Einzelmolekülspektroskopie an einer homologen Reihe von Rylendiimiden und an einem bichromophoren Modellsystem für elektronischen Energietransfer

In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Fluoreszenzdynamik und zum Mechanismus des Photobleichens einzelner Farbstoffmoleküle einer homologen Reihe von Rylentetracarbonsäurediimiden durchgeführt. Mit der Erweiterung des elektronischen π-Systems verringert sich die HOMO/LUMO-Energiedifferenz, so dass strahlungslose Relaxationsprozesse gemäß des Energielückengesetzes zunehmen. Die konfokale Einzelmolekülspektroskopie in Kombination mit zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung ermöglicht es, Fluktuationen der inneren Konversionsrate zu detektieren. Der limitierende Faktor jedes Einzelmolekülexperiments ist die Photostabilität der Moleküle. Für die homologe Reihe konnten mindestens zwei Photobleichmechanismen identifiziert werden. Wenn Singulett-Sauerstoff durch Selbstsensibilisierung erzeugt werden kann, ist unter Luft die Photooxidation der wahrscheinlichste Mechanismus. Unter Ausschluss von Luftsauerstoff spielt die Bildung langlebiger Dunkelzustände eine entscheidende Rolle, die bevorzugt über höher angeregte Triplett- und Singulett-Zustände abläuft. Es wird angenommen, dass es sich hierbei um einen reversiblen Ionisierungsprozess handelt, bei dem das Radikal-Kation der Rylendiimide gebildet wird. Es konnte gezeigt werden, dass durch eine geeignete Wahl der Anregungsbedingungen die Dunkelzustandspopulierung verhindert und zugleich die Photostabilität der Fluorophore deutlich erhöht wird. Durch die Verknüpfung der beiden niedrigsten Homologen erhält man ein Donor-Akzeptor-Modellsystem, bei dem die Anregungsenergie mit hoher Effizienz vom Donor- auf den Akzeptor-Chromophor übertragen wird. In der Fluoreszenz einzelner Bichromophore wurden bei selektiver Anregung des Donors kollektive Auszeiten beobachtet, die durch effiziente Singulett-Triplett-Annihilation verursacht werden.

Relaxationsuntersuchungen in unterkühlten und glasig erstarrten Polyalkoholen mittels dielektrischer und NMR Spektroskopie

Es wurde eine homologe Reihe von Polyalkoholen mit der allgemeinen Summenformel CNHN+2(OH)N (N=3-6) hinsichtlich ihrer Glaseigenschaften ober- und unterhalb der Glasübergangstemperatur TG untersucht. Dabei kamen die dielektrische und magnetische Resonanzspektroskopie (NMR) zum Einsatz. Es ergab sich oberhalb TG eine systematische Zunahme aller untersuchten dynamischen Parameter wie Fragilität, Breite der angenommenen Korrelationszeitenverteilungen und der Sprungwinkel der primären Glasrelaxation mit zunehmendem N. Dies kann insgesamt als eine Abnahme des Netzwerkcharakters, der durch Wasserstoffbrückenbindungen bedingt ist, bei zunehmender Kettenlänge interpretiert werden. Unterhalb TG entwickelt sich mit zunehmendem N die Sekundärrelaxation von einem 'Wing Szenario' zu einem ausgeprägten Johari - Goldstein (JG) - Prozess. Ein Sprungmodell, welches eine eingeschränkte Reorientierung auf einem Konusrand beschreibt, erzeugt mit Hilfe der parametrisierten dielektrischen Verlustspektren Sprungwinkel, die mit denen aus aktuellen ²H - NMR spektroskopischen Untersuchungen vergleichbar sind. Durch den Vergleich unterschiedlich deuterierter Derivate von Glyzerin (N=3) und Sorbitol (N=6) wurde gefolgert, dass auch unterhalb TG der Netzwerkcharakter mit zunehmender Kettenlänge abnimmt.Aufgrund der hier durchgeführten Untersuchungen konnte eine Zeitskala für einen Johari - Goldstein - Prozess im Modellglasbildner Glyzerin extrapoliert werden. Eine Deutung des Wings als Hochfrequenzausläufer des JG - Prozesses ist dadurch möglich.Der JG - Prozess kann somit als universeller Glasprozess interpretiert werden, der in verschiedenen Glasbildnern in unterschiedlicher Ausprägung auftritt.

Einzelmolekülspektroskopische Untersuchung von Rylenfarbstoffen zur elektronischen Wechselwirkung in multichromophoren Systemen und zur thermischen Besetzung molekularer Schwingungszustände

Im ersten Teil der Arbeit wurde die Abstandsabhängigkeit des elektronischen Kopplungsverhaltens für eine homologe Reihe von Perylendiimid-Dimeren (PDI-(Ph)x-PDI, x=0-3) mithilfe der Einzelmolekülspektroskopie bei tiefen Temperaturen untersucht. Während für große Abstände überwiegend „schwache“ Kopplung dominierte, wurde für den kleinsten Abstand „starke“ Kopplung gefunden. Im Gegensatz dazu zeigte das p-Phenylen-verbrückte Dimer (x=1) in Abhängigkeit vom untersuchten Molekül ein für beide Grenzfälle typisches Verhalten. Hier entscheidet die Größe der Kopplungsstärke im Vergleich zum statischen Energieunterschied, welcher Kopplungsmechanismus vorliegt. Die homologe Reihe ermöglichte zusätzlich die quantitative Untersuchung der Abstandsabhängigkeit der elektronischen Kopplungsstärke im Grenzfall „schwacher“ Kopplung. Sie konnte direkt aus der zugrunde liegenden Energietransferdynamik ermittelt werden. Der Vergleich mit quantenchemisch berechneten Werten lieferte eine gute Übereinstimmung. Die Abweichung betrug lediglich 20%.rnIm zweiten Teil der Arbeit wurde die thermische Besetzung der Schwingungszustände einzelner Terrylen-Moleküle untersucht. Im elektronischen Grundzustand konnte sie mithilfe von anti-Stokes-Fluoreszenz infolge von „Hot Band“ Absorption nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde Fluoreszenz aus höheren Schwingungszuständen des elektronisch angeregten Zustandes gefunden, die auf „Hot Band“ Emission infolge von thermischer Besetzung zurückgeführt werden konnte. Durch die Kombination von Emissions- und Anregungsspektroskopie konnte die Temperaturabhängigkeit beider Prozesse im Temperaturbereich von 209-311 K untersucht werden. Sie folgt der Boltzmann-Statistik, was eine Temperaturmessung mit einzelnen Molekülen ermöglicht. rn

