Cellular localization and mechanism of amyloid precursor protein (APP) homodimer formation in an oxidizing environment

The amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane glycoprotein, which resembles a cell surface receptor, comprising a large ectodomain, a single spanning transmembrane part and a short C-terminal, cytoplasmic domain. It belongs to a conserved gene family, with over 17 members, including also the two mammalian APP homologues proteins APLP1 and APLP2 („amyloid precursor like proteins“). APP is encoded by 19 exons, of which exons 7, 8, and 15 can be alternatively spliced to produce three major protein isoforms APP770, APP751 and APP695, reflecting the number of amino acids. The neuronal APP695 is the only isoform that lacks a Kunitz Protease Inhibitor (KPI) domain in its extracellular portion whereas the two larger, peripheral APP isoforms, contain the 57-amino-acid KPI insert. rnRecently, research effort has suggested that APP metabolism and function is thought to be influenced by homodimerization and that the oligomerization state of APP could also play a role in the pathology of Alzheimer's disease (AD), by regulating its processing and amyloid beta production. Several independent studies have shown that APP can form homodimers within the cell, driven by motifs present in the extracellular domain, as well as in the juxtamembrane (JM) and transmembrane (TM) regions of the molecule, whereby the exact molecular mechanism and the origin of dimer formation remains elusive. Therefore, we focused in our study on the actual subcellular origin of APP homodimerization within the cell, an underlying mechanism, and a possible impact on dimerization properties of its homologue APLP1. Furthermore, we analyzed homodimerization of various APP isoforms, in particular APP695, APP751 and APP770, which differ in the presence of a Kunitz-type protease inhibitor domain (KPI) in the extracellular region. In order to assess the cellular origin of dimerization under different cellular conditions, we established a mammalian cell culture model-system in CHO-K1 (chinese hamster ovary) cells, stably overexpressing human APP, harboring dilysine based organelle sorting motifs at the very C-terminus [KKAA-Endoplasmic Reticulum (ER); KKFF-Golgi]. In this study we show that APP exists as disulfide-bound, SDS-stable dimers, when it was retained in the ER, unlike when it progressed further to the cis-Golgi, due to the KKFF ER exit determinant. These stable APP complexes were isolated from cells, and analyzed by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing conditions, whereas strong denaturing and reducing conditions completely converted those dimers to monomers. Our findings suggested that APP homodimer formation starts early in the secretory pathway and that the unique oxidizing environment of the ER likely promotes intermolecular disulfide bond formation between APP molecules. We particularly visualized APP dimerization employing a variety of biochemical experiments and investigated the origin of its generation by using a Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) approach with split GFP-APP chimeras. Moreover, using N-terminal deletion constructs, we demonstrate that intermolecular disulfide linkage between cysteine residues, exclusively located in the extracellular E1 domain, represents another mechanism of how an APP sub-fraction can dimerize within the cell. Additionally, mutational studies revealed that cysteines at positions 98 and 105, embedded in the conserved loop region within the E1 domain, are critical for interchain disulfide bond formation. Using a pharmacological treatment approach, we show that once generated in the oxidative environment of the ER, APP dimers remain stably associated during transport, reaching the plasma membrane. In addition, we demonstrate that APP isoforms, encompassing the KPI domain, exhibit a strongly reduced ability to form cis-directed dimers in the ER, whereas trans-directed cell aggregation of Drosophila Schneider (S2)-cells was isoform independent, mediating cell-cell contacts. Thus, suggesting that steric properties of KPI-APP might be the cause for weaker cis-interaction in the ER, compared to APP695. Finally, we provide evidence that APP/APLP1 heterointeractions are likewise initiated in the ER, suggesting a similar mechanism for heterodimerization. Therefore, dynamic alterations of APP between monomeric, homodimeric, and possibly heterodimeric status could at least partially explain some of the variety in the physiological functions of APP.rn

Untersuchung von Morphologie, Enzymverteilungen und Transportdynamik des Golgi-Apparates lebender Säugerzellen mittels hochauflösender MMM-4Pi-Mikroskopie in zwei Farben

