15 resultados para High throughput nucleotide sequencing
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Resumo:
372 osteochondrodysplasias and genetically determined dysostoses were reported in 2007 [Superti-Furga and Unger, 2007]. For 215 of these conditions, an association with one or more genes can be stated, while the molecular changes for the remaining syndromes remain illusive to date. Thus, the present dissertation aims at the identification of novel genes involved in processes regarding cartilage/ bone formation, growth, differentiation and homeostasis, which may serve as candidate genes for the above mentioned conditions. Two different approaches were undertaken. Firstly, a high throughput EST sequencing project from a human fetal cartilage library was performed to identify novel genes in early skeletal development (20th week of gestation until 2nd year of life) that could be investigated as potential candidate genes. 5000 EST sequences were generated and analyzed representing 1573 individual transcripts, corresponding to known (1400) and to novel, yet uncharacterized genes (173). About 7% of the proteins were already described in cartilage/ bone development or homeostasis, showing that the generated library is tissue specific. The remaining profile of this library was compared to previously published libraries from different time points (8th12th, 18th20th week and adult human cartilage) that also showed a similar distribution, reflecting the quality of the presented library analyzed. Furthermore, three potential candidate genes (LRRC59, CRELD2, ZNF577) were further investigated and their potential involvement in skeletogenesis was discussed. Secondly, a disease-orientated approach was undertaken to identify downstream targets of LMX1B, the gene causing Nail-Patella syndrome (NPS), and to investigate similar conditions. Like NPS, Genitopatellar syndrome (GPS) is characterized by aplasia or hypoplasia of the patella and renal anomalies. Therefore, six GPS patients were enrolled in a study to investigate the molecular changes responsible for this relatively rare disease. A 3.07 Mb deletion including LMX1B and NR5A1 (SF1) was found in one female patient that showed features of both NPS and GPS and investigations revealed a 46,XY karyotype and ovotestes indicating true hermaphroditism. The microdeletion was not seen in any of the five other patients with GPS features only, but a potential regulatory element between the two genes cannot be ruled out yet. Since Lmx1b is expressed in the dorsal limb bud and in podocytes, proteomic approaches and expression profiling were performed with murine material of the limbs and the kidneys to identify its downstream targets. After 2D-gel electrophoresis with protein extracts from E13.5 fore limb buds and newborn kidneys of Lmx1b wild type and knock-out mice and mass spectrometry analysis, only two proteins, agrin and carbonic anhydrase 2, remained of interest, but further analysis of the two genes did not show a transcriptional down regulation by Lmx1b. The focus was switched to expression profiles and RNA from newborn Lmx1b wild type and knock-out kidneys was compared by microarray analysis. Potential Lmx1b targets were almost impossible to study, because of the early death of Lmx1b deficient mice, when the glomeruli, containing podocytes, are still immature. Because Lmx1b is also expressed during limb development, RNA from wild type and knock-out Lmx1b E11.5 fore limb buds was investigated by microarray, revealing four potential Lmx1b downstream targets: neuropilin 2, single-stranded DNA binding protein 2, peroxisome proliferative activated receptor, gamma, co-activator 1 alpha, and short stature homeobox 2. Whole mount in situ hybridization strengthened a potential down regulation of neuropilin 2 by Lmx1b, but further investigations including in situ hybridization and protein-protein interaction studies will be needed.
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Die vorliegende Dissertation entstand im Rahmen eines multizentrischen EU-gefrderten Projektes, das die Anwendungsmglichkeiten von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) zur Individualisierung von Personen im Kontext der Zuordnung von biologischen Tatortspuren oder auch bei der Identifizierung unbekannter Toter behandelt. Die bergeordnete Zielsetzung des Projektes bestand darin, hochauflsende Genotypisierungsmethoden zu etablieren und zu validieren, die mit hoher Genauigkeit aber geringen Aufwand SNPs im Multiplexformat simultan analysieren knnen. Zunchst wurden 29 Y-chromosomale und 52 autosomale SNPs unter der Anforderung ausgewhlt, dass sie als Multiplex eine mglichst hohe Individualisierungschance aufweisen. Anschlieend folgten die Validierungen beider Multiplex-Systeme und der SNaPshot-Minisequenzierungsmethode in systematischen Studien unter Beteiligung aller Arbeitsgruppen des Projektes. Die validierte Referenzmethode auf der Basis einer Minisequenzierung diente einerseits fr die kontrollierte Zusammenarbeit unterschiedlicher Laboratorien und andererseits als Grundlage fr die Entwicklung eines Assays zur SNP-Genotypisierung mittels der elektronischen Microarray-Technologie in dieser Arbeit. Der eigenstndige Hauptteil dieser Dissertation beschreibt unter Verwendung der zuvor validierten autosomalen SNPs die Neuentwicklung und Validierung eines Hybridisierungsassays fr die elektronische Microarray-Plattform der Firma Nanogen Dazu wurden im Vorfeld drei verschiedene Assays etabliert, die sich im Funktionsprinzip auf dem Microarray unterscheiden. Davon wurde leistungsorientiert das Capture down-Assay zur Weiterentwicklung ausgewhlt. Nach zahlreichen Optimierungsmanahmen hinsichtlich PCR-Produktbehandlung, gertespezifischer Ablufe und analysespezifischer Oligonukleotiddesigns stand das Capture down-Assay zur simultanen Typisierung von drei Individuen mit je 32 SNPs auf einem Microarray bereit. Anschlieend wurde dieses Verfahren anhand von 40 DNA-Proben mit bekannten Genotypen fr die 32 SNPs validiert und durch parallele SNaPshot-Typisierung die Genauigkeit bestimmt. Das Ergebnis beweist nicht nur die Eignung des validierten Analyseassays und der elektronischen Microarray-Technologie fr bestimmte Fragestellungen, sondern zeigt auch deren Vorteile in Bezug auf Schnelligkeit, Flexibilitt und Effizienz. Die Automatisierung, welche die rumliche Anordnung der zu untersuchenden Fragmente unmittelbar vor der Analyse ermglicht, reduziert unntige Arbeitsschritte und damit die Fehlerhufigkeit und Kontaminationsgefahr bei verbesserter Zeiteffizienz. Mit einer maximal erreichten Genauigkeit von 94% kann die Zuverlssigkeit der in der forensischen Genetik aktuell eingesetzten STR-Systeme jedoch noch nicht erreicht werden. Die Rolle des neuen Verfahrens wird damit nicht in einer Ablsung der etablierten Methoden, sondern in einer Ergnzung zur Lsung spezieller Probleme wie z.B. der Untersuchung stark degradierter DNA-Spuren zu finden sein.