Selektive und duale COX-1-, COX-2-Inhibitoren aus der Reihe der Methanone

Zusammenfassung: Prostaglandine (PG) sind wichtige biologische Entzündungsmediatoren, die aus der Arachidonsäure (AA) durch das Enzym Cyclooxygenase (COX) entstehen. Trotz einiger unerwünschter Wirkungen, sind Cyclooxygenase-Hemmer Mittel der Wahl zur Unterdrückung entzündlicher Prozesse. Von der Cyclooxygenase existieren zwei Isoenzyme: COX-1 und COX-2. Eine selektive Hemmung der COX-2 bzw. eine duale Hemmung der COX-1 und COX-2 wird als erfolgversprechendes Prinzip zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen diskutiert.Ziel der Arbeit war die Synthese und in vitro Testung sowie die Erstellung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen selektiver bzw. dualer Hemmstoffe der COX-1/-2. Zusätzlich wurden die Substanzen auf inhibitorische Aktivität gegenüber der 5- und 12-Lipoxygenase untersucht.Ausgehend von der Struktur selektiver Hemmstoffe der COX-2 bzw. von dualen COX-1/ COX-2-Inhibitoren sowie von marktüblichen nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAR), wurde das Diarylmethanon-Element als Basis gewählt. An diesem Strukturelement wurden Modifikationen vorgenommen, um selektive Hemmstoffe der COX-2 bzw. duale COX-1/ COX-2-Hemmstoffe zu erhalten.Die synthetisierten Verbindungen lassen sich in [4-(Methylsulfanyl)phenyl]- und [4-(Methylsulfonyl)phenyl](aryl)methanone, N-(Aroylphenyl)sulfonamide und -amide sowie (Hydroxyphenyl)(2-thienyl)methanone unterteilen.In der Reihe der [4-(Methylsulfanyl)phenyl](aryl)methanone sind potente Hemmstoffe sowohl der COX-1 als auch der COX-2 erhalten worden. Im Gegensatz dazu zeigen die [4-(Methylsulfonyl)phenyl](aryl)methanone gegenüber COX-1 und COX-2 keine inhibitorische Aktivität. Mit dem 2-Thienylderivat wurde ein potenter, dualer Hemmstoff beider Cyclooxygenase-Isoenzyme identifiziert, dessen Wirkstärke (bezüglich der COX-2) auf den Austausch von Phenyl gegen 2-Thienyl zurückzuführen ist.Die N-(Aroylphenyl)sulfonamide und -amide bilden die umfangreichste Gruppe bei den durchgeführten Untersuchungen, wobei besonders die regioisomeren N-(2-Aroylphenyl)sulfonamide und -amide eingehender studiert wurden. Auf der Basis der (2-Aroylphenyl)sulfonamide läßt sich für die Hemmung der COX-1 eine Struktur-Wirkungs-Beziehungen formulieren, die anhand Hilfe geeigneter Verbindungen überprüft wurde. Die Untersuchungen wurden zum Teil auch auf die 3- und 4-Regioisomeren ausgedehnt, wobei sich die erhaltenen Struktur-Wirkungs-Beziehungen bestätigten. Die Arylsulfonamide inhibieren bevorzugt die COX-1. Auch (4-Aroylphenyl)sulfonamide wurden auf mögliche inhibitorische Aktivität untersucht. Die Einbindung des Amidstickstoffs in ein Indolin- bzw. Tetrahydrochinolin-Ringsystem oder des Sulfonamids in ein 1,3-Propansultam führte in jedem Falle zu wenig aktiven Verbindungen gegenüber der COX-1. N-(2-Aroylphenyl)amide zeigten in Übereinstimmung mit der Hypothese an der COX-1 eine gute inhibitorische Aktivität.Aus der Reihe der (Hydroxyphenyl)(2-thienyl)methanone wurden die freien Alkohole, die Methylether und verschiedene Ester dargestellt und auf COX-1-Aktivität untersucht. Acetate, aber auch Phenole sind die potentesten Inhibitoren der COX-1. Als günstigte Positionen für die 2-Thienylcarbonyl-Einheit am Hydroxyphenylrest erweist sich die ortho- bzw. para-Position.

