beiden expressionssteigernden DNA-Sequenzen der trDNA-Cluster vorkommt und ausschließlich in einer Orientierung wirkt. Das Modell besagt, daß durch die Verbindung einer offenen Chromatinstruktur mit korrekt orientierten Bindungsstellen für TBP der Aufbau von vollständigen Transkriptionskomplexen an den tandem repetitiven Promotoren initiiert wird. Einer Perlenschnur ähnlich wären die Transkriptionskomplexe direkt verfügbar, nachdem ein Transkriptionskomplex den Promotor zur Transkription verlassen hat (Abb. 32). Dies würde zu der beobachteten Steigerung der Expression des Reportergens sowohl durch die tandem repetitiven Hsp70 Promotoren als auch durch die Cla-Elemente führen.

Quantitative Aspekte der Anziehungskraft von Straßenbeleuchtungen auf die Emergenz aus nahegelegenen Gewässern (Ephemeroptera, Plecoptera, Trichoptera, Diptera: Simuliidae, Chironomidae, Empididae) unter Berücksichtigung der spektralen Emission ve

Beim Beobachten von nächtlichen Insektenschwärmen an Straßenbeleuchtungen kommt es zur Frage, inwieweit von einer Bedrohung eines geordneten Naturkreislaufes durch dieses Phänomen gesprochen werden kann. Am Beispiel der bedrohten Artenvielfalt aquatischer Insekten im Bereich anthropogen bedingt verschmutzter Fließgewässer wurde die Problematik umfassend untersucht. Die Freilandtests erstreckten sich von Sommer 1998 bis Sommer 2000. Die vorliegende Arbeit geht mehreren Fragestellungen nach:1. - Wie hoch ist der Anteil aquatischer Insekten, der von dem Ort seiner Emergenz aus von einer naheliegenden Straßenlaterne angezogen wird ?2. - Welcher Lampentyp lockt weniger Insekten an: OSRAM HQL (Weiß-Mischlicht) oder PHILIPPS SON (gelbes Licht) ?3. - Welche Wellenlängenbereiche des Lichts sind beim Anflug an die Lampe von besonderer Präferenz ? zu 1. - Aquatische Insekten wiesen kein einheitliches Verhalten im Anflug an künstliches Licht auf. In den Sommermonaten kam es bei einigen Insektengruppen, wie z.B. den Trichopteren, zu einem massenhaften Anflug an die eine, im Untersuchungsgebiet aufgestellte Straßenlaterne. In dieser Zeit ergaben sich im Mittelwert Fangzahlen in einer Nacht am Licht, die der Emergenz von 25 Metern Bachufer/72 Stunden entsprachen. Bei den Dipteren ergab der mittlere Wert eine Emergenz von knapp 10 Metern Uferlänge/72 Stunden. Aufgrund hoher Fangzahlen konnten folgende Ergebnisse auf Artniveau bei den Chironomiden erzielt werden. Bei den zehn häufigsten Arten aus Emergenz und Lichtfang zeigten sich starke Schwankungen: Der Fang am Licht entsprach im Maximum einer Schlupfrate von 61 Metern Ufer/ 72 Stunden bei einer Art, bei einer anderen Art wurde z.B. ein Lichtfang erzielt, der lediglich die Emergenz von 0,3 Metern/72 Stunden umfaßte.zu 2. - In dem ohne Lichtkonkurrenz stattfindenden Vergleich zwischen PHILIPPS SON 70W und OSRAM HQL 125W ergab sich eine Fangrelation von 1:1,6 (SON:HQL). Bei einem Parallelfang (30 Metern Abstand der Leuchten) mit SON/HQL flogen wesentlich mehr Tiere an die HQL: Hier betrug die Relation 1:3,97 (SON:HQL). Es fand somit bei Lichtkonkurrenz eine Abwanderung der Insekten zur 'attraktiveren' Lampe statt.zu 3. - Zuletzt wurde die Anlockwirkung dreier Farbspektren mit den Intensitätsmaxima einer Wellenlänge von 437nm, 579nm und 599nm getestet. 437nm war die in der HQL gemessene Intensitätsspitze im niedrigwelligen Bereich und nach verbreiteter Auffassung von besonderer Anlockwirkung. Der Wellenlängenbereich um 579nm stellte das Intensitätsmaximum der SON-Lampe dar (gelbes Licht); 599nm war als Alternative für anlockschwache Beleuchtungen ausgewählt worden. Hier ergab sich bei abwechselndem Fang (ohne Lichtkonkurrenz) eine Fangrelation von 1,8 : 3,4 : 1 (437nm : 579nm : 599nm).

Neuropeptide und die Regulation des Kohlenhydratstoffwechsels im Fettkörper der Argentinischen Schabe (Blaptica dubia)

