Wirkmechanismen der trifunktionalen Antikörper catumaxomab und ertumaxomab in humanen Tumorsphäroid-Kokulturen

Ein neuer Ansatz der immunologischen Krebstherapie ist die Verwendung der bispezifischen, trifunktionalen Antikörper catumaxomab (anti-EpCAM x anti-CD3) und ertumaxomab (anti-Her2/neu x anti-CD3). Die Bispezifität besteht in der Bindung eines Tumor-assoziierten Antigens (EpCAM bzw. Her2/neu) und des CD3 Moleküls auf der Oberfläche von T-Zellen. Darüber hinaus stellt die Interaktion des Fc-Teils mit FcγRI/IIa/III positiven akzessorischen Immunzellen die dritte Funktion der Antikörper dar. Diese einzigartige Kombination ermöglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes. In klinischen Studien konnte bereits die Wirksamkeit beider Antikörper nachgewiesen werden. Die eigentlichen Wirkmechanismen der trifunktionalen Antikörper jedoch sind noch nicht ausreichend bekannt. Um die Wechselwirkung zwischen den stark EpCAM- und schwach Her2/neu-positive FaDu- sowie den stabil mit humanem Her2/neu transfizierten FaDu E593-Tumorzellen, peripheren Blutmonozyten (PBMC) und trifunktionalen Antikörpern systematisch zu untersuchen wurde ein 3D-Tumormodell, die so genannten multizellulären Tumorsphäroide (MCTS), angewandt. Als Endpunkte zur Beurteilung der Therapieeffizienz dienten das Volumenwachstum der Sphäroide, sowie die Klonogenität und die Zellvitalität. Zur Beurteilung der PBMC-Penetration in die Sphäroide erfolgten immunhistochemische Färbungen und molekularbiologische Nachweise der Abwehrzellantigene. Entsprechend wurden in den Sphäroiden die Proliferationsrate über eine Ki67-Färbung sowie die Apoptoserate über eine FragEL-Markierung identifiziert. Die Aktivität der PBMC wurde durch die Bestimmung ausgewählter Zytokine (ELISA) und der Zellzahl aus den Medienüberständen charakterisiert. Die an den FaDu- und E593-Sphäroiden erzielten Ergebnisse zeigten, dass catumaxomab und ertumaxomab eine konzentrations- und zeitabhängige Abnahme des Sphäroidvolumens bewirkten. Die Schrumpfung der Tumorsphäroide ging mit einer Reduktion des proliferativen und mit einer Steigerung des apoptotischen Tumorzellanteils einher. Die histologischen Befunde weisen darauf hin, dass die Volumenreduktion durch eine gesteigerte Anzahl infiltrierender Leukozyten bedingt ist. Auf verschiedenen Methoden basierende Analysen der Immunzellsubtypen zeigten eine dominierende Infiltration von zytotoxischen T-Zellen in die Tumorsphäroide. Der Aktivitätsnachweis der T-Zellen wurde über die Detektion der IL-2 mRNA und des sekretierten Zytokins erbracht. Einen zusätzlichen Hinweis auf eine zelluläre Immunantwort liefert das Zytokinmuster mit hohen Konzentrationen an IFN-γ. Der direkte Vergleich beider Antikörper zeigte, dass der anti-tumorale Effekt abhängig von der Antigenexpression auf den Tumorzellen war. Die Analyse von Medienüberständen wies auf eine mehrheitlich höhere Zytokinausschüttung in Gegenwart des Tumorantigens hin. Sphäroid-Kokulturen, die mit dem parentalen anti-EpCAM Antikörper behandelt wurden, zeigten keine Volumenreduktion. Im Gegensatz dazu führte der parentale CD3-Antikörper, das CD3- und Tumorzell-bindende catumaxomab F(ab')2 Fragment oder eine Kombination beider parentaler Antikörper zu einer anti-tumoralen Wirkung, die jedoch nicht so stark war wie die des trifunktionalen Antikörpers catumaxomab. Demnach ist für catumaxomab gezeigt, dass für die Effektivität des Antikörpers die Trifunktionalität unabdingbar ist. Daraus leitet sich ab, dass die Aktivierung der Abwehrzellen durch kostimulatorische Signale notwendig ist und über die Tumorantigenbindung Mechanismen wie ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) zum Tragen kommen. Die Experimente mit gleichzeitiger Gabe von trifunktionalen Antikörpern und Immunsuppressiva haben gezeigt, dass eine Kombination beider Agenzien möglich ist. Die Konzentrationen sind jedoch sorgfältig derart zu wählen, dass die Zytokinausschüttung und die damit verbundenen Nebenwirkungen reduziert sind, ohne dass die anti-tumorale Wirkung der Antikörper maßgeblich beeinflusst wird. T-Zellen bedienen sich nach Aktivierung für die rasche Proliferation einer gesteigerten aeroben Glykolyse. Unter Behandlung der Kokulturen mit catumaxomab konnte im Vergleich zu anderen immunstimulatorischen Agenzien die größte Steigerung der Laktatproduktion bzw. der Azidifizierungs- und Sauerstoffverbrauchsrate detektiert werden. Diese Effekte weisen auf eine metabolische Aktivierung der PBMC durch catumaxomab hin. Das von den Tumorzellen abgegebene Laktat kann die Immunzellen jedoch inhibieren. Daher wäre die Kombination mit Glykolyseinhibitoren ein möglicher Ansatz, um die Therapieeffizienz weiter zu steigern. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Komedikation der trifunktionalen Antikörper mit Chemotherapeutika zu einer gesteigerter Wirkung führte. Insgesamt liegt die Zukunft der Immuntherapien wohl in der Kombination mit anderen Wirkstoffklassen, die anti-tumorale Effekte verstärken oder immunsupprimierende Mechanismen inhibieren.