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Erkrankungen des Skelettapparats wie beispielsweise die Osteoporose oder Arthrose gehren neben den Herz-Kreislauferkrankungen und Tumoren zu den Hufigsten Erkrankungen des Menschen. Ein besseres Verstndnis der Bildung und des Erhalts von Knochen- oder Knorpelgewebe ist deshalb von besonderer Bedeutung. Viele bisherige Anstze zur Identifizierung hierfr relevanter Gene, deren Produkte und Interaktionen beruhen auf der Untersuchung pathologischer Situationen. Daher ist die Funktion vieler Gene nur im Zusammenhang mit Krankheiten beschrieben. Untersuchungen, die die Genaktivitt bei der Normalentwicklung von knochen- und knorpelbildenden Geweben zum Ziel haben, sind dagegen weit weniger oft durchgefhrt worden. rnEines der entwicklungsphysiologisch interessantesten Gewebe ist die Epiphysenfuge der Rhrenknochen. In dieser sogenannten Wachstumsfuge ist insbesondere beim ftalen Gewebe eine sehr hohe Aktivitt derjenigen Gene zu erwarten, die an der Knochen- und Knorpelbildung beteiligt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde daher aus der Epiphysenfuge von Klberknochen RNA isoliert und eine cDNA-Bibliothek konstruiert. Von dieser wurden ca. 4000 Klone im Rahmen eines klassischen EST-Projekts sequenziert. Durch die Analyse konnte ein ungefhr 900 Gene umfassendes Expressionsprofil erstellt werden und viele Transkripte fr Komponenten der regulatorischen und strukturbildenden Bestandteile der Knochen- und Knorpelentwicklung identifiziert werden. Neben den typischen Genen fr Komponenten der Knochenentwicklung sind auch deutlich Bestandteile fr embryonale Entwicklungsprozesse vertreten. Zu ersten gehren in erster Linie die Kollagene, allen voran Kollagen II alpha 1, das mit Abstand hchst exprimierte Gen in der ftalen Wachstumsfuge. Nach den ribosomalen Proteinen stellen die Kollagene mit ca. 10 % aller auswertbaren Sequenzen die zweitgrte Gengruppe im erstellten Expressionsprofil dar. Proteoglykane und andere niedrig exprimierte regulatorische Elemente, wie Transkriptionsfaktoren, konnten im EST-Projekt aufgrund der geringen Abdeckung nur in sehr geringer Kopienzahl gefunden werden. Allerdings frderte die EST-Analyse mehrere interessante, bisher nicht bekannte Transkripte zutage, die detaillierter untersucht wurden. Dazu gehren Transkripte die, die dem LOC618319 zugeordnet werden konnten. Neben den bisher beschriebenen drei Exonbereichen konnte ein weiteres Exon im 3-UTR identifiziert werden. Im abgeleiteten Protein, das mindestens 121 AS lang ist, wurden ein Signalpeptid und eine Transmembrandomne nachgewiesen. In Verbindung mit einer mglichen Glykosylierung ist das Genprodukt in die Gruppe der Proteoglykane einzuordnen. Leicht abweichend von den typischen Strukturen knochen- und knorpelspezifischer Proteoglykane ist eine mgliche Funktion dieses Genprodukts bei der Interaktion mit Integrinen und der Zell-Zellinteraktion, aber auch bei der Signaltransduktion denkbar. rnDie EST-Sequenzierungen von ca. 4000 cDNA-Klonen knnen aber in der Regel nur einen Bruchteil der mglichen Transkripte des untersuchten Gewebes abdecken. Mit den neuen Sequenziertechnologien des Next Generation Sequencing bestehen vllig neue Mglichkeiten, komplette Transkriptome mit sehr hoher Abdeckung zu sequenzieren und zu analysieren. Zur Untersttzung der EST-Daten und zur deutlichen Verbreiterung der Datenbasis wurde das Transkriptom der bovinen ftalen Wachstumsfuge sowohl mit Hilfe der Roche-454/FLX- als auch der Illumina-Solexa-Technologie sequenziert. Bei der Auswertung der ca. 40000 454- und 75 Millionen Illumina-Sequenzen wurden Verfahren zur allgemeinen Handhabung, der Qualittskontrolle, dem Clustern, der Annotation und quantitativen Auswertung von groen Mengen an Sequenzdaten etabliert. Beim Vergleich der Hochdurchsatz Blast-Analysen im klassischen Read-Count-Ansatz mit dem erstellten EST-Expressionsprofil konnten gute berstimmungen gezeigt werden. Abweichungen zwischen den einzelnen Methoden konnten nicht in allen Fllen methodisch erklrt werden. In einigen Fllen sind Korrelationen zwischen Transkriptlnge und Read-Verteilung zu erkennen. Obwohl schon simple Methoden wie die Normierung auf RPKM (reads per kilo base transkript per million mappable reads) eine Verbesserung der Interpretation ermglichen, konnten messtechnisch durch die Art der Sequenzierung bedingte systematische Fehler nicht immer ausgerumt werden. Besonders wichtig ist daher die geeignete Normalisierung der Daten beim Vergleich verschieden generierter Datenstze. rnDie hier diskutierten Ergebnisse aus den verschiedenen Analysen zeigen die neuen Sequenziertechnologien als gute Ergnzung und potentiellen Ersatz fr etablierte Methoden zur Genexpressionsanalyse.rn
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Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Bereich aus der geschlechtsbestimmenden Chromosomenregion, der Contig SDR, von C. tentans mit einer Gre von ~87 kb untersucht. Zur Erstellung des Contigs wurden 8 BAC-Klone aus C. tentans isoliert, teilweise subkloniert und sequenziert. Innerhalb des Contigs SDR konnten insgesamt 13 Gene sowie ein Teilbereich des Gens rpS5-like im distalen Bereich des Contigs SDR identifiziert werden. Hierbei handelt es sich um dieselben Gene, welche schon im Contig SDR von C. thummi identifiziert werden konnten. Ein Vergleich der beiden Contigs zeigt, dass die Abfolge der Gene zwischen den beiden Arten C. thummi und C. tentans identisch ist. Weiterhin konnten im Contig SDR von C. tentans sechs Bereiche lokalisiert werden, in denen repetitive oder transposable Elemente zu finden sind. Ein Vergleich der larvalen Transkripte (L4-Stadium) von 11 Genen des Contigs SDR aus C. thummi und C. thummi per RT-PCR und Hochdurchsatz-Sequenzierung zeigte mit Ausnahme der Gene luc7(p)-like sowie fs(1)K10-like bislang keine weiteren geschlechtsspezifischen Unterschiede. Im Gen luc7(p)-like konnte in C. thummi und C. piger ein alternativ gespleites Intron im eigentlichen Exon 2 identifiziert werden. Bei fs(1)K10-like konnte in C. thummi eine Duplikation des Gens nachgewiesen werden. Weiterhin wurden mit Hilfe des RACE-Verfahrens die 5UTR- und 3UTR-Bereiche der Transkripte analysiert. Hierdurch konnten differentielle Spleiprodukte identifiziert werden, welche jedoch nicht geschlechtsspezifisch auftreten. Die bioinformatische Bearbeitung der von den Genen der SDR kodierten Proteine auf konservierte Domnen zeigt vier Proteine, die mglicherweise als Transkriptions- oder Spleifaktoren wirken knnen. Hierbei handelt es sich um die Proteine der Gene mi-er1-like, luc7(p)-like, polyhomeotic-like sowie rpn5-like. Fr das auf Grund der mnnchenspezifischen Duplikation in C. thummi in den Fokus geratene Genprodukt von fs(1)K10-like konnten keine Domnen vorhergesagt werden. Somit kann nicht gesagt werden, ob das Protein im Rahmen der Geschlechtsdetermination eine Funktion haben knnte. Die Sequenzidentitt der abgeleiteten AS-Sequenz liegt fr alle Gene auer mi-er1-like (87,6 %) zwischen den beiden Arten C. tentans und C. thummi bei 93,3 %.