Trehalose ist der Hauptblutzucker in der Hämolymphe der meisten Insekten. Trehalose wird im Fettkörper synthetisiert, dem wichtigsten Organ des Intermediärstoffwechsels bei Insekten. Wie die Homöostase des Blutzuckers reguliert wird, ist nicht vollständig geklärt. Die Produktion von Trehalose erfordert eine grundlegende Umschaltung im Stoffwechsel des Fettkörpers, die mehrere wichtige Stoffwechselwege betrifft, so dass die Fettkörperzellen (Trophocyten) von der Speicherung und Katabolisierung von Zucker zur Mobilisierung von Reservestoffen (Glykogen, Fett, Protein) und Trehalosesynthese umschalten. Am Fettkörper und isolierten Trophocyten der Argentinischen Schabe (Blaptica dubia) wurden Stoffwechseleffekte und Elemente der Signalkette des hypertrehalosämischen Hormons Bld HrTH untersucht. Inkubation isolierter Fettkörperloben mit Bld HrTH verringerte innerhalb von 60 min den Glykogengehalt (um 13,4 %) und steigerte die Konzentration der Hexosephosphate Glucose-6-phosphat und Fructose-6-phosphat, die Substrat sowohl für die Trehalosesynthese als auch für die Glykolyse sind. Pyruvat, Glycerin-3-phosphat, Citrat und insbesondere Fructose-1,6-bisphosphat (+750 %) waren ebenfalls erhöht. Der Glykolyseaktivator/Gluconeogeneseinhibitor Fructose-2,6-bisphosphat wird durch Bld HrTH vermindert. Da Trehalosesynthese und Glykolyse um dieselben Substrate (Glucosephosphate) konkurrieren, fördert der hormoninduzierte Abfall des Glykolyseaktivators Fructose-2,6-bisphosphat die Trehalogenese.Es ist gelungen, Trophocyten zu isolieren und die Signaltransduktion von Bld HrTH an einheitlichen Zellen und auch an Einzelzellen zu studieren. Hauptziel dieser Arbeit war es, die Funktion von Ca2+ im Signalweg des Bld HrTH genauer zu untersuchen. Die isolierten Zellen reagierten auf das Neuropeptid mit einer deutlichen Steigerung der Trehalosesynthese (+133,7 %) und einer Senkung des Fructose-2,6-bisphosphat-Gehaltes (-30,2 %). Sie bieten somit ein geeignetes System zur Untersuchung der Wirkungsmechanismen von Bld HrTH auf zellulärem Niveau. Ca2+ aus dem Extrazellulärraum und aus intrazellulären Speichern spielen bei der Signaltransduktion eine Rolle. Während extrazelluläres Ca2+ insbesondere für die Senkung des Fructose-2,6-bisphosphat-Gehaltes wichtig war, wurde Ca2+ aus zellulären Speichern insbesondere für die Trehalosesynthese benötigt, wobei sich jedoch beide Wege wechselseitig beeinflussen. Erstmals konnten an isolierten Trophocyten Änderungen von Ca2+ mikrofluorometrisch an Einzelzellen studiert werden. Das hypertrehalosämische Hormon ruft einen schnellen und starken Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) hervor. Die Untersuchungen deuten auf einen Signalweg über IP3 und Diacylglycerin hin, entsprechend der Phosphoinositidkaskade. Eine Beteiligung des biogenen Amins Octopamin, von cAMP oder von Stickstoffmonoxid (NO) an der Signaltransduktion scheint hingegen unwahrscheinlich. Der Zuckergehalt im Medium scheint ebenfalls auf die Trehalogenese zu wirken. Bei hohen Konzentrationen von Glucose oder Trehalose wurde eine Hemmung der Trehalosesynthese beobachtet, die als Rückkopplungshemmung gedeutet werden kann. Bei Hunger wird das im Fettkörper gespeicherte Glykogen stark reduziert. Außerdem scheint die Zahl der symbiontischen Mikroorganismen in den Mycetocyten verringert.

Vorkommen und Charakterisierung von Ecdysiotropinen bei männlichen Imagines der Mittelmeerfeldgrille Gryllus bimaculatus de Geer

Das Vorkommen von Häutungshormonen in adulten Insekten, insbesondere solcher, die eine lange Imaginalphase durchlaufen, wirft die Frage nach der Regulation der Ecdysteroidsynthese außerhalb der Prothorakaldrüse auf. Unter diesem Gesichtspunkt kann Gryllus bimaculatus mit einem ausgesprochen langen Adultstadium und rapiden zeitlichen Veränderungen des Ecdysontiters als ein geeignetes Versuchsobjekt angesehen werden.Der vorliegenden Dissertation liegt die Arbeitshypothese zugrunde, daß die Ecdysteroid-Synthese bzw. Sekretion von Adultgeweben in männlichen Imagines der Mittelmeerfeldgrille durch Neuropeptide hormonell reguliert wird. Als Quelle für die Ecdysteroidsynthese wurde auf Grund immunohistochemischer Befunde sowie der Ergebnisse von Sekretionsprofil-Analysen unter anderem die Oenocyten in Betracht gezogen.Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde ein in vitro Bioassay entwickelt, der es ermöglichte, die Wirkung von extrahierten Substanzen auf die Hormonsynthese mittels RIA/HPLC zu bestimmen. Aus Köpfen adulter G. bimaculatus ließen sich durch HP-SEC Faktoren isolieren, die die Ecdysteroidsekretion in Oenocyten und Tergiten stimulierten, die aber keinen Einfluß auf die Hormonsekretion von Fettgewebe sowie der Prothorakaldrüsen hatten. Die Wirkung des aufgereinigten Extraktes in Oenocyten war zeit- und dosis-abhängig. Die ecdysiotropen Faktoren besaßen ein Molekulargewicht zwischen 26,5 und 30 kDa. Die Größe der Molmasse der ecdysiotropen Faktoren entsprach somit bei adulten männlichen Grillen etwa dem des Neurohormons PTTH bei Lepidopteren. Dennoch zeigten Antikörper, die gegen PTTH von Bombyx mori gerichtet waren im Western-Blot keine Bindung an Gryllus bimaculatus Kopfextrakte. Die Sekretionsprodukte von Oenocyten, die mit Ecdysiotropinen behandelt waren, wurden durch RP- und NP-HPLC identifiziert. Es konnten zwei zusätzliche Peaks neben einem deutlichen Anstieg von 20-Hydroxyecdyson nachgewiesen werden. Auf Grund identischer Retentionszeiten mit Referenzsubstanzen handelt es sich bei einem Peak vermutlich um Makisteron A.Obwohl die Applikation von Azadirachtin in G. bimaculatus zu einer Senkung des Hämolymph-Ecdysteroidgehalts führte, konnte keine Anreicherung von Ecdysiotropinen erzielt werden.Die die Ecdysteroidsekretion-beeinflussenden Faktoren waren resistent gegen Kochen und Alkylierung aber nicht stabil gegen Reduzierung durch DTT und Behandlung mit Neuramidase. Damit konnte gezeigt werden, daß das Vorhandensein von Disulfidbrücken und Oligosaccharidketten für die biologische Aktivität notwendig ist.Die Aminosäuresequenz-Analyse und der enzymatische Verdau der stimulierenden Faktoren durch Exopeptidasen wiesen auf geschützte N- und C-Termini hin. Ferner wurden einige interne Peptidfragmente von fünf Proteinbanden sequenziert, die keine Homologie zu bereits bekannten regulatorischen Neuropeptiden zeigten. Als einziges bekanntes Protein aus diesem Bereich konnte das „14-3-3-like Protein“ mit Hilfe MALDI-MS identifiziert werden.Die Stimulierung der Ecdysteroidsekretion in Oenocyten von G. bimaculatus durch Oenocyten-stimulierende Faktoren (OSF) aus Kopfextrakten konnte mittels Signalstoff-Effektoren in vitro nachgeahmt werden. Außerdem wurde mit Hilfe eines RRA nachgewiesen, daß der intrazelluläre cAMP-Spiegel von Oenocyten durch OSF erhöht wird. Daraus kann geschlossen werden, daß cAMP als „Second Messenger“ an der Wirkung der OSF beteiligt ist. Calcium-Ionen schienen für die Ecdysteroidsekretion notwendig zu sein. Allerdings führte eine artifizielle Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration durch das Ionophor Ionomycin zu einer Hemmung der Sekretion. Schließlich wird ein Modell zur Erklärung des Wirkmechanismus von OSF in Gryllus bimaculatus postuliert und diskutiert.