Funktionale Analyse des CpY/DmX Gens aus Chironomus und Drosophila melanogaster

Zusammenfassung: Funktionale Analyse des CpY/DmX Gens aus Chironomus und Drosophila melanogaster Bei CpY und DmX handelt es sich um homologe neuartige Gene aus den Dipteren Chironomus piger und Drosophila melanogaster. CpY und DmX bestehen aus 15 Exons, die für eine mRNA von ca. 11,5 kb kodieren.Das Gen hat eine genomische Länge von ca. 15 kb. Die abgeleiteten Genprodukte sind durch eine hohe Anzahl von WD-Repeats gekennzeichnet.WD-Proteine besitzen in der Regel regulatorische Funktionen in allen möglichen Bereichen. Ein Strukturvergleich mit homologen Genen legt die Vermutung nahe, daß sich sowohl am N- als auch am C-Terminus eine WD-Propellerstruktur befindet. CpY aus Chironomus piger ist in einem hromosomalen Abschnitt lokalisiert, der den Kern eines evolvierendenGeschlechtschromosoms darstellt. Dieses Gen besitzt im Gegensatz zu DmX geschlechtsspezifisch in Introns integrierte Transposons und wird quantitativ geschlechtsspezifisch gespleißt. DmX ist auf dem X-Chromosom im Bereich 5D6-5E1 lokalisiert, es konnte jedoch kein geschlechtsspezifisches Expressionsmuster diagnostiziert werden. Die Transkriptionsanalyse ergab,daß DmX während der Oogenese und der gesamten Embryonalentwicklung transkribiert wird. Dabei wird neben einer ubiquitären Grundexpression DmX in einer gewebespezifischen Weise exprimiert. Die DmX-Transkriptewandern offensichtlich - wie die CpY-Transkripte - in großer Menge in die reifende Oozyte. Bei DmX/CpY könnte es sich also um ein maternales Effektgen handeln. Während der Embryogenese können zunächst DmX-Transkripte am posterioren Pol nachgewiesen werden. Danach färben die vorderen und hinteren Mitteldarmvorläufer, dann spezifische Zellen im ZNS und in reifen Embryonen das gesamte ZNS, Sinnesorgan-Anlagen im Kopf, sowie der Enddarm. Das dem DmX benachbarte Gen DmSPX, welchen mit diesem einen gemeinsamen 174 bp großen bidirektionalen Promoter besitzt, zeigt ein von DmX unterschiedliches Transkriptionsmuster. Mit einer Reihe von Keimbahntransformationen konnten die für eine ordnungsgemäße Expression hinreichenden regulatorischen Bereiche identifiziert werden. In Versuchen, mittels verschiedener 'Antisense'-Strategien einen Phänotyp zu generieren, konnte kein spezifischer Phänotyp nachgewiesen werden. Durch die erfolgreiche Keimbahntranformationeines Rettungsvektors, welcher ein intaktes DmX-Gen enthält, konnte der Phänotyp von EMS-DmX-Mutanten identifiziert werden: Nach anfänglich normaler Embryonalentwicklung werden die Larven im Laufe des L1-Stadiums schlaff und inaktiv, jedoch nicht paralytisch und stellen Bewegung und Nahrungsaufnahme ein. Kurz nachdem wildtypische Larven das L2-Stadium erreichen, sterben die Mutanten ab. Der Phänotyp wei'st starke Ähnlichkeit zu Synaptotagmin I-Mutanten und zu alpha-Adaptin-Mutanten auf. Das Transkriptionsmuster ähnelt dem von alpha-Adaptin und AP50. Alle diese Gene spielen in der Endozytose eine Rolle

Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium

'Bcl-2-homologe Proteine aus dem Schwamm Geodia cydonium: Klonierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von Apoptose-Regulatoren der Porifera'. Auf der Suche nach der molekularbiologischen Grundlage der Apoptose in den Porifera, dem phylogenetisch ältesten Metazoen-Tierstamm, wurden Mitglieder der apoptoseregulatorischen Bcl?2 Familie unter Anwendung diverser Techniken im Schwamm G. cydonium identifiziert: GCBHP1 und GCBHP2. Detaillierte Analysen offenbarten Bcl-2-charakteristische Signaturen sowie eine durch apoptotische Stimuli induzierbare Expression. Die parallele HSP70-Induktion zeugte von der GCBHP2-Expression als Teil einer antiapoptotischen Streßantwort zum Schutz des Organismus'. Die kontinuierliche Transkription des im Rahmen dieser Arbeit gleichfalls klonierten Proliferationsmarkers SEP1 veranschaulichte zudem die Effektivität dieser Streßreaktion. Mit der Herstellung eines rekombinanten Proteins und der Gewinnung eines Antiserums konnte auch die streßinduzierte Proteinexpression des GCBHP2 verfolgt werden. Zum Zweck der Funktionsstudie wurden Säugetierzellen (HEK-293, NIH/3T3) mit einem GCBHP2-Konstrukt stabil transfiziert und auf die Expression des Schwammproteins untersucht. Diese Zellen unterschieden sich bereits phänotypisch von mock-transfizierten Zellen. Immunzytochemische Untersuchungen enthüllten eine für antiapoptotische Bcl-2 Proteine charakteristische Assoziation mit Mitochondrien. Unter dem Einfluß zweier apoptotischer Stimuli wurde für GCBHP2-transfizierte Zellen eine vierzehn-/sechsmal höhere Vitalität und eine reduzierte Aktivierung der Caspase-Kaskade registriert (im Vergleich zu mock-transfizierten Kontrollen). Somit wurde der antiapoptotische Charakter des GCBHP2 und die Existenz apoptotischer Mechanismen in den Porifera bestätigt.

Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung des Dmxl1-Gen in Mus musculus sowie die funktionelle Analyse durch Knock-Out

Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung des Dmxl1-Gen in Mus musculus sowie die funktionelle Analyse durch Knock-OutrnrnBei Dmxl1 handelt es sich um ein neuartiges Gen aus Mus musculus. Das ebenfalls in der vorliegenden Arbeit bioinformatisch untersuchte Gen DMXL1 ist das zu Dmxl1 homologe Gen des Menschen. Beide Gene bestehen aus 43 Exons, das murine Dmxl1 codiert für eine mRNA von 10992 bp bzw. 12210 bp, das humane DMXL1 kodiert für eine cDNA von 11082 bp, der offene Leserahmen umfasst bei der Maus 9042 bp. In der Maus konnte ein mögliches alternatives Polyadenylierungssignal identifiziert werden. Zwischen beiden Spezies sind die Exonpositionen und ihre Längen hoch konserviert. Dmxl1 liegt auf dem Crick-Strang von Chromosom 18 Bande C, der translatierte Bereich erstreckt sich auf genomischer Ebene über 129558 bp und die Orientierung verläuft in Richtung Centromer. Dmxl1 und DMXL1 gehören damit zu den größten bekannten Genen in Maus und Mensch. Bei beiden Spezies liegen die DmX-Homologen genomisch innerhalb eines Bereichs der Isochoren-Klasse L1 in einer Gen-armen Region. Die Anzahl der repetitiven Elemente innerhalb der Genregion von Dmxl1 liegt 6% unter dem erwarteten Wert eines L1 Isochors, die Anzahl beim Menschen liegt 4% über dem erwarteten Wert. Um die mögliche Promotorstruktur von Dmxl1 darzustellen, wurden umfangreiche in silico-Analysen der Region um den putativen Transkriptionsstart vorgenommen. Mit Hilfe der gewonnenen Daten konnte ein Transkriptionstartpunkt identifiziert werden. Zudem wurde eine Promotorstruktur erarbeitet, bei der angenommen werden kann, dass sie eine gute Näherung an die tatsächlich vorhandenen Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren darstellt. Die mit bioinformatischen Werkzeugen erzeugte virtuelle Promotor- und Enhancerstruktur zeigt das Potenzial, Dmxl1 basal und ubiquitär zu exprimieren. Gleichzeitig zeigen diese Daten, dass Dmxl1 vermutlich in einigen Geweben der Keimbahn, im Fettgewebe, dem blutbildenen System und während der Embryogenese hochkomplex reguliert werden kann. Eine regulierte Expression zur Steuerung des Energiestoffwechsels ist ebenfalls wahrscheinlich. Diese Ergebnisse passen sehr gut zu den experimentell ermittelten Daten und den beobachteten Phänotypen Dmxl1-chimärer Mäuse.rnDie abgeleitete Aminosäuresequenz umfasst in der Maus 3013 AS, im Menschen 3027 AS, der Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigt eine Identität von 89,3 % und eine Similarität von 94,7 % zwischen beiden Spezies. Im Dmxl1/DMXL1-Protein von Maus und Mensch konnten mindestens 24 und maximal 36 WD-Wiederholungseinheiten identifiziert werden, zudem wurden eine Reihe weiterer konservierter Proteinmotive gefunden. Die in silico-Strukturanalysen beider abgeleiteter Aminosäuresequenzen lässt vermuten, dass sich C- und N-terminal WD-Propellerstrukturen befinden. In dieser Arbeit gelang eine C-terminale Rekonstruktion einer 10-blättrigen Propellerstruktur, denkbar ist jedoch auch eine Struktur mit mindestens drei WD-Propellern, wenn eine prädominante Struktur mit Propellern aus jeweils sieben Propellerblättern angenommen wird.rnDas primäre Ziel dieser Arbeit, die Etablierung einer stabilen Mauslinie mit diruptiertem Dmxl1-Gen konnte aufgrund einer beobachteten Haploinsuffizienz nicht erreicht werden. Trotz zahlreicher Transformationen von Maus-Stammzelllinien konnte letztlich nur eine stabil transformierte Linie mit einem Dmxl1-Null-Allel identifiziert werden, was auch zu den theoretischen Daten und den angenommenen Aufgaben von Dmxl1 als komplex und diffizil reguliertes Multifunktions-Protein passt. Aus der transformierten Mauszelllinie konnten chimäre Mäuse entwickelt werden, die in Abhängigkeit von dem Ausmaß des Chimärismus phänotypisch massive Schädigungen aufwiesen. Neben einer Teilsterilität wurden massive Fettleibigkeit und ein ausgeprägter Hypogonadismus beobachtet. Keines der Tiere war in der Lage das Dmxl1-Null-Allel zu transduzieren. Die Tiere waren nur sehr eingeschränkt fertil, die wenigen Nachkommen entsprachen genotypisch und phänotypisch ausschließlich den verwendeten Blastocysten.rn

Bedeutung endogener Faktoren für Steady-State-Level und Reparatur oxidativer DNA-Modifikationen in Säugerzellen

Die endogene Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) - wie beispielsweise Hydroxyl-Radikale, Superoxid-Radikalanionen, Wasserstoffperoxid und Singulett-Sauerstoff - bei essentiellen Stoffwechselreaktionen in allen aeroben Lebewesen stellt eine potentielle Gefahr für die Integrität der DNA in jeder Zelle dar. ROS generieren in der DNA unter anderem oxidative DNA-Modifikationen (zum größten Teil wahrscheinlich 8-Hydroxyguanin (8-oxoG)), welche wiederum zu einem Teil zu Mutationen führen.In dieser Arbeit wurden Untersuchungen vorgenommen, in welchem Ausmaß zum einen die Steady-State-Level oxidativer DNA-Schäden in Säugerzellen zum anderen die Reparaturgeschwindig-keiten solcher DNA-Modifikationen durch verschiedene endogene Faktoren beeinflußt werden.Im Mittelpunkt der Arbeit stand dabei die Charakterisierung der 8-Hydroxyguaninglykosylase der Säugerzellen. Sie ist das Produkt des OGG1-Gens, das erst 1997 kloniert wurde. In transfizierten Zellinien konnte durch eine konstitutive Überexpression des menschlichen OGG1-Gens demonstriert werden, daß die Reparatur von induzierten oxidativen Basenmodifikationen bis zu dreifach beschleunigt wird und daß eine Korrelation zwischen dem Grad der Überexpression und der Reparaturrate besteht. Dagegen waren die Steady-State-Level der oxidativen DNA-Schäden durch die Überexpression unbeeinflußt. Sowohl bei den spontanen Mutationsraten als auch bei den durch oxidative Schädigungen induzierten Mutationsfrequenzen konnte keine Erniedrigung bedingt durch die hOGG1-Überexpression beobachtet werden.Weitere Untersuchungen zur Bedeutung von Ogg1-Protein konnten in Mäusezellen durchgeführt werden, in denen das OGG1-homologe Mäusegen, mOGG1, homozygot inaktiviert (mOGG1(-/-)) worden war. Hierbei konnte gezeigt werden, daß in den mOGG1-defizienten Zellen im Vergleich zu den entsprechenden Wildtyp-Zellen (mOGG1(+/+)) eine Reparatur induzierter oxidativer Basenmodifikationen erst nach 8 h einsetzt, während in den Kontrollzellen schon nach 3-4 h 50 % der Modifikationen repariert waren. Die Steady-State-Level oxidativer Modifikationen in mOGG1(-/-)-Zellen waren in immortalisierten, schnell proliferierenden Mäusefibroblasten nur um den Faktor 1.4, in primären Mäusehepatocyten jedoch um den Faktor 2.5 gegenüber den Wildtyp-Zellen erhöht.Inwieweit das menschliche Reparaturprotein Xrcc1 (X-ray repair cross complementing group 1) auch an der Prozessierung oxidativer DNA-Modifikationen beteiligt ist, und ob dabei möglicherweise eine Interaktion mit Ogg1 vorliegt, wurde in der XRCC1-defizienten CHO-Zellinie EM9 untersucht. Dabei wurde ermittelt, daß weder die Steady-State-Level noch die Reparaturkinetiken der oxidativen Basenmodifikationen durch die XRCC1-Defizienz beeinflußt werden. Aufgrund weiterer Ergebnisse kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß das Xrcc1-Protein zumindest am Ligationsschritt während der Reparatur oxidativer DNA-Schäden beteiligt ist.In einem weiteren Schwerpunkt der Arbeit wurde untersucht, ob Unterschiede im Steady-State-Level in Abhängigkeit von Organ-, Gewebe- und Zelltyp auftreten. Dazu wurden Untersuchungen in Bronchialkarzinom-Zellinien verschiedener Subtypen durchgeführt. Des weiteren wurde zur Frage der Zelltyp-Abhängigkeit in der menschlichen Zellinie HL60 der Einfluß des Zelldifferenzierungsstadiums auf die Steady-State-Level untersucht.