Analyse der Beteiligung von Toll-like-Rezeptoren an der DC-Aktivierung nach Parvovirus-H-1-Infektion

Ziel dieser Dissertation war es die funktionelle Rolle der Toll-like Rezeptoren (TLRs) und ihrer Signalwege bei der Aktivierung von dendritischen Zellen (DC) durch Parvovirus H-1- rn(H-1PV) induzierte Tumorzelllysate (TCL) zu untersuchen. rnDas angeborene Immunsystem bekämpft die Bildung und das Wachstum von Tumoren, insbesondere durch Interaktion von Effektor-Immunzellen mit Tumorzellen. Die Aktivierung dieser Immunreaktionen in der Antitumortherapie ist wünschenswert, aber in vielen Situationen nicht zufriedenstellend, da sie durch klassische systemische Therapie allein nicht immer erreicht werden kann. Die therapeutische Anwendung von onkolytischen Viren bei Patienten mit malignen Erkrankungen (Virotherapie) ist ein vielversprechendes Gebiet der Forschung. Die onkosuppressive und immunstimulierende Wirkung von H-1PV auf humane Tumor- und Immunzellen spricht für eine Verwendung in der Krebstherapie. Ein Aktivierung des Immunsystems durch H-1PV konnte bereits in unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden.rnIn dieser Arbeit wurden wichtige Aspekte bezüglich der Aktivierung von Toll-like Rezeptoren bei einer H-1PV Infektion untersucht. Zunächst wurde die Rolle von TLRs nach der H-1PV Infektion untersucht. Humane embryonale Nierenzellen (HEK293) wurden stabil mit humanen TLRs transfiziert, um die Rolle spezifischer TLRs während der Aktivierung des Immunsystems zu untersuchen. TLR3 und TLR9 wurden durch eine H-1PV Infektion, die mit der NFκB-Translokation in den Zellkern korreliert, aktiviert. Mit Hilfe eines Reporterplasmides (pNiFty-Luc), wurde durch erhöhte Expression eines NFκB-induzierbaren Reportergens die NFκB-Aktivität im Anschluss an eine H-1PV Infektion nachgewiesen. Zudem wurde die immunologische Wirkung von H-1PV-induzierten Tumorzelllysaten (TCL) auf die humane antitumor-gerichtete Immunantworten analysiert. Ein humanes ex vivo-Modell, bestehend aus einer HLA-A2-positiven humanen Melanom-Zelllinie (SK29Mel) wurde verwendet, um Immunreaktionen mit entsprechenden HLA-restringierten humanen DCs zu untersuchen. DCs die mit H-1PV-infizierten SK29Mel Zellen koinkubiert wurden, zeigten eine erhöhte TLR3- und TLR9-Expression. Diese Daten deuten darauf hin, dass H-1PV-induzierte TCLs humane DCs stimulieren und dies zumindest teilweise durch TLR-abhängige Signalwege geschieht. Demnach wird eine DC-Reifung durch Kokultur mit H-1PV-induzierten TCLs über den TLR-Signalweg erreicht und führte u.a. zu einer NFκB-abhängigen Aktivierung des adaptiven Immunsystems. Die onkolytischen Virotherapie mit H-1PV erhöht so durch unterschiedliche Auswirkungen auf DCs die Immunreaktion und verstärkt die Anti-Tumor-Immunität. Diese Ergebnisse zeigen einen neuen potenziellen Ansatz für den Einsatz onkolytischer Viren für TLR-zielgerichtete Therapieoptionen und stellen eine ideale Möglichkeit zur Erweiterung der Krebsbehandlung dar.rn