Populationsdynamik des Cydia pomonella Granulovirus

Das Cydia pomonella Granulovirus (CpGV, Fam. Baculoviridae) ist ein sehr virulentes und hoch spezifisches Pathogen des Apfelwicklers (Cydia pomonella), das seit mehreren Jahren in der Bundesrepublik Deutschland und anderen Ländern der EU als Insektizid zugelassen ist. Wie andere Baculoviren auch befällt es die Larven der Insekten und ist aufgrund seiner Selektivität für Nicht-Zielorganismen unbedenklich. In der Vergangenheit konzentrierte sich die Erforschung des CpGV auf Bereiche, die für die Anwendung im Pflanzenschutz relevant waren, wobei nach fast 20 Jahren nach der ersten Zulassung noch immer nicht bekannt ist, ob und wie sich das CpGV in der Umwelt etablieren kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Parameter, mit deren Hilfe die Populationsdynamik des CpGV beschrieben werden kann, analysiert und quantitativ bestimmt. Neben den biologischen Eigenschaften wie Virulenz, DNA-Charakterisierung und Quantifizierung der Virusnachkommenschaft wurden insbesondere die horizontale sowie die vertikale Transmission, die Inaktivierung und die Infektion später Larvenstadien untersucht. Letztlich wurden die ermittelten Parameter zusammen mit Daten aus der Literatur in ein mathematisches Modell integriert. Um die Wahrscheinlichkeit der horizontalen Transmission zu quantifizieren, wurde ein Modellsystem mit losen Äpfeln etabliert, in dem verschiedene Szenarien möglicher horizontaler Transmission unter definierten Laborbedingungen getestet wurden. In Versuchsserien, in denen ein Virusfleck, entsprechend der produzierten Virusmenge einer Eilarve, auf einen Apfel appliziert worden war, war unter den aufgesetzten Apfelwicklerlarven lediglich eine sehr geringe Mortalität von 3 - 6% zu beobachten. Wurde jedoch ein an einer Virusinfektion gestorbener Larvenkadaver als Inokulum verwendet, lag die Mortalitätsrate aufgesetzter Larven bei über 40%. Diese beobachtete hohe horizontale Transmissionsrate konnte mit dem Verhalten der Larven erklärt werden. Die Larven zeigten eine deutliche Einbohrpräferenz für den Stielansatz bzw. den Kelch, wodurch die Wahrscheinlichkeit des Zusammentreffens einer an der Infektion verendeten Larve mit einer gesunden Larve um ein Vielfaches zunahm. In einem ähnlich angelegten Freilandversuch konnte eine horizontale Transmission nicht belegt werden. Der Unterschied zur Kontrollgruppe fiel aufgrund einer hohen natürlichen Mortalität und einer damit einhergehenden niedrigen Dichte der Larven zu gering aus. Parallel hierzu wurde außerdem eine Halbwertszeit von 52 Sonnenstunden für das CpGV ermittelt. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die Mortalität von späteren Larvenstadien, die 14 Tage Zeit hatten sich in die Äpfel einzubohren, bevor eine CpGV-Applikation durchgeführt wurde, ebenso hoch war wie bei Larven, die sich im L1-Stadium auf der Apfeloberfläche infizierten. Aufgrund des höheren Alters jener Larven war der Fraßschaden an befallenen Äpfeln jedoch wesentlich größer und vergleichbar mit dem Fraßschaden einer unbehandelten Kontrolle. Der Versuch zur vertikalen Transmission zeigte dass, obwohl die verwendete Apfelwicklerzucht nicht frei von CpGV war, die Mortalitätsrate der Nachkommen subletal infizierter Weibchen (44%) jedoch deutlich höher war als die der Nachkommen subletal infizierter Männchen (28%) und der unbehandelten Kontrolle (27%). Auch in den PCR-Analysen konnte eine größere Menge an CpGV-Trägern bei den Nachkommen subletal infizierter Weibchen (67%) als bei den Nachkommen subletal infizierter Männchen (49%) und bei der Kontrolle (42%) nachgewiesen werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Infektion durch subletal infizierte Weibchen vertikal in die nächste Generation übertragen werden kann. Dies lässt erkennen, dass in der Folgegeneration des Apfelwicklers eine zusätzliche Wirkung des CpGV durch vertikale Transmission auftreten kann. Hierin wäre auch ein potentieller Mechanismus für eine dauerhafte Etablierung des Virus zu sehen. Letztlich wurden alle Parameter, die die CpGV-Apfelwickler-Beziehung beschreiben, in ein mathematisches Modell GRANULO integriert. Nach einer Sensitivitätsanalyse wurde GRANULO teilweise mit Daten aus den Freilandversuchen verifiziert. Durch Modifikation der Virusparameter im Modell konnte anschließend der Einfluss veränderter biologischer Eigenschaften (UV-Stabilität und Transmissionsraten) der Viren in Simulationen theoretisch erprobt werden. Das beschriebene Modell, das allerdings noch einer weitergehenden Verifizierung und Validierung bedarf, ist eine erste Annäherung an die quantitative Erfassung und Modellierung der Populationsdynamik des Systems CpGV-Apfelwickler. Die im Zusammenhang mit der Populationsdynamik des Apfelwicklers erhobenen Daten können einen wertvollen Beitrag zur Optimierung von Kontrollstrategien des Apfelwicklers mittels CpGV leisten. Außerdem geben sie Aufschluss über die Etablierungsmöglichkeiten dieses Bioinsektizids.