Differenzielle Expression von Tubulin-Genen bei der Entwicklung von Blattzellen der Gerste (Hordeum vulgare L.)

Die Morphogenese einer Pflanzenzelle wird in großem Maße durch die Dynamik kortikaler Mikrotubuli (MT) bestimmt, die auf die Zellwandsynthese Einfluß nehmen. In dieser Arbeit wurden die Transkriptmengen der alpha-Tubulin-Isotypen und des gamma-Tubulin während der Entwicklung des Gerstenblattes analysiert, um Zusammenhänge zu bereits beschriebenen Umwandlungen im kortikalen MT-Cytoskelett der Mesophyllzellen aufzudecken. Erstmals konnte bei einer höheren Pflanze die Genexpression auf RNA-Ebene innerhalb einer Tubulin-Multigenfamilie im Verlauf der Blattentwicklung umfassend dargestellt werden.Es wurden blattspezifische cDNA-Bibliotheken erstellt und mittels RT-PCR homologe DNA-Gensonden für die Screeningprozesse der cDNA-Bibliotheken hergestellt. cDNA-Sequenzen von alpha-, beta-, und gamma-Tubulin konnten isoliert werden. Weitere, weniger abundante alpha-Tubulin-Sequenzen wurden während zusätzlicher Screeningrunden über PCR-Ausschluß häufig vertretener, bereits bekannter Isotypen isoliert.Die cDNA-Sequenzen von insgesamt fünf verschiedenen Isotypen des alpha-Tubulin konnten aufgeklärt werden, drei Isotypen wiesen bis zu fünf im nicht kodierenden 3´-Bereich verkürzte Varianten auf, die aber in ihrer Anzahl deutlich unterrepräsentiert waren. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen umfassten bei drei Isotypen 451 Aminosäuren (AS), zwei Isotypen waren im C-Terminus um eine bzw. um zwei AS kürzer. Die fünf alpha-Tubulin-Isotypen wiesen charakteristische Expressionsmuster auf, die in drei Klassen unterteilbar waren. Die Isotypen HVATUB1 und HVATUB5 (MT-Band-Isotypen) hatten den maximalen Gehalt in Blattbereichen, in denen auch hauptsächlich Mesophyllzellen mit kortikalen MT-Bänderungen vorkommen, wobei HVATUB5 den am schwächsten exprimierte Isotyp darstellte. HVATUB3 (Random-MT-Isotyp) zeigte die stärksten Expressionsraten. Die im Meristem und meristemnahen Bereichen bereits recht hohe Abundanz erreichte erst nach der Zellstreckungszone in einer Blattzone das Maximum, in dem hauptsächlich Mesophyllzellen mit zerstreut angeordneten MT anzutreffen sind. Die Isotypen HVATUB2 und HVATUB4 (MImax-Isotypen) waren in mitotisch aktiven, basalen Blattbereichen dominant.Die cDNA-Sequenz vom gamma-Tubulin der Gerste, HVGTUB, wurde ermittelt; die abgeleitete Aminosäuresequenz bestand aus 469 AS. Das Auftreten einer im nicht kodierenden 3´-Bereich kürzeren Variante konnte erstmals bei pflanzlichem gamma-Tubulin beschrieben werden. Southernblot-Analysen ließen darauf schließen, daß gamma-Tubulin nur als Einzelkopie im Genom der Gerste vorkommt. gamma-Tubulin wurde im mitosereichen Meristem der Blattbasis am stärksten exprimiert. Da die Abnahme der Transkriptmenge weitaus langsamer verlief als die Abnahme der Zellteilungsaktivität, ist anzunehmen, daß gamma-Tubulin neben der Erfüllung von mitose- und zellteilungsspezifischen Funktionen auch eine Rolle im Zusammenhang mit der Dynamik des kortikalen MT-Cytoskeletts spielt. Einen ersten Schritt zur Aufklärung der Genfamilie des beta-Tubulin bei Gerste stellt die Isolierung drei verschiedener cDNA-Sequenzen von beta-Tubulin dar.