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Eine der Hauptursachen fr unerwnschte oder reduzierte Wirkungen von Medikamenten ist die Induktion von Enzymen und Transportern des Medikamentenstoffwechsels. Diese Induktion stellt ursprnglich eine physiologische Reaktion auf die Aufnahme von potentiell schdlichen Fremdstoffen aus der Umwelt dar und sichert so die Gesundheit und Fortpflanzungsfhigkeit von Lebewesen. Beim Menschen sowie anderen Sugetieren werden Fremdstoffe hauptschlich von den nukleren Rezeptoren PXR und CAR in der Leber und im Dnndarm detektiert. Zu den Medikamenten, welche ber PXR und CAR wirken, gehren unter anderem Antikonvulsiva, Statine, antiretrovirale Medikamente, Glucocorticoide sowie Antimykotika. Die durch Fremdstoffe aktivierten Transkriptionsfaktoren PXR und CAR steigern die Menge der Enzyme und Transporter des Fremdstoffmetabolismus. Hierzu zhlen vor allem die Cytochrom P450-Enzyme (Cyp-Enzyme) mit breitem Substratspektrum oder der Transporter MDR1, welcher eine Vielzahl von Substraten ber Membranen transportiert. Durch die Biotransformation werden die induzierenden, lipophilen Substanzen so modifiziert, dass sie leichter ber den Urin oder die Galle ausgeschieden werden knnen. \r\nDie Dauer der Induktion sollte auf die Zeit der Fremdstoffexposition beschrnkt sein, um Strungen des endogenen Stoffwechsels zu vermindern. In dieser Arbeit werden jedoch Hinweise auf dauerhafte und sogar generationsbergreifende Effekte von Medikamenten in Musen geliefert. Nachkommen von Mttern, welche bereits vor ihrer Verpaarung einmalig mit TCPOBOP, einem Liganden des murinen CAR, injiziert wurden, hatten eine ungefhr 100-fach gesteigerte Genexpression von Cyp2b10. Auch gab es Expressionsnderungen von Genen, deren Produkte eine Rolle im Lipidstoffwechsel sowie bei Immunkrankheiten spielen. Eine Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung der injizierten Elterngeneration ergab auerdem dauerhafte Expressionsvernderungen anderer Gene des Medikamentenstoffwechsels sowie von Genen mit Verbindung zum Energiemetabolismus. \r\nBercksichtigt man die enge evolutionre Verwandtschaft der nukleren Rezeptoren CAR und PXR, sind Langzeitvernderungen auch fr PXR mglich und wurden im Verlauf dieser Arbeit ebenfalls untersucht. Eine Hochdurchsatz-Sequenzierung ergab fr Muse, welche mit dem PXR-Aktivator PCN induziert wurden, dass selbst noch drei Monate nach der Exposition Gene verndert exprimiert waren, welche im Zusammenhang mit Lebernekrosen stehen. Bei Nachkommen von PCN-injizierten Mttern wurden Gene unterschiedlich exprimiert, welche eine Rolle bei der Energiehomostase sowie im Glukosestoffwechsel spielen. Im Erwachsenenalter sind bei diesen Nachkommen darber hinaus noch Gene unterschiedlich exprimiert, deren Produkte eine Funktion in der Immunantwort haben. \r\nDa Erwachsene aufgrund ihrer Lebensdauer sowie der absoluten Krankheitshufigkeit wesentlich fter Kontakt mit Fremdstoffen haben, war medizinisch von besonderem Interesse, ob anhaltende Genexpressionsnderungen auch bei Erwachsenen zu beobachten sind. So konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass auch einmalig exponierte Adulttiere Gene dauerhaft verndert exprimieren und die Vernderungen im Medikamentenstoffwechsel an die nchste Generation bertrugen. \r\n\r\nBisher sind klinische Studien zur Risikobewertung von Medikamenten (Pharmakovigilanz) nicht generationsbergreifend angelegt. Diese Arbeit gibt Anste dafr, dass dies in Zukunft fr viel mehr Medikamente notwendig werden knnte. Neben Vernderungen im Medikamentenstoffwechsel ergeben sich Nebenwirkungen von PXR- und CAR-Liganden vor allem aus ihrer Beteiligung an endogenen Stoffwechselwegen. Nach Aktivierung von CAR, welcher viele metabolische Stoffwechselwege steuert, treten beispielsweise Strungen des Energiestoffwechsels auf. Ein tieferes Verstndnis der Rezeptoraktivitt von CAR samt einer gezielten Modulierung seiner Aktivitt wrde wichtige Beitrge zum Verstndnis der Regulation des Fremdstoffmetabolismus sowie der Entstehung von Nebenwirkungen durch eine Behandlung mit CAR-Liganden leisten. Dauerhafte Vernderungen endogener Stoffwechselwege knnten dann mglicherweise ber eine pharmakologische Modulierung der CAR-Aktivitt reduziert werden. \r\nZu diesem Zweck wurden im Verlauf dieser Arbeit die CAR-Rezeptoren der Amphibien (Xenopus tropicalis, Xenopus laevis) und Reptilien (Anolis carolinensis) erstmals kloniert, als Proteine exprimiert und charakterisiert. Vergleiche zwischen Tierarten ermglichen ein besseres Verstndnis von humanen Proteinen. Funktionelle Analysen ergaben hnlichkeiten des Xenopus laevis-CAR mit dem PXR der Sugetiere: eine niedrige basale Aktivitt sowie eine starke Induzierbarkeit durch Liganden. In weiteren funktionellen Analysen wurden die Determinanten der basalen Aktivitt des Xenopus laevis-CAR untersucht. Die basale Aktivitt war nicht abhngig von der subzellulren Lokalisation, sondern ergab sich aus der Proteinstruktur, welche nur beim CAR der Landvertebraten in einer aktiven Konformation fixiert ist. hnlich dem PXR der Sugetiere besitzt CAR der Amphibien eine Aktivierungsdomne, welche erst durch Ligandenbindung in eine aktive Konformation gebracht wird. Mutationen einzelner Aminosuren zum jeweils humanen Homolog erhhten die basale Aktivitt des Xenopus laevis-CAR auf die des humanen Rezeptors. Diese Mutanten mit erhhter basalen Aktivitt zeigten eine verstrkte Interaktion mit dem Kofaktor PGC-1a, einem Regulator des Energiestoffwechsels bei Sugetieren. Die hepatischen Zielgene des CAR der Amphibien berlappen zum Teil mit den humanen Zielgenen und spielen ebenfalls eine Rolle im Energiestoffwechsel.