Charakterisierung von Arthropodenhämocyaninen

Verschiedene cDNA-Banken wurden erstellt, andere waren bereits vorhanden. Diese Expressionsbanken wurden mittels Antikörper- bzw. Sondenscreening auf Hämocyanin- bzw. bei den Insekten auch auf Hexamerinklone durchmustert. Dabei gelang es, diverse Hämocyaninunter-einheiten zu identifizieren und zu sequenzieren. Die erarbeiteten Sequenzen wurden im An-schluss für phylogenetische Studien benutzt. Es konnte hierbei gezeigt werden, dass die so-genannte „Tracheata-Hypothese“ immer unwahrscheinlicher wird. Diese geht von einer Schwestergruppenstellung der Hexapoda und der Myriapoda aus. Die hier gemachten Unter-suchungen widersprechen dieser Hypothese eindeutig. Die Ergebnisse stützen vielmehr die „Pancrustacea-Hypothese“. In den Stammbäumen sind die Crustaceenhämocyanine eindeutig in naher Verwandtschaft zu den paraphyletisch entstandenen Insektenhämocyaninen angeordnet. Ob die Crustaceen monophyletischen Ursprungs sind, kann nicht eindeutig beurteilt werden, es bestehen aber weiterhin begründete Zweifel. Die Myriapodenhämocyanine stehen in Schwestergruppenstellung zu den Crustaceen und den Insektenhämocyaninen. Dies weist auf ein gemeinsames Taxon der Mandibulata hin. Die systematische Stellung der Myriapoden innerhalb der Arthropoden kann allerdings nicht abschließend geklärt werden. Dazu ist eine weitergehende Aufklärung von Hämocyaninsequenzen in diesem Arthropodentaxon notwendig.

Untersuchungen zur mikrobiellen Methylquecksilberbildung in Termiten und im Faulschlamm

Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig eine in vivo Methylierung von Quecksilber in Insekten nachgewiesen. Des Weiteren wurde die Kinetik der Quecksilbermethylierung im Faulschlamm untersucht und eine Identifizierung der für die Methylierung verantwortlichen Bakteriengruppe durchgeführt. Die Methylquecksilberbestimmung erfolgte mittels Purge&Trap Gaschromatographie-Atomfluoreszenzspektrometrie nach einer sauren Phasenextraktion. Zur Untersuchung einer in vivo Methylquecksilberbildung in Insekten wurde die australischen Termite Mastotermes darwiniensis als Modellorganismus verwandt. Den Tieren wurde über einen Zeitraum von vierzehn Tagen Quecksilber(II)chlorid in unterschiedlichen Konzentrationen mit der Nahrung zugeführt und anschließend die Methylquecksilberkonzentration in den Termiten bestimmt. Mit zunehmender Quecksilberkonzentration in der Nahrung (0 µg bis 150 µg Hg2+/g) stieg die Methylquecksilberkonzentration von ca. 5 ng auf 53,8 ng pro g Termite Trockengewicht. Bei höheren Quecksilberkonzentrationen in der Nahrung wurde kein weiterer Anstieg in der Methylquecksilberkonzentration in den Termiten festgestellt. Die Untersuchung der Methylquecksilberbildung im Faulschlamm des Klärwerks Mainz-Mombach zeigte, dass die Methylquecksilberkonzentration zu Beginn der Inkubationsphase rasch anstieg und mit zunehmender Inkubationsdauer eine Sätti-gung erreichte. Nach 164 Stunden waren insgesamt 2,6 % des eingesetzten Quecksilbers zu Methylquecksilber umgesetzt. Anhand von Hemmstoffversuchen wurden Sulfat-reduzierende Bakterien als hauptverantwortliche Organismengruppe für die Quecksilbermethylierung identifiziert.