Seit der Entdeckung des Golgi-Apparates im Jahre 1898 wurden seine Struktur, seine enzymatische Zusammensetzung und die Dynamik des in ihm stattfindenden Proteintransports intensiv untersucht. Dennoch blieben bis heute wesentliche Fragen zu seiner Funktionsweise unbeantwortet. So existieren nach wie vor mehrer konkurrierende Modelle zur Organisation der hoch komplexen räumlichen Verteilung seiner Enzyme sowie zum grundlegenden Mechanismus des Intra-Golgi Transports. Die Beantwortung dieser und weiterer Fragen ist für das Verständnis des Golgi-Apparates essentiell, aber aus methodischen Gründen höchst schwierig, da es bisher nicht möglich war die Struktur und Dynamik des Golgi-Apparates lebender Zellen mit der hierfür notwendigen Auflösung und Geschwindigkeit zu untersuchen. Bis heute gibt es für die funktionsmorphologischen Untersuchungen des Golgi-Apparates lebender Zellen keine echte Alternative zur Fernfeld- Fluoreszenzmikroskopie. Das MMM-4Pi-Mikroskop ermöglicht als erstes Fluoreszenzmikroskop, aufgrund seiner Auflösung von ~200 nm in der Fokalebene und 100-150 nm entlang der optischen Achse, die Untersuchung der Subkompartimente des Golgi-Apparates und kann, aufgrund seiner hohen Aufnahmegeschwindigkeit von 0.5 Hz, die Dynamik des Intra-Golgi Transports zeitlich auflösen. Ziel dieser Arbeit war es daher, den Golgi-Apparate lebender Zellen in zwei Farben sowie mit einer bisher nicht möglichen räumlichen und zeitlichen Auflösung zu untersuchen. Um die Leistungsfähigkeit der dreidimensionalen Bildgebung dieser Methode zu überprüfen, wurde erstmals der Golgi-Apparat fixierter Säugerzellen korrelativ mit dem Transmissionselektronenmikroskop und dem MMM-4Pi-Mikroskop aufgenommen. Die rekonstruierten Strukturen korrelierten in allen drei Raumrichtungen zu über 80%, was die Validität beider Methoden eindrucksvoll unter Beweis stellt. Zudem konnten mit dem MMM-4Pi-Mikroskop Aussackungen von Golgi-Cisternen aufgelöst werden, was die Eignung dieser Methode zur strukturellen Analyse der Subkompartimente des Golgi-Apparates unterstreicht. Des Weiteren wurde, in einer Reihe zweifarbiger Aufnahmeserien, die Verteilung dreier Golgi-Enzyme in lebenden Säugerzellen untersucht, und ihre mittlere relative Distanz bestimmt. Ihre aus der Literatur bekannten Lokalisationen konnten in zwei Fällen bestätigt (GalT, MannII) und in einem Fall korrigiert werden (2-OST). Im Gegensatz zu der konfokal bestimmten Cis-/Mid-Lokalisation von 2-OST zeigen die Ergebnisse der hoch aufgelösten Distanzanalyse deutlich, dass eine Mid-/Trans-Lokalisation vorliegt. Dieses Ergebnis wurde elektronenmikroskopisch überprüft und bestätigt. Da die räumliche Anordnung der Golgi-Enzyme die Reihenfolge ihrer Akitvität wiederspiegelt, ist eine möglichst präzise Bestimmung ihrer Konzentrationsverteilungen essentiell, um die Funktion des Golgi-Apparates zu verstehen. Insbesondere zeigt dieses Resultat, dass die Bestimmung der Lokalisation von Golgi-Enzymen über konfokale Kolokalisationsstudien zu falschen Ergebnissen führen kann. Die Kombination hoher räumlicher Auflösung mit einer schnellen Datenaufnahme erlaubte die Analyse der Transportdynamik innerhalb des Golgi-Apparates von Säugerzellen. In mehreren Zeitserien zweifarbiger Aufnahmen wurde der Transport des Frachtproteins VSVG relativ zum Trans-Golgi-Marker GalT untersucht. Dabei zeigte sich, dass das Trans-Golgi-Kompartiment in einigen Fällen durch eine deutliche Formänderung auf die Ankunft eines VSVG-Transportpulses reagierte und sich insgesamt wesentlich dynamischer verhielt als der Transportpuls selbst. Diese Beobachtung bestätigt tendenziell Transportmodelle, die den Golgi-Apparat nicht als statisches, sondern als dynamisches, aktiv am Transport beteiligtes Organell beschreiben. Die hier vorgestellten Experimente stellen die ersten Untersuchungen zur Verteilung von Golgi-Enzymen sowie zur Transportdynamik des Golgi-Apparates lebender Zellen mit einer dreidimensionalen Auflösung im Bereich von 100-200 nm dar. Wie am Beispiel von 2 OST gezeigt, ist es mit dem MMM-4Pi-Mikroskop allgemein möglich, die Lokalisation von Golgi-Enzymen wesentlich präziser als bisher zu bestimmen. Bei der Untersuchung dynamischer Prozesse ist in naher Zukunft eine Steigerung der Leistungsfähigkeit der Methode zu erwarten. Zum einen werden CCD-Kameras mit kürzeren Auslesezeiten und einer elektronischen Verstärkung des Signals die Datenaufnahme weiter beschleunigen. Zum anderen könnte durch die Entwicklung eines parallelisierten Mikroskops mit Einphotonen-Anregung das Bleichen konsekutiver Aufnahmen verringert werden, wodurch längere Aufnahmeserien möglich sein werden.