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Herzwirksame Glykoside sind in der Natur sowohl im Tier- als auch im Pflanzenreich zu finden und werden regelmig zur Therpaie von Herzinsuffizienz eingesetzt. In letzter Zeit belegten viele Studien, dass herzwirksame Glykoside vielversprechende Substanzen fr die Behandlung von Krebs darstellen. Ihr Wirkmechanismus basiert auf der Hemmung der Na+/K+-ATPase. Die Na+/K+-ATPase spielt neuerdings eine wichtige Rolle in der Krebsbiologie, da sie viele relevante Signalwege beeinflusst. Multiresistenzen gegen Arzneimittel sind oftmals verantwortlich fr das Scheitern einer Chemotherapie. Bei multi-drug-resistenten Tumoren erfolgt ein Transport der Chemotherapeutika aus der Krebszelle hinaus durch das Membranprotein P-Glykoprotein. In der vorliegenden Arbeit wurde die Zytotoxizitt von 66 herzwirksamen Glykosiden und ihren Derivaten in sensitiven und resistenten Leukmie-Zellen getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Naturstoffe die Zell-Linien in verschiedenen molaren Bereichen abtten. Allerdings waren die Resistenz-Indizes niedrig (d. h. die IC50 Werte waren in beiden Zell-Linien hnlich). Die untersuchten 66 Substanzen besitzen eine groe Vielfalt an chemischen Substituenten. Die Wirkung dieser Substituenten auf die Zytotoxizitt wurde daher durch Struktur-Aktivitts-Beziehung (SAR) erforscht. Des Weiteren wiesen quantitative Struktur-Aktivitts-Beziehung (QSAR) und molekulares Docking darauf hin, dass die Na+/K+-ATPase in sensitiven und resistenten Zellen unterschiedlich stark exprimiert wird. Eine Herunterregulation der Na+/K+-ATPase in multi-drug-resistenten Zellen wurde durch Western Blot besttigt und die Wirkung dieser auf relevante Signalwege durch Next-Generation-Sequenzierung weiter verfolgt. Dadurch konnte eine Verbindung zwischen der berexpression von P-Glykoprotein und der Herunterregulation der Na+/K+-ATPase hergestellt werden. Der zweite Aspekt der Arbeit war die Hemmung von P-Glykoprotein durch herzwirksame Glykoside, welche durch Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie getestet wurde. Sechs wirksame Glykoside konnten den P-Glykoprotein-vermittelten Transport von Doxorubicin inhibieren. Zudem konnte die Zytotoxitt von Doxorubicin in multi-drug-resistenten Zellen teilweise wieder zurck erlangt werden. Unabhngig von herzwirksamen Glykosiden war die Bewertung der Anwendung von molekularem Docking in der P-Glykoprotein Forschung ein weiterer Aspekt der Arbeit. Es lie sich schlussfolgern, dass molekulares Docking fhig ist, zwischen den verschiedenen Moleklen zu unterscheiden, die mit P-Glykoprotein interagieren. Die Anwendbarkeit von molekularem Docking in Bezug auf die Bestimmung der Bindestelle einer Substanz wurde ebenfalls untersucht.
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Mesenchymale Stamzellen (MSC) sind Vertreter der adulten Stammzellen. Sie bergen durch ihre groe Plastizitt ein immenses Potential fr die klinische Nutzung in Form von Stammzelltherapien. Zellen dieses Typs kommen vornehmlich im Knochenmark der groen Rhrenknochen vor und knnen zu Knochen, Knorpel und Fettzellen differenzieren. MSC leisten einen wichtigen Beitrag im Rahmen regenerativer Prozesse, beispielsweise zur Heilung von Frakturen. Breite Studien demonstrieren bereits jetzt auch bei komplexeren Erkrankungen (z.B. Osteoporose) therapeutisch vielversprechende Einsatzmglichkeiten. Oft kommen hierbei aus MSC gezielt differenzierte Folgelinien aus Zellkulturen zum Einsatz. Dies bedingt eine kontrollierte Steuerung der Differenzierungsprozesse in vitro. Der Differenzierung einer Stammzelle liegt eine komplexe Vernderung ihrer Genexpression zugrunde. Genexpressionsmuster zur Erhaltung und Proliferation der Stammzellen mssen durch solche, die der linienspezifischen Differenzierung dienen, ersetzt werden. Die mit der Differenzierung einhergehende, transkriptomische Neuausrichtung ist fr das Verstndnis der Prozesse grundlegend und wurde bislang nur unzureichend untersucht. Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine transkriptomweite und vergleichende Genexpressionsanalyse Mesenchymaler Stammzellen und deren in vitro differenzierten Folgelinien mittels Plasmid - DNA Microarrays und Sequenziertechniken der nchsten Generation (RNA-Seq, Illumina Plattform). In dieser Arbeit diente das Hausrind (Bos taurus) als Modellorganismus, da es genetisch betrachtet eine hohe hnlichkeit zum Menschen aufweist und Knochenmark als Quelle von MSC gut verfgbar ist. Primrkulturen Mesenchymaler Stammzellen konnten aus dem Knochenmark von Rindern erfolgreich isoliert werden. Es wurden in vitro Zellkultur - Versuche durchgefhrt, um die Zellen zu Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozyten zu differenzieren. Zur Genexpressionsanalyse wurde RNA aus jungen MSC und einer MSC Langzeitkultur (alte MSC), sowie aus den differenzierten Zelllinien isoliert und fr nachfolgende Experimente wo ntig amplifiziert. Der Erfolg der Differenzierungen konnte anhand der Genexpression von spezifischen Markergenen und mittels histologischer Frbungen belegt werden. Hierbei zeigte sich die Differenzierung zu Osteoblasten und Adipozyten erfolgreich, whrend die Differenzierung zu Chondrozyten trotz diverser Modifikationen am Protokoll nicht erfolgreich durchgefhrt werden konnte. Eine vergleichende Hybridisierung zur Bestimmung differentieller Genexpression (MSC vs. Differenzierung) mittels selbst hergestellter Plasmid - DNA Microarrays ergab fr die Osteogenese mit Genen wie destrin und enpp1, fr die undifferenzierten MSC mit dem Gen sema3c neue Kandidatengene, deren biologische Funktion aufzuklren in zuknftigen Experimenten vielversprechende Ergebnisse liefern sollte. Die Analyse der transkriptomweiten Genexpression mittels NGS lieferte einen noch umfangreicheren Einblick ins Differenzierungsgeschehen. Es zeigte sich eine hohe hnlichkeit im Expressionsprofil von jungen