10 Å cryo-EM structure of Drosophila melanogaster hexamerin and Limulus polyphemus hemocyanin

In the present study, the quaternary structures of Drosophila melanogaster hexamerin LSP-2 and Limulus polyphemus hemocyanin, both proteins from the hemocyanin superfamily, were elucidated to a 10 Å resolution with the technique of cryo-EM 3D-reconstruction. Furthermore, molecular modelling and rigid-body fitting allowed a detailed insight into the cryo-EM structures at atomic level. The results are summarised as follows: Hexamerin 1. The cryo-EM structure of Drosophila melanogaster hexamerin LSP-2 is the first quaternary structure of a protein from the group of the insect storage proteins. 2. The hexamerin LSP-2 is a hexamer of six bean-shaped subunits that occupy the corners of a trigonal antiprism, yielding a D3 (32) point-group symmetry. 3. Molecular modelling and rigid-body fitting of the hexamerin LSP-2 sequence showed a significant correlation between amino acid inserts in the primary structure and additional masses of the cryo-EM structure that are not present in the published quaternary structures of chelicerate and crustacean hemocyanins. 4. The cryo-EM structure of Drosophila melanogaster hexamerin LSP-2 confirms that the arthropod hexameric structure is applicable to insect storage proteins. Hemocyanin 1. The cryo-EM structure of the 8×6mer Limulus polyphemus hemocyanin is the highest resolved quaternary structure of an oligo-hexameric arthropod hemocyanin so far. 2. The hemocyanin is build of 48 bean-shaped subunits which are arranged in eight hexamers, yielding an 8×6mer with a D2 (222) point-group symmetry. The 'basic building blocks' are four 2×6mers that form two 4×6mers in an anti-parallel manner, latter aggregate 'face-to-face' to the 8×6mer. 3. The morphology of the 8×6mer was gauged and described very precisely on the basis of the cryo-EM structure. 4. Based on earlier topology studies of the eight different subunit types of Limulus polyphemus hemocyanin, eleven types of interhexamer interfaces have been identified that in the native 8×6mer sum up to 46 inter-hexamer bridges - 24 within the four 2×6mers, 10 to establish the two 4×6mers, and 12 to assemble the two 4×6mers into an 8×6mer. 5. Molecular modelling and rigid-body fitting of Limulus polyphemus and orthologous Erypelma californicum sequences allowed to assign very few amino acids to each of these interfaces. These amino acids now serve as candidates for the chemical bonds between the eight hexamers. 6. Most of the inter-hexamer contacts are conspicuously histidine-rich and evince constellations of amino acids that could constitute the basis for the allosteric interactions between the hexamers. 7. The cryo-EM structure of Limulus polyphemus hemocyanin opens the door to a fundamental understanding of the function of this highly cooperative protein.

Untersuchungen zur Regulation der Trehalaseaktivität bei der Wanderheuschrecke Locusta migratoria

Flugfähige Insekten sind äußerst leistungsfähige Tiere. Ihre Flugmuskulatur ist das Gewebe mit der höchsten ATP-Umsatzrate im Tierreich. Der hohe Energieumsatz ist möglich durch einen vollständig aeroben Stoffwechsel der Flugmuskulatur, der durch die effiziente Sauerstoffversorgung über das Tracheensystem gewährleistet wird. Andererseits haben Insekten einen offenen Blutkreislauf, d.h. ihre Gewebe werden nicht über Kapillaren mit Substraten versorgt, sondern von der Hämolymphe umspült, die daher eine hohe Konzentration an energieliefernden Substraten haben muss. Als schnell verfügbares Substrat nutzen Wanderheuschrecken bei Beginn eines Fluges als Hauptsubstrat Trehalose, die in hoher Konzentration als Hämolymphzucker vorliegt (20 bis 40mal höhere Konzentration als Glucose). Trehalose ist, anders als Glucose, ein nicht-reduzierender Zucker und daher nicht toxisch. Allerdings muss das Disaccharid Trehalose zu Glucose hydrolysiert werden, bevor sie im Zellstoffwechsel verwertet werden kann. Diese Funktion erfüllt die Trehalase (EC 3.2.1.28), ein Enzym, das membrangebunden ist und nach Zellfraktionierung in der Mikrosomenfraktion erscheint. Es ist schon lange offensichtlich, dass die Aktivität der Trehalase regulierbar sein muss und zwar reversibel (eine Eigenschaft, die für Hydrolasen ungewöhnlich ist), der Mechanismus ist allerdings bislang nicht klar, da alle üblichen Typen von Aktivitätsregulation nicht verwirklicht zu sein scheinen. Die meisten Autoren vermuten, dass die Regulation über den Transport des Substrats erfolgt. Ein Trehalosetransporter konnte allerdings bisher in der Flugmuskulatur von Locusta nicht nachgewiesen werden. In dieser Arbeit stelle ich Experimente vor, die dafür sprechen, dass Trehalase als Ektoenzym aktiv ist (overte Form), während eine inaktive Form (latente Form) in Vesikeln im Cytoplasma vorliegt und per Exocytose reversibel in die Plasmamembran transloziert werden kann. Für die Testung dieser Arbeitshypothese nutzte ich Trehazolin, einen sehr spezifischen Inhibitor der Trehalase, der äußerst fest und dauerhaft im aktiven Zentrum des Enzyms bindet. Dazu war es nötig, die Flugmuskulatur zu fraktionieren, um die Effekte von Trehazolin auf die verschiedenen Formen der Trehalase (gebunden, löslich, overt, latent) zu analysieren. Mit der Arbeitshypothese vereinbar sind die folgenden Befunde: (1) In die Hämolymphe injiziertes Trehazolin hemmt bevorzugt die overte Trehalase und erst bei höheren Dosen und nach längerer Zeit die latente Form. (2) Trehazolin wirkt in hoher Dosis (50µg pro Tier) auch nach Verfütterung, allerdings stark abgeschwächt, da nach 24 Stunden ein signifikanter Effekt nur auf die overte, aber nicht auf die latente Form sichtbar war. (3) In einem Langzeitversuch über 30 Tage führte die einmalige Injektion von 20µg Trehazolin zu einer schnellen Hemmung der overten Trehalase, der eine verzögerte Hemmung der latenten Aktivität folgte. Der Zeitverlauf von Hemmung und Erholung spricht für eine Vorläufer-Produkt-Beziehung zwischen latenter und overter Form. (4) Flugaktivität der Tiere führt zu einer starken Verminderung der latenten Aktivität, falls Trehazolin in der Hämolymphe der Tiere vorhanden war. (5) Neuropeptide könnten die Translokation fördern. Insulin hat einen entsprechenden Effekt, der aber unabhängig ist von der Flugaktivität. (6) Der PI3-Kinasehemmstoff Wortmannin stabilisiert die latente Form der Trehalase. Auch andere Organe als die Flugmuskulatur besitzen Trehalase, aber mit deutlich geringerer Aktivität. In der Sprungmuskulatur könnte auch eine latente Form vorhanden sein, für Darm und Gehirn ist das nicht wahrscheinlich.