LRP1 modulates APP trafficking and APP metabolism within compartments of the secretory pathway. Increased AICD generation is ineffective in nuclear translocation and transcriptional activation

LRP1 modulates APP trafficking and metabolism within compartments of the secretory pathway The amyloid precursor protein (APP) is the parent protein to the amyloid beta peptide (Abeta) and is a central player in Alzheimer’s disease (AD) pathology. Abeta liberation depends on APP cleavage by beta- and gamma-secretases. To date, only a unilateral view of APP processing exists, excluding other proteins, which might be transported together and/or processed dependent on each other by the secretases described above. The low density lipoprotein receptor related protein 1 (LRP1) was shown to function as such a mediator of APP processing at multiple steps. Newly synthesized LRP1 can interact with APP, implying an interaction between these two proteins early in the secretory pathway. Therefore, we wanted to investigate whether LRP1 can mediate APP trafficking along the secretory pathway, and, if so, whether it affects APP processing. Indeed, we demonstrate that APP trafficking is strongly influenced by LRP1 transport through the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi compartments. LRP1-constructs with ER- and Golgi-retention motifs (LRP-CT KKAA, LRP-CT KKFF) had the capacity to retard APP trafficking at the respective steps in the secretory pathway. Here, we provide evidence that APP metabolism occurs in close conjunction with LRP1 trafficking, highlighting a new role of lipoprotein receptors in neurodegenerative diseases. Increased AICD generation is ineffective in nuclear translocation and transcriptional activity A sequence of amyloid precursor protein (APP) cleavages gives rise to the APP intracellular domain (AICD) together with amyloid beta peptide (Abeta) and/or p3 fragment. One of the environmental factors identified favouring the accumulation of AICD appears to be a rise in intracellular pH. This accumulation is a result of an abrogated cleavage event and does not extend to other secretase substrates. AICD can activate the transcription of artificially expressed constructs and many downstream gene targets have been discussed. Here we further identified the metabolism and subcellular localization of the constructs used in this well documented gene reporter assay. We also co-examined the mechanistic lead up to the AICD accumulation and explored possible significances for its increased expression. We found that most of the AICD generated under pH neutralized conditions is likely that cleaved from C83. Furthermore, the AICD surplus is not transcriptionally active but rather remains membrane tethered and free in the cytosol where it interacts with Fe65. However, Fe65 is still essential in AICD mediated transcriptional transactivation although its exact role in this set of events is unclear.

Software tools and efficient algorithms for the feature detection, feature tracking, event localization, and visualization of large sets of atmospheric data

Data sets describing the state of the earth's atmosphere are of great importance in the atmospheric sciences. Over the last decades, the quality and sheer amount of the available data increased significantly, resulting in a rising demand for new tools capable of handling and analysing these large, multidimensional sets of atmospheric data. The interdisciplinary work presented in this thesis covers the development and the application of practical software tools and efficient algorithms from the field of computer science, aiming at the goal of enabling atmospheric scientists to analyse and to gain new insights from these large data sets. For this purpose, our tools combine novel techniques with well-established methods from different areas such as scientific visualization and data segmentation. In this thesis, three practical tools are presented. Two of these tools are software systems (Insight and IWAL) for different types of processing and interactive visualization of data, the third tool is an efficient algorithm for data segmentation implemented as part of Insight.Insight is a toolkit for the interactive, three-dimensional visualization and processing of large sets of atmospheric data, originally developed as a testing environment for the novel segmentation algorithm. It provides a dynamic system for combining at runtime data from different sources, a variety of different data processing algorithms, and several visualization techniques. Its modular architecture and flexible scripting support led to additional applications of the software, from which two examples are presented: the usage of Insight as a WMS (web map service) server, and the automatic production of a sequence of images for the visualization of cyclone simulations. The core application of Insight is the provision of the novel segmentation algorithm for the efficient detection and tracking of 3D features in large sets of atmospheric data, as well as for the precise localization of the occurring genesis, lysis, merging and splitting events. Data segmentation usually leads to a significant reduction of the size of the considered data. This enables a practical visualization of the data, statistical analyses of the features and their events, and the manual or automatic detection of interesting situations for subsequent detailed investigation. The concepts of the novel algorithm, its technical realization, and several extensions for avoiding under- and over-segmentation are discussed. As example applications, this thesis covers the setup and the results of the segmentation of upper-tropospheric jet streams and cyclones as full 3D objects. Finally, IWAL is presented, which is a web application for providing an easy interactive access to meteorological data visualizations, primarily aimed at students. As a web application, the needs to retrieve all input data sets and to install and handle complex visualization tools on a local machine are avoided. The main challenge in the provision of customizable visualizations to large numbers of simultaneous users was to find an acceptable trade-off between the available visualization options and the performance of the application. Besides the implementational details, benchmarks and the results of a user survey are presented.