MSC und Adipozyten, sowie zwischen den Profilen der alten MSC (eine Langzeitkultur) und Osteoblasten. Die alten MSC wiesen deutliche Anzeichen fr eine spontane Differenzierung in die osteogene Richtung auf. Durch Analyse der 100 am strksten exprimierten Gene jeder Zelllinie lieen sich fr junge MSC und Adipozyten besonders Gene der extrazellulren Matrix (z.B col1a1,6 ; fn1 uvm.) auffinden. Sowohl Osteoblasten, als auch die alten MSC exprimieren hingegen verstrkt Gene mit Bezug zur oxidativen Phosphorylierung, sowie ribosomale Proteine. Eine Betrachtung der differentiellen Genexpression (junge MSC vs. Differenzierung) mit anschlieender Pathway Analyse und Genontologie Anreicherungsstatistik untersttzt diese Ergebnisse vor allem bei Osteoblasten, wo nun jedoch zustzlich auch Gene zur Regulation der Knochenentwicklung und Mineralisierung in den Vordergrund treten. Fr Adipozyten konnte mit Genen des Jak-STAT signaling pathway, der Fokalen Adhsion, sowie Genen des Cytokine-cytokine receptor interaction pathway sehr spannende Einsichten in die Biologie dieses Zelltyps erlangt werden, die sicher weiterer Untersuchungen bedrfen. In undifferenzierten MSC konnte durch differentielle Genexpressionsanalyse die Rolle des nicht kanonischen Teils des WNT Signalweges als fr die Aufrechterhaltung des Stammzellstatus potentiell uerst einflussreich ermittelt werden. Die hier diskutierten Ergebnisse zeigen beispielhaft, dass besonders mittels Genexpressionsanalyse im Hochdurchsatzverfahren wertvolle Einblicke in die komplexe Biologie der Stammzelldifferenzierung mglich sind. Als Grundlage fr nachfolgende Arbeiten konnten interessante Gene ermittelt und Hypothesen zu deren Einfluss auf Stammzelleigenschaften und Differenzierungsprozesse aufgestellt werden. Um einen besseren Einblick in den Differenzierungsverlauf zu ermglichen, knnten knftig NGS Analysen zu unterschiedlichen Differenzierungszeitpunkten durchgefhrt werden. Zudem wren weitere Anstrengungen zur erfolgreichen Etablierung der chondrogenen Differenzierung zur vollstndigen Analyse der Genexpression des trilinearen Differenzierungspotentials von MSC wnschenswert.
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Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit konnten vier neue Ligandsysteme frPolymerisationskatalysatoren entwickelt werden, dieisoelektronisch zu Cp-Liganden (L2X-Ligand) oder Ligandenvon ansa-Metallocenen (L4X2-Ligand) sind. Dazu zhlensubstituierte Azacyclopentadiene, 2-(Amionomethyl)thiophene,donorfunktionalisierte Amidine und1,4-Dithiabutan-verbrckte Bis(phenole).Alle Liganden wurden erfolgreich komplexiert. Bis auf diePyrrolkomplexe zeigten alle Komplexe zum Teil sehr hohePolymerisationsaktivitten. Die Bis(phenolato)-Katalysatorenpolymerisieren Styrol isotaktisch und bieten Anwendungen frverschiedene Copolymerisationsexperimente.Die neu entwickelten Katalysatoren haben sich trotz ihrerCp-isoelektronischen Ligandsysteme hchst unterschiedlichbezglich ihrer Eignung als Polymerisations-Katalysatorengezeigt. Vor diesem Hintergrund wird deutlich, dass nebenden elektronischen Gegebenheiten ebenso sterische wiegeometrische Einflsse von Bedeutung sind. Fr die Zukunftwird das Aufklren der Struktur-Wirkungs-Beziehung einewichtige Herausforderung bleiben. Ferner konnten meisten Syntheseschritte so ausgearbeitetwerden, dass High Throughput Experimente im Automatenmglich sind.
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Kristallisation der Arbutin-Synthase und der Strictosidin Glukosidase - zwei Enzyme aus dem sekundren Glykosidstoffwechsel von Rauvolfia serpentina Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Kristallisation und der strukturellen Auswertung der Arbutin-Synthase (AS) und der Strictosidin Glukosidase (SG). Beide Enzyme stammen aus der Medizinalpflanze Rauvolfia serpentina. Fr die Kristallisation der Arbutin-Synthase wurden ca. 2500 verschiedene Beding-ungen experimentell untersucht. Fr einige dieser Experimente wurde das Enzym molekularbiologisch und chemisch verndert. Trotzdem konnten keine Kristalle erhalten werden. Die bei diesen Vernderungen erhaltenen Ergebnisse wurden anhand von Vergleichen mit Strukturen anderer Glykosyltransferasen der gleichen Familie analysiert. Bei der Reinigung der AS konnte mit verschiedenen Trennsystemen nie eine homogene Lsung produziert werden. Der wahrscheinliche Grund fr diese schlechte Isolierbarkeit, und damit der wahrscheinliche Grund fr die schwierige Kris-tallisation, liegt in der berdurchschnittlich hohen Anzahl an Cysteinen in der Proteinsequenz. Mit den Aminosuren Cys171, Cys253 und Cys461 wurden drei Cysteine gefunden, die einem Strukturvergleich nach an der Proteinoberflche liegen und mglicherweise durch Quervernetzungen mit anderen Proteinmoleklen ein heterogenes Gemisch bilden, das nicht geordnet kristallisieren kann. Durch gezielte Mutationen dieser drei Aminosuren knnte die Kristallisation zuknftig ermglicht werden. Fr die SG waren bereits Bedingungen bekannt bei denen nicht vermessbare Enzymkristalle (Nadeln) wuchsen. In weit gefcherten Versuchen konnten diese Kristalle jedoch nicht zu 3D-Wachstum angeregt werden. Es wurden mit einem HTS-Screening neue Bedingungen zur Kristallisation gefunden. Anschlieend konnten die native Struktur und der Strictosidin/Enzym-Komplex vermessen und aufgeklrt werden. Die SG gehrt zur Familie 1 der Glukosidasen (GH-1) und besitzt die in dieser Familie konservierte (beta/alpha)8-Barrel-Faltung. Im Vergleich mit 16 bekannten Glykosidasen der Familie GH-1 wurde die Substratbindung untersucht. Dabei wurde die in der Familie konservierte Zuckerbindung vorgefunden, jedoch groe Unterschiede in der Aglykonbindung entdeckt. Es wurden Bedingungen fr die Konformationsnderung des Trp388 erkannt. Diese Konformationsnderung dirigiert den Aglykonteil des Substrates auf verschiedene Seiten der Substratbindungstasche und teilt so die Familie GH-1 in zwei Gruppen.