Struktur und Funktion des Lipoproteins von Nereis virens (Annelida)

Ein discoidales Lipoprotein aus dem Polychaeten Nereis virens (Annelida) wurde eingehend charakterisiert. Im Vordergrund standen dabei die transportierten Lipide, sowie die Ultrastruktur des Partikels. Das Nereis-Lipoprotein besitzt eine für Invertebraten atypische Lipidzusammensetzung: Außer den Phospholipiden gibt es keine klar dominierende Lipidklasse. Die Charakterisierung der Apolipoproteine zeigt Gemeinsamkeiten mit den Apolipophorinen der Insekten: Wie diese besitzt das Nereis-Lipoprotein zwei Apolipoproteine, die in einer 1:1-Stöchiometrie angeordnet sind. Das größere Protein (ApoNvLp I) ist dabei stärker zum wässrigen Medium exponiert ist als das kleinere (ApoNvLp II). Beide Proteinuntereinheiten sind N-glycosyliert. ApoNvLp II ist zusätzlich noch O-glycosyliert. Bei den Sekundärstrukturen dominieren β-Strukturen (35%) gegenüber α-Helices (14%); 28% waren ungeordnete Strukturen. Die Masse wurde mit verschiedenen Methoden bestimmt: sie liegt zwischen ~800 kDa (Gelfiltration) und ~860 kDa (Analytische Ultrazentrifugation). Der Sedimentationskoeffizient beträgt 9,7 S. Der zelluläre Lipoproteinrezeptor wurde aus einer großen Anzahl von Zellen und Geweben isoliert. Die biochemische Charakterisierung des Rezeptormoleküls zeigte es als ein monomeres, integrales, N- und O-glycosyliertes Membranprotein mit einer Masse von ~114 kDa. Die Bindungscharakteristika (Abhängigkeit von Ca2+, Disulfidbrücken) weisen es als Mitglied der LDLR-Superfamilie aus. In vitro-Inkubationsversuche mit fluoreszenzmarkierten Lipoproteinen zeigten die Aufnahme sowohl in Oocyten als auch in freie Coelomzellen (Elaeocyten) sowie in Spermatogonien- und Tetradenstadien. Auffällig war, dass die Lipide zusammen mit den Apolipoproteinen in die Dottergranula der Eizellen eingelagert wurden und nicht direkt in die Lipidtropfen. Auch bei den Elaeocyten wurden die Lipide nicht direkt in den Lipidtropfen eingelagert. Intakte Lipoproteine konnten per Dichtegradienten-Ultrazentrifugation nur aus Spermatogonien isoliert werden. Die isolierten Lipoproteine hatten die gleiche ‚Morphologie’ wie die aus der Coelomflüssigkeit isolierten, zeigten jedoch sehr viele Peptidfragmente im SDS-Gel, was auf eine beginnende Degradation hinweist. Es wird ein Modell für den Lipidtransport in Nereis virens vorgeschlagen, bei dem den Elaeocyten eine entscheidende Rolle im Lipidstoffwechsel zufällt.

Early steps in ventral nerve cord development in chelicerates and myriapods and formation of brain compartments in spiders