Tandem repetitive DNA: Stabilität und Wirkung auf die Genexpression im transgenen System

Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Eigenschaften von tandem repetitiver DNA (trDNA) analysiert. Drei der untersuchten trDNA-Familien (Cla-Elemente, Alu-Elemente, 1,688-Satelliten-DNA) stammen aus der genomischen DNA von Insekten, während ein trDNA-Cluster artifiziell aus Hsp70 Promotoren hergestellt wurde. Untersucht wurde die Stabilität dieser trDNA-Sequenzfamilien innerhalb eines Plasmidvektors in E. coli bzw. nach Integration der trDNA auch im Genom von D. melanogaster. Der Schwerpunkt der Arbeit liegt jedoch in der Analyse des Einflusses von trDNA auf die Expression eines benachbarten Reportergens in D. melanogaster.Ziel der Untersuchungen zur Stabilität war es, Eigenschaften von trDNA-Clustern und Mechanismen aufzuzeigen, die die Stabilität derselben in E. coli und im Genom von D. melanogaster beeinflussen. Mit Ausnahme der Alu-Elemente zeigen alle trDNA-Familien eine deutliche Instabilität in E. coli. Am Beispiel der Cla-Elemente wurde gezeigt, daß spezifische Eigenschaften der trDNA-Familie, wie etwa die sequenzbedingte Krümmung der Helixachse, keinen Einfluß auf die Stabilität des trDNA-Clusters haben, sondern die Orientierung des trDNA-Clusters innerhalb des Vektors ausschlaggebend ist. Ein entscheidender Faktor könnte die Orientierung des trDNA-Clusters relativ zur Wanderungsrichtung der Replikationsgabel in E. coli sein. Am Beispiel des trDNA-Clusters aus artifiziellen Hsp70 Promotoren konnte gezeigt werden, daß verschiedene Rekombinationssysteme an der Instabilität in E. coli beteiligt sind. Die meisten beobachteten Deletionen von trDNA sind RecA-abhängig. Zusätzlich findet jedoch in einem kleinen Teil der Plasmide auch eine RecA-unabhängige Rekombination statt. Sowohl in E. coli als auch in D. melanogaster wurde als vorherrschender Mechanismus der trDNA-Instabilität die homologe Rekombination identifiziert. TrDNA-Cluster, die in E. coli deutlich instabil sind, können jedoch im Genom von D. melanogaster weitgehend stabil sein. Auch Faktoren, die in E. coli die Stabilität eines trDNA-Clusters beeinflussen, wie etwa die Orientierung, zeigen in D. melanogaster keinen Einfluß auf die Stabilität der trDNA-Cluster. Ergebnisse aus Stabilitätsuntersuchungen in E. coli können damit nicht ohne Überprüfung auf andere Organismen übertragen werden. Im Hauptteil der Arbeit sollte geklärt werden, ob trDNA generell die Expression benachbarter Gene beeinflußt und welche Eigenschaften der trDNA für diesen inhibitorischen oder stimulierenden Effekt verantwortlich sind. Keine der untersuchten trDNA-Familien zeigt einen inhibitorischen Effekt auf ein benachbartes Reportergen. Entgegen dem Modell von Dorer und Henikoff (1994) führen trDNA-Cluster nicht per se zu der Entstehung von Heterochromatin. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, daß sowohl ein trDNA-Cluster aus Cla-Elementen als auch aus Hsp70 Promotor-Elementen eine deutliche Steigerung der Expression des miniwhite-Reportergens bewirken. Diese Steigerung ist für beide trDNA-Familien unabhängig von der chromosomalen Lage des Transgens im Euchromatin. In beiden Fällen ist der Effekt von der Orientierung des trDNA-Clusters abhängig und verstärkt sich mit wachsender Kopienzahl der trDNA-Einheiten. Während eines der trDNA-Cluster aus trDNA-Einheiten besteht, die bekanntermaßen eine Promotoraktivität aufweisen (Hsp70 Promotoren), war für die Cla-Elemente kein Einfluß auf die Expression eines benachbarten Gens bekannt. Damit wurde für eine trDNA-Familie aus Chironomus nachgewiesen, daß sie auf ein benachbartes Gen ähnlich wirkt wie zusätzliche Promotoren. Die experimentellen Befunde unterstützen ein Modell, demzufolge die Cla-Elemente in gleicher Weise wie tandem repetitive Promotoren auf ein benachbartes Gen expressionssteigernd wirken. Die TATA-Box ist für das Modell ein wichtiges Strukturelement, da diese in beiden expressionssteigernden DNA-Sequenzen der trDNA-Cluster vorkommt und ausschließlich in einer Orientierung wirkt. Das Modell besagt, daß durch die Verbindung einer offenen Chromatinstruktur mit korrekt orientierten Bindungsstellen für TBP der Aufbau von vollständigen Transkriptionskomplexen an den tandem repetitiven Promotoren initiiert wird. Einer Perlenschnur ähnlich wären die Transkriptionskomplexe direkt verfügbar, nachdem ein Transkriptionskomplex den Promotor zur Transkription verlassen hat (Abb. 32). Dies würde zu der beobachteten Steigerung der Expression des Reportergens sowohl durch die tandem repetitiven Hsp70 Promotoren als auch durch die Cla-Elemente führen.