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Antibody microarrays are of great research interest because of their potential application as biosensors for high-throughput protein and pathogen screening technologies. In this active area, there is still a need for novel structures and assemblies providing insight in binding interactions such as spherical and annulus-shaped protein structures, e.g. for the utilization of curved surfaces for the enhanced protein-protein interactions and detection of antigens. Therefore, the goal of the presented work was to establish a new technique for the label-free detection of bio-molecules and bacteria on topographically structured surfaces, suitable for antibody binding.rnIn the first part of the presented thesis, the fabrication of monolayers of inverse opals with 10 m diameter and the immobilization of antibodies on their interior surface is described. For this purpose, several established methods for the linking of antibodies to glass, including Schiff bases, EDC/S-NHS chemistry and the biotin-streptavidin affinity system, were tested. The employed methods included immunofluorescence and image analysis by phase contrast microscopy. It could be shown that these methods were not successful in terms of antibody immobilization and adjacent bacteria binding. Hence, a method based on the application of an active-ester-silane was introduced. It showed promising results but also the need for further analysis. Especially the search for alternative antibodies addressing other antigens on the exterior of bacteria will be sought-after in the future.rnAs a consequence of the ability to control antibody-functionalized surfaces, a new technique employing colloidal templating to yield large scale (~cm2) 2D arrays of antibodies against E. coli K12, eGFP and human integrin v3 on a versatile useful glass surface is presented. The antibodies were swept to reside around the templating microspheres during solution drying, and physisorbed on the glass. After removing the microspheres, the formation of annuli-shaped antibody structures was observed. The preserved antibody structure and functionality is shown by binding the specific antigens and secondary antibodies. The improved detection of specific bacteria from a crude solution compared to conventional flat antibody surfaces and the setting up of an integrin-binding platform for targeted recognition and surface interactions of eukaryotic cells is demonstrated. The structures were investigated by atomic force, confocal and fluorescence microscopy. Operational parameters like drying time, temperature, humidity and surfactants were optimized to obtain a stable antibody structure.
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Die intrazellulre Lokalisation von Proteinen und Makromoleklen unterliegt in Eukaryoten einer strengen Regulation. Insbesondere erlaubt die Kompartimentierung eukaryotischer Zellen in Zellkern und Zytoplasma den simultanen Ablauf rumlich getrennter biochemischer Reaktionen, und damit die unabhngige Regulation zellulrer Programme. Da trotz intensiver Forschungsbemhungen bis dato die molekularen Details sowie die (patho)biologische Bedeutung von Kern-Zytoplasma-Transportprozessen noch immer nicht vollkommen verstanden sind, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Fokus auf die Identifizierung von chemischen Transportinhibitoren gelegt. Das zu diesem Zweck entwickelte Translokations-Biosensor-System basiert auf der Kombination von autofluoreszierenden Proteinen, sowie spezifisch ausgewhlten Kernexport- und Kernimportsignalen. Nach Etablierung geeigneter Zellmodelle, die effizient und stabil die Translokations-Biosensoren exprimieren, wurde die 17 000 Substanzen umfassende Bibliothek der ChemBioNet-Initiative nach Kernexportinhibitoren mittels einer Fluoreszenzmikroskopie-basierten Hochdurchsatzanalyse-Plattform durchmustert. Zunchst wurden Translokations-Algorithmen, welche eine zuverlssige automatisierte Erkennung von Zellkern und Zytoplasma erlauben, optimiert. Im Folgenden konnten acht neue niedermolekulare Kernexport-Inhibitoren identifiziert werden, die sich in der Strke, der Geschwindigkeit, sowie in der Bestndigkeit der vermittelten Inhibition unterscheiden. Die Aktivitt der Inhibitoren konnte auf den isolierten nukleren Exportsignalen (NES) von HIV-1 Rev und Survivin als auch auf den entsprechenden Volllngeproteinen mittels Mikroinjektionsexperimenten sowie durch umfassende in vitro und biochemische Methoden besttigt werden. Zur Untersuchung der funktionellen Einheiten der Inhibitoren wurden homologe Substanzen auf Ihre Aktivitt hin getestet. Dabei konnten fr die Aktivitt wichtige chemische Gruppen definiert werden. Alle Substanzen stellen neue Inhibitoren des Crm1-abhngigen Exports dar und zeigen keine nachweisbare NES-Selektivitt. Interessanterweise konnte jedoch eine zytotoxische und Apoptose-induzierende Wirkung auf verschiedene Krebszellarten festgestellt werden. Da diese Wirkung unabhngig vom p53-Status der Tumorzellen ist und die Inhibitoren C3 und C5 die Vitalitt nicht-maligner humaner Zellen signifikant weniger beeintrchtigen, wurden diese Substanzen zum internationalen Patent angemeldet. Da der nuklere Export besonders fr Tumorzellen einen wichtigen berlebenssignalweg darstellt, knnte dessen reversible Hemmung ausgenutzt werden, um besonders in Kombination mit gngigen Krebstherapien eine therapeutisch relevante Tumorinhibition zu erzeugen. Eine weitere Anwendungsmglichkeit der neuen Exportinhibitoren ist auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten zu sehen, da auch die Aktivitt des essentiellen HIV-1 Rev-Proteins inhibiert wird. Zustzlich konnte in der Arbeit gezeigt werden, dass der zellulre Kofaktor des Crm1-abhngigen Exports des HIV-1 Rev-Proteins, die RNA-Helikase DDX3, ein eigenes NES enthlt. Der Nachweis einer direkten Interaktion des HIV-1 Rev- mit dem DDX3-Protein impliziert, dass multiple Angriffstellen fr chemische Modulatoren hinsichtlich einer antiviralen Therapie gegeben sind. Da die Vielfalt des chemischen Strukturraums es unmglich macht diesen experimentell vollstndig zu durchmustern, wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Naturstoffe als vielversprechende Wirkstoffquelle untersucht. Um zuknftig umfassend bioaktive Substanzen aus diesen hochkomplexen Stoffgemischen experimentell identifizieren zu knnen, wurde eine Fluoreszenzmikroskopie-basierte Hochdurchsatzanalyse-Plattform am Mainz Screening Center (MSC) etabliert. Damit konnte bereits ein weiterer, bisher unbekannter Exportinhibitor aus Cyphellopsis anomala identifiziert werden. Neben einer Anwendung dieser Substanz als chemisches Werkzeug zur Aufklrung der Regulation von Transportvorgngen, stellt sich auch die evolutionsbiologisch relevante Frage, wie es dem Pilzproduzenten gelingt die Blockierung des eigenen Kernexports zu umgehen. Weiterfhrende Projekte mssen sich neben der Aufklrung der molekularen Wirkmechanismen der gefundenen Substanzen mit der Identifizierung spezifischer chemischer Funktionseinheiten beschftigen. Neben einem verbesserten mechanistischen Verstndnis von Transportvorgngen stellen die erarbeiteten Transportinhibitoren Vorstufen zur Weiterentwicklung mglicher Wirkstoffe dar. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierte Technologie-Plattform und molekularen Werkzeuge stellen darber hinaus eine wichtige Voraussetzung dar, um eine systematische Suche nach mglichen Wirkstoffen im Forschungsfeld der Chemischen Biomedizin voranzutreiben.