The central point of this work is the investigation of neurogenesis in chelicerates and myriapods. By comparing decisive mechanisms in neurogenesis in the four arthropod groups (Chelicerata, Crustacea, Insecta, Myriapoda) I was able to show which of these mechanisms are conserved and which developmental modules have diverged. Thereby two processes of embryonic development of the central nervous system were brought into focus. On the one hand I studied early neurogenesis in the ventral nerve cord of the spiders Cupiennius salei and Achaearanea tepidariorum and the millipede Glomeris marginata and on the other hand the development of the brain in Cupiennius salei.rnWhile the nervous system of insects and crustaceans is formed by the progeny of single neural stem cells (neuroblasts), in chelicerates and myriapods whole groups of cells adopt the neural cell fate and give rise to the ventral nerve cord after their invagination. The detailed comparison of the positions and the number of the neural precursor groups within the neuromeres in chelicerates and myriapods showed that the pattern is almost identical which suggests that the neural precursors groups in these arthropod groups are homologous. This pattern is also very similar to the neuroblast pattern in insects. This raises the question if the mechanisms that confer regional identity to the neural precursors is conserved in arthropods although the mode of neural precursor formation is different. The analysis of the functions and expression patterns of genes which are known to be involved in this mechanism in Drosophila melanogaster showed that neural patterning is highly conserved in arthropods. But I also discovered differences in early neurogenesis which reflect modifications and adaptations in the development of the nervous systems in the different arthropod groups.rnThe embryonic development of the brain in chelicerates which was investigated for the first time in this work shows similarities but also some modifications to insects. In vertebrates and arthropods the adult brain is composed of distinct centres with different functions. Investigating how these centres, which are organised in smaller compartments, develop during embryogenesis was part of this work. By tracing the morphogenetic movements and analysing marker gene expressions I could show the formation of the visual brain centres from the single-layered precheliceral neuroectoderm. The optic ganglia, the mushroom bodies and the arcuate body (central body) are formed by large invaginations in the peripheral precheliceral neuroectoderm. This epithelium itself contains neural precursor groups which are assigned to the respective centres and thereby build the three-dimensional optical centres. The single neural precursor groups are distinguishable during this process leading to the assumption that they carry positional information which might subdivide the individual brain centres into smaller functional compartments.rn

Genetische Mechanismen der dorsoventralen Musterbildung im embryonalen Gehirn von Drosophila

In Vertebraten und Insekten ist während der frühen Entwicklung des zentralen Nervensystems (ZNS), welches sich aus dem Gehirn und dem ventralen Nervensystem (VNS) zusammensetzt, die Unterteilung des Neuroektoderms (NE) in diskrete Genexpressions-Domänen entscheidend für die korrekte Spezifizierung neuraler Stammzellen. In Drosophila wird die Identität dieser Stammzellen (Neuroblasten, NB) festgelegt durch die positionellen Informationen, welche von den Produkten früher Musterbildungsgene bereitgestellt werden und das Neuroektoderm in anteroposteriorer (AP) und dorsoventraler (DV) Achse unterteilen. Die molekulargenetischen Mechanismen, welche der DV-Regionalisierung zugrunde liegen, wurden ausführlich im embryonalen VNS untersucht, sind für das Gehirn jedoch weitestgehend unverstanden. rnIm Rahmen dieser Arbeit wurden neue Erkenntnisse bezüglich der genetischen Mechanismen gewonnen, welche die frühembryonale Anlage des Gehirns in DV-Achse unterteilen. So konnte gezeigt werden, dass das cephale Lückengen empty spiracles (ems), das Segmentpolaritätsgen engrailed (en), sowie der „Epidermal growth factor receptor“ (EGFR) und das Gen Nk6 homeobox (Nkx6) für Faktoren codieren, die als zentrale Regulatoren die DV Musterbildung in der Gehirnanlage kontrollieren. Diese Faktoren interagieren zusammen mit den ebenso evolutionär konservierten Homöobox-Genen ventral nervous system defective (vnd), intermediate neuroblasts defective (ind) und muscle segment homeobox (msh) in einem komplexen, regulatorischen DV-Netzwerk. Die im Trito (TC)- und Deutocerebrum (DC) entschlüsselten genetischen Interaktionen basieren überwiegend auf wechselseitiger Repression. Dementsprechend sorgen 1) Vnd und Ems durch gegenseitige Repression für eine frühe DV-Unterteilung des NE, und 2) wechselseitige Repression zwischen Nkx6 und Msh, als auch zwischen Ind und Msh für die Aufrechterhaltung der Grenze zwischen intermediärem und dorsalem NE. 3) Sowohl Ind als auch Msh sind in der Lage, die Expression von vnd zu inhibieren. Ferner konnte gezeigt werden, dass Vnd durch Repression von Msh als positiver Regulator von Nkx6 fungiert. Überdies beeinflusst Vnd die Expression von ind in segment-spezifischer Art und Weise: Vnd reprimiert ind-Expression im TC, sorgt jedoch für eine positive Regulation von ind im DC durch Repression von Msh. Auch der EGFR-Signalweg ist an der frühen DV-Regionalisierung des Gehirns beteiligt, indem er durch positive Regulation der msh-Repressoren Vnd, Ind und Nkx6 dazu beiträgt, dass die Expression von msh auf dorsales NE beschränkt bleibt. Ferner stellte sich heraus, dass das AP-Musterbildungsgen ems die Expression der DV-Gene kontrolliert und umgekehrt: Ems ist für die Aktivierung von Nkx6, ind und msh in TC und DC erforderlich ist, während Nkx6 und Ind zu einem späteren Zeitpunkt benötigt werden, um ems im intermediären DC gemeinsam zu reprimieren. Überdies konnte gezeigt werden, dass das Segmentpolaritätsgen en Aspekte der Expression von vnd, ind und msh in segment-spezifischer Art und Weise reguliert. En reprimiert ind und msh, hält jedoch vnd-Expression im DC aufrecht; im TC wird En benötigt, um die Expression von Msh herunter zu regulieren und somit die Aktivierung von ind dort zu ermöglichen.rnrnZusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass AP Musterbildungsfaktoren in umfangreichen Maß die Expression der DV Gene im Gehirn (und VNS) kontrollieren. Ferner deuten diese Daten darauf hin, dass sich das „Konzept der ventralen Dominanz“, welches für die DV-Musterbildung im VNS postuliert wurde, nicht auf das genregulatorische Netzwerk im Gehirn übertragen lässt, da Interaktionen zwischen den beteiligten Faktoren hauptsächlich auf wechselseitiger (und nicht einseitiger) Repression basieren. Zudem scheint das Konzept der ventralen Dominanz auch für das VNS nicht uneingeschränkt zu gelten, da in dieser Arbeit u.a. gezeigt werden konnte, dass dorsal exprimiertes Msh in der Lage ist, intermediäres ind zu reprimieren. Interessanterweise ist gegenseitige Repression von Homöodomänen-Proteinen im sich entwickelnden Neuralrohr von Vertebraten weit verbreitet und darüberhinaus essenziell für den Aufbau diskreter DV-Vorläuferdomänen, und weist insofern eine große Ähnlichkeit zu den in dieser Arbeit beschriebenen DV-Musterbildungsvorgängen im frühembryonalen Fliegengehirn auf.rn