Funktionelle Zusammenhänge zwischen Expressionsveränderungen des von Hippel-Lindau Tumorsuppressorgens und dessen potentiellen Zielgenen in sporadischen Nierenzellkarzinomen

ZusammenfassungNierenzellkarzinome (NZK) sind häufig gekennzeichnet durch den Funktionsverlust des von Hippel-Lindau Tumorsuppressorgens (VHL TSG). Man kennt heute eine Reihe potentieller Kandidatengene, die eventuell in Wechselwirkung mit dem VHL-Genprodukt stehen (VEGF, c-fos, c-myc). Zur Aufklärung der molekularen Vorgänge, die zur Pathogenese der gut vaskularisierten Nierenzellkarzinome beitragen, wurden NZK-Zellinien untersucht. Vektorkonstrukte wurden generiert, um das in vitro und in vivo Wachstumsverhalten vor und nach Transfektion zu beobachten. Mit Hilfe eines GFP-Fusionsproteins wurden zusätzlich Hinweise auf die intrazelluläre Lokalisation des VHL-Genproduktes (pVHL) geliefert. Nach Abschluß der vorliegenden Studien zeigte sich eine direkte Abhängigkeit der beiden Gene VHL und VEGF. Sowohl die in vitro als auch die in vivo Ansätze bewiesen eine Interaktion der beiden Gene. Die Frage nach einer Interaktion von pVHL mit den Genprodukten Fos und Myc läßt sich jedoch nicht eindeutig beantworten. Die Expressionsveränderungen dieser Gene erfolgten scheinbar willkürlich, eine Interaktion konnte nicht bestätigt werden.Die Lokalisation des VHL-Genproduktes ist von Fall zu Fall unterschiedlich, ein Zusammenhang mit den verschiedenen Funktionen des VHL-Gens ist demnach wahrscheinlich. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß das VHL TSG eine Rolle bei der Kontrolle der Angiogenese spielt, eine Interaktion mit VEGF ist mehr als wahrscheinlich. Zukünftig sind bei der Aufklärung des Pathomechanismus von Nierenzellkarzinomen deshalb vor allem Studien nötig, die dem VHL TSG als Angiogeneseinhibitor eine zentrale Bedeutung bei der Heilung sporadischer Tumoren mit starker Vaskularisierung zukommen lassen.

Struktur, Funktion und potentielle Anwendung der PKC- und SNZ,SNO-Promotoren aus Geodia cydonium und Suberites domuncula

Die Schwämme (Porifera) sind eine reiche Quelle bioaktiver Naturstoffe. Viele dieser Naturstoffe besitzen das Potential, als Pharmazeutika, molekulare Sonden usw. eingesetzt oder weiterentwickelt zu werden. Die Beschaffung dieser Naturstoffe in ausreichenden Mengen stellt jedoch eines der größten Probleme bei der Testung und Produktion vielversprechender Substanzen dar. Der Transfer von DNA in Schwammzellen bzw. in komplette Organismen wäre ein vielversprechender Ansatz, dieses Problem zu lösen. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die Funktion und Struktur homologer Promotoren zu untersuchen und eine Methode des Gentransfers in Schwammzellen auszuarbeiten. Zu diesem Zweck wurde zusätzlich zu der bereits vorhandenen 5'-flankierenden Region des conventional PKC-Gens aus Geodia cydonium eine genomische Bibliothek von Suberites domuncula konstruiert, um diese mit Hilfe des DNA-Homologiescreenings nach den 5'-flankierenden Regionen des cPKC- und des SNZ (SnooZe)-Gens (SD_SNZG) zu durchsuchen. Die Klonierung und Sequenzierung sowohl des 5'-Bereichs als auch die Charakterisierung der Exon-Intron Struktur beider Gene wurde erfolgreich durchgeführt. In der 5'-Region des SNZ-Gens konnte dabei ein weiteres Gen (SD_SNO; SNZ proximal Open Reading Frame) identifiziert werden, das in einer 'Kopf-an-Kopf' Anordnung zu SD_SNZG orientiert ist. Sowohl SD_SNZG als auch SD_SNO wurden hochkonservierten Genfamilien zugeordnet, deren Vorkommen in Metazoen hier erstmals beschrieben wird.Funktionelle Studien mit Hilfe der Reportergene Luciferase und Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) im heterologen System der NIH 3T3 Zellen wiesen sowohl dem cPKC-Promotor aus G. cydonium als auch dem SNZ-Promotor aus S. domuncula eine starke Promotoraktivität im Verhältnis zum SV40-Promotor nach. Die Aktivität des cPKC-Promotors aus S. domuncula dagegen war relativ schwach. Darüber hinaus konnte geklärt werden, daß die 5'-flankierende Region des SNZ-Gens bidirektionale Promotoraktivität aufweist und daß der G. cydonium cPKC-Promotor keine TATA-Box besitzt, sondern eine GC-Box für die basale Funktion benötigt.Als geeignete Methode zur Transfektion von Zellen des Schwamms S. domuncula erwies sich der ballistische Gentransfer mit Hilfe der Gene Gun. Homologe Promotoren konnten die sichtbare Expression des Reportergens EGFP jedoch nicht bewirken. Nur der virale CMV-Promotor erwies sich als hierfür geeignet.

In-situ-Hochtemperatur-Mössbauer-Spektroskopie und Bandstruktur-Rechnungen an Eisennitriden und gemischtvalenten Verbindungen

Zusammenfassung

Die stöchiometrischen Eisennitride g'-Fe₄N, e-Fe₃N und z-Fe₂N sind durchRöntgen- und Neutronenstreuung gut charakterisiert. Allerdings weist das Fe/N-Phasendiagramm noch vieleungeklärte Stellen auf. So konnten im Bereich von alpha-Fe bis g'-Fe₄N noch keine weiterenNitride isoliert werden. Die Verbindung a''-Fe₁₆N₂ konntenoch nicht rein darzustellen werden.

Besonderes Interesse besteht in der Aufklärung desMechanismus der Entstehung der Eisennitride bei derUmsetzung von a-Eisen mitAmmoniak. Diese Reaktion wird großtechnisch zurNitridierhärtung von Eisenwerkstücken genutzt.

Als Messmethode wurde die⁵⁷Fe-Mößbauer-Spektroskopiegewählt, die auf Kernspinübergängen von⁵⁷Fe beruht. Um in situ-Nitridierungen von Eisenproben mit Ammoniak mitder ⁵⁷Fe-Mößbauer-Spektroskopieverfolgen zu können, wurde eineHochtemperatur-Messzelle entwickelt, die es erlaubt,Messungen bis 1100 K durchzuführen. Die Messzelle wurde durch Messungen an Eisennitriden mitbekannter Stöchiometrie, wie z.B. g'-Fe₄N und e-Fe₃N, durchgeführt.