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Der Stamm der Apicomplexa ist eine artenreiche Gruppe, der einzellige, meist obligat intrazellulre Parasiten angehren, darunter auch erstzunehmende Krankheitserreger wie Plasmodium sp. sowie tierpathogene Vertreter wie Eimeria sp. und Theileria sp. Eimeria sp. verursacht die Kokzidiose beim Huhn. Diese Krankheit bedingt weltweite Verluste in der Geflgelindustrie von etwa 3 Milliarden US$ pro Jahr [DALLOUL & LILLEHOJ, 2006; SHIRLEY et al., 2007; LUCIUS & LOOS-FRANK, 2008]. Die Parasiten weisen eine hohe Resistenzbildungsrate gegen vorhandene Wirkstoffe auf. Zudem ist der Einsatz von Vakzinen mit Nebenwirkungen verbunden und fr hohe Produktionskosten verantwortlich. Daher ist die Entwicklung von neuen, kostengnstigen und effektiven Kokzidiostatika eine dringend notwendige Herausforderung [KINNAIRD et al., 2004]. rnAuf Grund ihrer essentiellen, regulatorischen Funktion im eukaryotischen Zellzyklus sind Zyklin-abhngige Kinasen (CDKs) validierte Zielproteine [LEHNINGER et al., 2005]. Auch Eimeria tenella CDC2-related kinase 2 (EtCRK2) wurde bereits mittels des bekannten CDK-Inhibitors Flavopiridol als Zielprotein chemisch validiert [ENGELS et al., 2010]. Wie bei allen CDKs ist die Aktivitt von EtCRK2 abhngig von der Bindung eines Aktivators, der zur Zyklin-Proteinfamilie gehrt. Dieser natrliche EtCRK2-Aktivator war jedoch bislang nicht bekannt. Deshalb war ein Teil dieser Arbeit die Identifizierung des natrlichen EtCRK2-Aktivators. Bioinformatische Analysen identifizierten vier E. tenella Zyklin-hnliche Proteine (EtCYC1, EtCYC3a, EtCYC3b und EtCYC4), die nah verwandt zu den Plasmodium falciparum-Zyklinen sind [ENGELS et al., 2010; SUREZ FERNNDEZ et al., bislang unverffentlichte Daten]. Im Rahmen dieser Arbeit konnten zwei neue Aktivatoren identifiziert und biochemisch charakterisiert werden: der bekannte CDK-Aktivator XlRINGO und das neue E. tenella-Zyklin EtCYC3a. Nachdem der nicht-radioaktive TR-FRET-Assay fr die EtCRK2 etabliert und optimiert wurde, konnte die EtCRK2-Aktivitt im Komplex mit beiden Aktivatoren und weitere wichtige kinetische Parameter bestimmt werden.rnZustzlich wurde dieser Assay zum in vitro Screening einer kommerziellen Chemikalienbibliothek auf die EtCRK2 eingesetzt, um potentielle Inhibitoren fr EtCRK2 zu identifizieren. Dieses in vitro Screening gefolgt von einer in silico Hit-Anreicherung identifizierte 19 aktive Verbindungen fr die durch EtCYC3a und XlRINGO aktivierte EtCRK2. Zudem wurden drei Struktur-Cluster definiert: Naphthoquinone, 8-Hydroxyquinoline und 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ole. rnDie aktivsten Vertreter von jedem Cluster wurden als Leitstrukturen ausgewhlt und auf EtCRK2 und HsCDK2 getestet. Aufgrund ihrer inhibierenden Wirkung auf EtCRK2 stellen diese Verbindungen viel versprechende Leitstrukturen fr die Entwicklung eines neuen Antikokzidiums dar. Hiermit konnte auch gezeigt werden, dass BES124764, der Vertreter des 2-Pyrimidinyl-aminopiperidin-propan-2-ol-Clusters, in der Lage ist, die EtCRK2 selektiv zu inhibieren. rnDaher wird BES124764 sowie einige Derivate in den Leitstruktur-Optimierungsprozess fr die Auffindung eines neuen Arzneimittelkandidaten gegen Kokzidiose eingehen.rn
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Ein charakteristisches, neuropathologisches Merkmal der Alzheimer-Demenz (AD), der am hufigsten vorkommenden Demenz-Form des Menschen, ist das Auftreten von senilen Plaques im Gehirn der Patienten. Hierbei stellt das neurotoxische A-beta Peptid den Hauptbestandteil dieser Ablagerungen dar. Einen Beitrag zu der pathologisch erhhten A-beta Generierung liefert das verschobene Expressionsgleichgewicht der um APP-konkurrierenden Proteasen BACE-1 und ADAM10 zu Gunsten der beta-Sekretase BACE-1. In der vorliegenden Dissertation sollten molekulare Mechanismen identifiziert werden, die zu einem pathologisch vernderten Gleichgewicht der APP-Spaltung und somit zum Entstehen und Fortschritt der AD beitragen. Des Weiteren sollten Substanzen identifiziert werden, die durch Beeinflussung der Genexpression einer der beiden Proteasen das physiologische Gleichgewicht der APP-Prozessierung wiederherstellen knnen und somit therapeutisch einsetzbar sind.rnAnhand eines Screenings von 704 Transkriptionsfaktoren wurden 23 Faktoren erhalten die das Verhltnis ADAM10- pro BACE-1-Promotor Aktivitt beeinflussten. Exemplarisch wurden zwei der molekularen Faktoren auf ihren Wirkmechanismus untersucht: Der TF X box binding protein-1 (XBP-1), der die so genannte unfolded protein response (UPR) reguliert, erhhte die Expression von ADAM10 in Zellkultur-Experimenten. Die Menge dieses Faktors war in AD-Patienten im Vergleich zu gesunden, Alters-korrelierten Kontrollen signifikant erniedrigt. Im Gegensatz dazu verminderte der Seneszenz-assoziierte TF T box 2 (Tbx2) die Menge an ADAM10 in SH-SY5Y Zellen. Die Expression des Faktors selbst war in post-mortem Kortexgewebe von AD-Patienten erhht. Zustzlich zu den TFs konnten in einer Kooperation mit dem Helmholtz Zentrum Mnchen drei microRNAs (miRNA 103, 107, 1306) bioinformatisch prdiziert und experimentell validiert werden, die die Expression des humanen ADAM10 reduzierten.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnten damit krpereigene Faktoren identifiziert werden, die die Menge an ADAM10 regulieren und folglich potenziell an der Entstehung der gestrten Homostase der APP-Prozessierung beteiligt sind. Somit ist die AD auch im Hinblick auf eine A-beta-vermittelte Pathologie als multifaktorielle Krankheit zu verstehen, in der verschiedene Regulatoren zur gestrten APP-Prozessierung und somit zur pathologisch gesteigerten A-beta Generierung beitragen knnen. rnEine pharmakologische Erhhung der ADAM10 Genexpression wrde zu der Freisetzung von neuroprotektivem APPs-alpha und gleichzeitig zu einer reduzierten A-beta Generierung fhren. Deshalb war ein weiteres Ziel dieser Arbeit die Evaluierung von Substanzen mit therapeutischem Potenzial im Hinblick auf eine erhhte ADAM10 Expression. Von 640 FDA-zugelassenen Medikamenten einer Substanz-Bibliothek wurden 23 Substanzen identifiziert, die die Menge an ADAM10 signifikant steigerten whrend die Expression von BACE-1 und APP unbeeinflusst blieb. In Zusammenarbeit mit dem Institut fr Pathologie (Johannes Gutenberg Universitt Mainz) wurde ein Zellkultur-basiertes Modell etabliert, um die Permeationsfhigkeit der potenziellen