Comparative analysis of midline guidance and axon pathfinding in the chelicerates Achaearanea tepidariorum and Cupiennius salei

Die Neurogenese und axonale Wegfindung sind in den vergangenen Jahrzehnten Thema einer Vielzahl wissenschaftlicher Untersuchungen in den verschiedensten Organismen gewesen. Die zusammengetragenen Daten in Insekten und Crustaceen geben eine gute Übersicht darüber, wie das Nervensystem in Arthropoden aufgebaut wird. Die entwicklungsbiologischen Prozesse, die daran beteiligt sind, sind in den beiden genannten Gruppen sehr gut verstanden. In den Gruppen der Cheliceraten und Myriapoden jedoch wurden ähnliche Analysen bisher kaum durchgeführt. Das Hauptanliegen dieser Arbeit war es daher, Mechanismen in den Spinnen Achaearanea tepidariorum und Cupiennius salei, zwei Vertretern der Cheliceraten, zu untersuchen, die eine Rolle im Leitsystem der ventralen Mittellinie und bei der axonalen Wegfindung spielen. Eine Vorraussetzung hierfür sind Kenntnisse über die Architektur des Zentralnervensystems. In einem ersten Schritt beschrieb ich daher grundlegend die Morphologie des Nervensystems im Verlauf der gesamten Embryoalentwicklung. Ich konnte zeigen, dass in Spinnen ein für Arthropoden typisches Strickleiternervensystem gebildet wird. Dieses wird von segmental angelegten Neuronen geformt, wobei sowohl Gruppen von Zellen als auch einzelne Neurone daran beteiligt sind, die primären axonalen Trakte zu etablieren. Im Besonderen konnte ich eine Zelle identifizieren, die in Position, Projektionsmuster und der Expression des Markergens even-skipped vergleichbar zum PR2 Neuron in Drosophila ist, welches die posteriore Wurzel des Segmentalnervs anlegt.rnrnIn einem zweiten Ansatz untersuchte ich die ventrale Mittellinie in Spinnen im Bezug auf ihre mögliche Funktion in der axonalen Wegfindung. Es konnte gezeigt werden, dass es sich beim Epithel der Mittellinie, das die Lücke zwischen beiden Keimstreifhälften während des gesamten Prozesses der Inversion überspannt, um eine transiente Struktur handelt, die keine neuralen Zellen hervorbringt. Es ist daher vergleichbar mit der so genannten Floor plate in Vertebraten, die ebenfalls nur vorübergehend existiert. Die Untersuchung von single minded (sim) zeigte, dass es, anders als in Drosophila, wo sim ein wichtiges regulatorisches Gen für die korrekte Spezifizierung von Mittellinienzellen ist, nicht in den Zellen der Mittellinie, sondern in diesen benachbarten Zellen, exprimiert wird. Das ist vergleichbar mit Vertebraten. Zusätzlich konnte ich Expression von sim an den Basen der Gliedmassen und im Kopf nachweisen. Wie in Vertebraten könnte sim an der Musterbildung dieser Gewebe beteiligt sein. Dennoch spielt die Mittellinie in Spinnen eine wichtige Rolle als Organisator für auswachsende, kommissurale Axone. Diese Funktion teilt sie mit anderen Invertebraten und Vertebraten.rnrnDie Signaltransduktionskaskade, die an der axonalen Wegfindung an der Mittellinie beteiligt ist, ist in den verschiedensten Organismen hoch konserviert. In der vorliegenden Arbeit konnte ich sowohl in Achaearanea als auch in Cupiennius ein netrin Homolog identifizieren und eine konservierte Funktion des Wegfindungsmoleküls während der Bildung der Kommissuren aufzeigen. RNAi Experimente belegen, dass, wird die Funktion von netrin herunterreguliert, das Strickleiternervensystem nicht korrekt gebildet wird, ins Besondere die kommissuralen Faszikel. Des Weiteren konnte ich eine neue Funktion von netrin, die bisher in anderen Organsimen noch nicht beschrieben wurde, identifizieren. Neben seiner Rolle in der axonalen Wegfindung, scheint netrin auch an der epithelialen Morphogenese im zentralen Nervensystem beteiligt zu sein. In dieser Funktion scheint netrin in Gliazellen, die die epithelialen Vesikel der Invaginationsgruppen umhüllen, wichtig zu sein, um neurale Vorläuferzellen in einem undifferenzierten Zustand zu halten. Der Abbau von netrin Transkript durch RNA Interferenz führt zu einer verfrühten Segregation neuraler Vorläuferzellen aus dem epithelialen Verband der Invaginationsgruppen und zu einer Zunahme an Zellen, die den frühen Differenzierungsmarker islet exprimieren.