Die Expression und Regulation der CYP3A in menschlicher Haut

In Leber und Dünndarm bauen CYP3A-Enzyme eine Vielzahl von Fremdstoffen ab, die in den Körper gelangt sind. Zudem aber sind diese Enzyme auch in anderen Organen, wie der Haut exprimiert. Doch weder die genaue Zusammensetzung der CYP3A-Isozyme noch deren physiologische Rolle in der Haut sind bisher bekannt. Basierend auf begrenzten in vitro-Daten ist eine Rolle der CYP3A in der kutanen Vitamin D-Synthese denkbar. Auf der anderen Seite könnten die kutanen CYP3A auch lokal oder systemisch verabreichte Medikamente in der Haut verstoffwechseln und so zur Entstehung immunologischer und nicht-immunologischer unerwünschter Arzneimittelwirkungen beitragen, von denen sich bis zu 45 % in der Haut manifestieren.rnDie Arbeitshypothese dieses Projekts war, dass die CYP3A die kutane Synthese von Vitamin D regulieren. In dieser Funktion wurden sie zur Vermeidung von Vitamin D-Mangel-Erkrankungen wie Rachitis oder Osteomalazie in Europäern negativ selektiert. rnDie Expression und Regulation der CYP3A wurde in Hautbiopsien, einer Zelllinie epidermalen Ursprungs und primären Hautzellen wie auch in transgenen Mäusen untersucht. Die metabolische Aktivität der CYP3A gegenüber den kutanen Vitamin D-Vorstufen wurde mit Hilfe rekombinant exprimierter Enzyme untersucht. CYP3A5-mRNA war die häufigste der CYP3A in humanen Hautproben und überstieg die von CYP3A4 um das Dreifache, die von CYP3A7 um das 130-Fache. Damit entsprach diese 1,3 %, 0,01 % bzw. 0,01 % der jeweiligen hepatischen Genexpression. Die Expression von CYP3A43 war zu vernachlässigen. CYP3A5 zeigte eine bimodale Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. So zeigten Träger der Wildtyp-Allels *1 eine 3,3-fach höhere mRNA- und 1,8-fach höhere Proteinmenge als homozygote Träger des Nullallels *3. CYP3A4/7- und CYP3A5-Protein wurde v. a. in den Keratinozyten der Epidermis und den Talgdrüsen, also den Bereichen der kutanen Vitamin D-Synthese lokalisiert. Die CYP3A5-Expression wurde ferner in der Haut transgener Mäusen gezeigt, die das Reportergen Luziferase unter Kontrolle des humanen CYP3A5-Promoters exprimieren. Verglichen mit der Leber war die kutane Expression des Vitamin D-Rezeptors (VDR) 100-fach höher, die der Xenosensoren CAR und PXR vergleichbar bzw. zu vernachlässigen. Dementsprechend erhöhte die Behandlung mit 1,25-Dihydroxyvitamin D, dem aktiven Vitamin D-Hormon, und dessen Vorstufen außer 7-Dehydrocholesterol, jedoch nicht der PXR-Ligand Rifampicin, die Expression der CYP3A. Wie in Zwei-Hybrid-Experimenten gezeigt, wurden die Effekte des 1,25-Dihydroxyvitamin D und dessen Vorstufen alleinig durch VDR vermittelt. Die Effektstärke hingegen war abhängig von Zellspender, Zellpassage und Zelltypus. Alle drei CYP3A-Isozyme metabolisieren Vitamin D zu einem oder mehreren unbekannten Metaboliten, jedoch nicht zu 25-Hydroxyvitamin D, dem direkten Vorläufer des aktiven Vitamin D. rnZusammengefasst legen die Daten nahe, dass die kutanen CYP3A, allen voran CYP3A5, die Vitamin D-Homöostase durch VDR-vermittelte Induktion des Abbaus von Vitamin D-Vorstufen regulieren. Dies zusammen mit Sequenzdaten liefert starke Indizien für Vitamin D als treibende Kraft der Selektion des CYP3A-Lokus in Europäern. Der Einfluss der CYP3A-Expression auf selektiv wirksame, klinisch relevante Knochenveränderungen wie Rachitis oder Osteomalazie müssen folgen.rn