Neben ⁵⁷Fe-Mößbauer-Messungen wurdenim Rahmen des DFG-Schwerpunkt-Programms Reaktivitätin Festkörpern weitere Messungen (u.a.Hochtemperatur-Leitfähigkeitsmessungen)durchgeführt.

Die experimentellen Methoden wurden durchBandstruktur-Rechnungen ergänzt. Mit Hilfe der TB-LMTO-ASA-Methode erfolgten Rechnungen anÜbergangsmetallnitriden M₃N (M = Mn, Fe, Co,Ni, Cu) der 3d-Reihe. Hierbei konnte der experimentell bestimmte strukturelleÜbergang von hexagonalem Ni₃N zu kubischemCu₃N bestätigt werden.

Polymerisationskatalysatoren auf Basis von Titan- und Vanadiumkomplexen mit Bisphenolato-Liganden

Die Synthese und Charakterisierung von Bisphenolato-Komplexen des Titans und Vanadiums werden beschrieben.Neben dem Methylkomplex wurde eine Reihe von Bisphenolato-Komplexen des Titan(IV) der Zusammensetzung (tbmp)(o-C6H4CH2NMe2)TiX (mit X = CH2SiMe3, CH2Ph, OTf) synthetisiert. Der Methylkomplex wurde mit B(C6F5)3 oder (tbmp)(tbmpH)Al zum Komplexkation [(tbmp)(o-C6H4CH2NMe2)Ti]+ umgesetzt und dessen Reaktivität gegenüber 1-Olefinen untersucht.Ausgehend von (tbmp)TiCl2 wurden der Dimethylkomplex (tbmp)TiMe2 und der Dibenzylkomplex (tbmp)Ti(CH2Ph)2 dargestellt und strukturell charakterisiert. Der Dibenzylkomplex liegt im Kristall als Dimer vor, verbrückt über ein Dioxan-Molekül, während der Dimethylkomplex auch im Feststoff monomer ist. Dies ist das erste Beispiel für die Koordinationszahl fünf bei Bisphenolato-Titan-Komplexen.Polymerisationsversuche mit (tbmp)TiMe2 und B(C6F5)3 weisen auf eine hohe Reaktivität und geringe Stabilität des aktivierten Komplexes hin, die zu geringen Polymer-Ausbeuten führt.Im Falle des Vanadiums konnten trotz Schwierigkeiten aufgrund der hohen Redoxaktivität dieses Elements mehrere Komplexe dargestellt werden. Synthetisiert und strukturell charakterisiert wurden der Komplex (mbmp)V(O)(CH2SiMe3)·B(C6F5)3, das erste Beispiel für ein Boranaddukt eines Oxokomplexes des fünfwertigen Vanadiums, und der erste Di(bisphenolato)-Komplex des vierwertigen Vanadiums, (tbmp)2V.Desweiteren gelang die Darstellung von (mbmp)V(O)(CH2SiMe2Ph)·B(C6F5)3, (tbmp)VCl(THF)2 und (mbmp)2V. Die Alkylkomplexe des fünfwertigen Vanadiums waren mit B(C6F5)3 für die Polymerisation von Ethen nicht aktivierbar. Hingegen bildete (tbmp)VCl(THF)2 mit DEAC ein sehr aktives System für die Polymerisation von Ethen.

Synthese, n.c.a. 18F-Markierung und Evaluierung von Antagonisten der Strychnin-unempfindlichen-Glycinbindungsstelle auf Basis der 4-Amino-5,7-Dichlor-1,2,3,4-Tetrahydro-Chinolin-2-Carbonsäure

ZUSAMMENFASSUNGDer glutamaterge N-Methyl-D-aspartat-Rezeptor (NMDA) ist ein wichtiger ionotroper Rezeptor, der die exzitatorische synaptische Transmission im zentralen Nervensystem von Säugetieren vermittelt. Der NMDA-Rezeptor nimmt unter den Glutamatrezeptoren dabei eine Sonderstellung ein, da er mit einer Reihe von neurodegenerativen Erkrankungen wie dem Morbus Parkinson, dem Morbus Huntington, dem Morbus Alzheimer, der Schizophrenie und der Epilepsie in Zusammenhang gebracht wird. Daher besteht ein großes Interesse an der Entwicklung geeigneter 18F-markierter NMDA-Rezeptorliganden zur nicht-invasiven Visualisierung des NMDA-Rezeptorkomplexes mittels der Positronenemissionstomographie.Die 19F-Analoga ADTC1, tADTC1 und tADTC3 - 5 und das nicht-fluorierte 12C-Analogon tADTC2 wurden synthetisiert und ihre in-vitro Affinität und Lipophilie bestimmt. Mit Ausnahme von ADTC1 und tADTC5 die mikromolare Affinitäten besitzen, haben die Liganden in [H-3]MDL-105,519 Rezeptorbindungsassays niedrige nanomolare Affinitäten für die Glycinbindungsstelle. Die Lipophilie der Verbindungen wurde mit drei verschiedenen Verfahren untersucht und ergab logD7,4-Werte von ungefähr 1 für cADTC1 und tADTC1 – 4, während tADTC5 mit einem logD7,4 von –1,15 eine sehr niedrige Lipophilie aufwies. Die Radiosynthesen der 18F-Liganden wurden hinsichtlich der Umsetzung der Markierungsvorläufer mit 2-[F-18]Fluorethyltosylat oder [F-18]Fluorid untersucht und optimiert. Die höchsten radiochemischen Ausbeuten von ungefähr 90% wurden, unter Verwendung von NaOH als Hilfsbase, bei der 18F-Fluorethylierung von t[F-18]ADTC4 und t[F-18]ADTC5 mit 2-[F-18]Fluorethyltosylat erzielt.