Kandidaten-Substanzen ber die Blut-Hirn Schranke (BHS) zu untersuchen. Von den 23 Medikamenten konnten neun im Rahmen des etablierten Modells als BHS-gngig charakterisiert werden. Somit erfllen diese verbleibenden Medikamente die grundlegenden Anforderungen an ein AD-Therapeutikum. rnADAM10 spaltet neben APP eine Vielzahl anderer Substrate mit unterschiedlichen Funktionen in der Zelle. Zum Beispiel reguliert das Zelladhsionsmolekl Neuroligin-1 (NL-1), das von ADAM10 prozessiert wird, die synaptische Funktion exzitatorischer Neurone. Aus diesem Grund ist die Abschtzung potenzieller, Therapie-bedingter Nebenwirkungen sehr wichtig. Im Rahmen eines Forschungsaufenthalts an der Universitt von Tokio konnte in primren, kortikalen Neuronen der Ratte bei einer Retinoid-induzierten Erhhung von ADAM10 neben einer vermehrten alpha-sekretorischen APP-Prozessierung auch eine gesteigerte Spaltung von NL-1 beobachtet werden. Dies lsst vermuten, dass bei einer Behandlung mit dem Retinoid Acitretin neben einer vermehrten APP-Spaltung durch ADAM10 auch die Regulation glutamaterger Neurone durch die Spaltung von NL-1 betroffen ist. Anhand eines geeigneten Alzheimer-Tiermodells sollten diese Befunde weiter analysiert werden, um so auf einen sicheren therapeutischen Ansatz bezglich einer vermehrten ADAM10 Genexpression schlieen zu knnen.rn
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The marine world is an immense source of biodiversity that provides substances with striking potentials in medicinal chemistry and biotechnology. Sponges (Porifera) are marine animals that represent the most impressive example of organisms possessing the ability to metabolise silica through a family of enzymes known as silicateins. Complex skeletal structures (spicules) made of pure biogenic silica (biosilica) are produced under physiological conditions. Biosilica is a natural material comprising inorganic and organic components with unique mechanical, optical, and physico-chemical properties, including promising potential to be used for development of therapeutic agents in regenerative medicine. Unravelling the intimate physiological mechanisms occurring in sponges during the construction of their siliceous spicules is an on-going project, and several questions have been addressed by the studies proposed by our working group. In this doctoral work, the recombinant DNA technology is exploited for functional and structural characterisation of silicatein. Its precursors are produced as fusion proteins with a chaperone tag (named TF-Ps), and a robust method for the overexpression of native soluble proteins in high concentrations has been developed. In addition, it is observed and proven experimentally that the maturation of silicatein is an autocatalytic event that: (i) can be modulated by rational use of protease inhibitors; (ii) is influenced by the temperature of the environment; (iii) only slightly depends on the pH. In the same experimental framework, observations on the dynamics in the maturation of silicateins allow a better understanding of how the axial filaments form during the early stages of spicule construction. In addition, the definition of new distinct properties of silicatein (termed structure-guiding and structure-forming) is introduced. By homology models and through comparisons with similar proteins (the cathepsins), domains with significant surface hydrophobicity are identified as potential self-assembly mediators. Moreover, a high-throughput screening showed that TF-Ps could generate crystals under certain conditions, becoming promising for further structural studies. With the goal of optimise the properties of the recombinant silicatein, implementation of new production systems are tried for the first time. Success in the expression of silicatein-type proteins in insect and yeast cells, constitute a promising basis for further development, towards the establishment of an efficient method for the production of a high-value pure and soluble protein.
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Moderne ESI-LC-MS/MS-Techniken erlauben in Verbindung mit Bottom-up-Anstzen eine qualitative und quantitative Charakterisierung mehrerer tausend Proteine in einem einzigen Experiment. Fr die labelfreie Proteinquantifizierung eignen sich besonders datenunabhngige Akquisitionsmethoden wie MSE und die IMS-Varianten HDMSE und UDMSE. Durch ihre hohe Komplexitt stellen die so erfassten Daten besondere Anforderungen an die Analysesoftware. Eine quantitative Analyse der MSE/HDMSE/UDMSE-Daten blieb bislang wenigen kommerziellen Lsungen vorbehalten. rn| In der vorliegenden Arbeit wurden eine Strategie und eine Reihe neuer Methoden zur messungsbergreifenden, quantitativen Analyse labelfreier MSE/HDMSE/UDMSE-Daten entwickelt und als Software ISOQuant implementiert. Fr die ersten Schritte der Datenanalyse (Featuredetektion, Peptid- und Proteinidentifikation) wird die kommerzielle Software PLGS verwendet. Anschlieend werden die unabhngigen PLGS-Ergebnisse aller Messungen eines Experiments in einer relationalen Datenbank zusammengefhrt und mit Hilfe der dedizierten Algorithmen (Retentionszeitalignment, Feature-Clustering, multidimensionale Normalisierung der Intensitten, mehrstufige Datenfilterung, Proteininferenz, Umverteilung der Intensitten geteilter Peptide, Proteinquantifizierung) berarbeitet. Durch diese Nachbearbeitung wird die Reproduzierbarkeit der qualitativen und quantitativen Ergebnisse signifikant gesteigert.rn| Um die Performance der quantitativen Datenanalyse zu evaluieren und mit anderen Lsungen zu vergleichen, wurde ein Satz von exakt definierten Hybridproteom-Proben entwickelt. Die Proben wurden mit den Methoden MSE und UDMSE erfasst, mit Progenesis QIP, synapter und ISOQuant analysiert und verglichen. Im Gegensatz zu synapter und Progenesis QIP konnte ISOQuant sowohl eine hohe Reproduzierbarkeit der Proteinidentifikation als auch eine hohe Przision und Richtigkeit der Proteinquantifizierung erreichen.rn| Schlussfolgernd ermglichen die vorgestellten Algorithmen und der Analyseworkflow zuverlssige und reproduzierbare quantitative Datenanalysen. Mit der Software ISOQuant wurde ein einfaches und effizientes Werkzeug fr routinemige Hochdurchsatzanalysen labelfreier MSE/HDMSE/UDMSE-Daten entwickelt. Mit den Hybridproteom-Proben und den Bewertungsmetriken wurde ein umfassendes System zur Evaluierung quantitativer Akquisitions- und Datenanalysesysteme vorgestellt.