Intraflagellar transport in the developing and mature vertebrate retina

Intraflagellar transport (IFT) is required for the assembly and maintenance of cilia. In this study we analyzed the subcellular localization of IFT proteins in retinal cells by correlative high-resolution immunofluorescence and immunoelectron microscopy. The rod photoreceptor cell was used as a model system to analyze protein distribution in cilia. To date the expression of IFT proteins has been described in the ciliary region without deciphering the precise spatial and temporal subcellular localization of IFT proteins, which was the focus of my work. rnThe establishment of the pre-embedding immunoelectron method was an important first step for the present doctoral thesis. Results of this work reveal the differential localization of IFT20, IFT52, IFT57, IFT88, IFT140 in sub-ciliary compartments and also their presence in non-ciliary compartments of retinal photoreceptor cells. Furthermore, the localization of IFT20, IFT52 and IFT57 in dendritic processes of non-ciliated neurons indicates that IFT protein complexes also operate in non-ciliated cells and may participate in intracellular vesicle trafficking in eukaryotic cells in general.rnIn addition, we have investigated the involvement of IFT proteins in the ciliogenesis of vertebrate photoreceptor cilia. Electron microscopy analyses revealed six morphologically distinct stages. The first stages are characterized by electron dense centriolar satellites and a ciliary vesicle, while the formation of a ciliary shaft and of the light sensitive outer segment disks are features of the later stages. IFT proteins were expressed during all stages of photoreceptor cell development and found to be associated with the ciliary apparatus. In addition to the centriole and basal body IFT proteins are present in the photoreceptor cytoplasm, associated with centriolar satellites, post-Golgi vesicles and with the ciliary vesicle. Therewith the data provide an evidence for the involvement of IFT proteins during ciliogenesis, including the formation of the ciliary vesicle and the elongation of the primary cilium of photoreceptor cells. Moreover, the cytoplasmic localization of IFT proteins in the absence of a ciliary shaft in early stages of ciliogenesis indicates roles of IFT proteins beyond their well-established function for IFT in mature cilia and flagella. rn

Analysen zur molekularen Charakterisierung von Proteinen des humanen Usher-Syndroms und Evaluation genbasierter Therapiestrategien

Analysen zur molekularen Charakterisierung von Proteinen des humanen Usher-Syndroms und Evaluation genbasierter Therapiestrategien rnDas humane Usher Syndrom (USH) ist die häufigste Form vererbter Taub-Blindheit. In der vorliegenden Dissertation wurde diese komplexe Erkrankung auf verschiedenen Ebenen analysiert: in Arbeiten zur Expression und Lokalisation von USH-Proteinen, der Analyse der USH-Proteinnetzwerke und deren Funktionen sowie darauf aufbauend die Entwicklung von Therapiestrategien für USH.rnIm Rahmen der Arbeit wurde die Expression und (sub)-zelluläre Lokalisation des USH1D-Genproduktes CDH23 in der Retina und Cochlea analysiert. CDH23-Isoformen werden in der Maus zeitlich und räumlich differentiell exprimiert. In den Retinae von Mäusen, nicht humanen Primaten und Menschen zeigten Analysen eine unterschiedliche Expression und Lokalisation des Zell-Zelladhäsionsmoleküls CDH23, was auf Funktions-unterschiede der einzelnen Isoformen in den analysierten Spezies hindeutet.rnAnalysen zur Aufklärung der USH-Proteinnetzwerke ergaben eine potentielle Interaktion des USH1G-Gerüstproteins SANS mit dem Golgi- und Centrosom-assoziierten Protein Myomegalin. Die direkte Interaktion der Proteine konnte durch unabhängige Experimente verifiziert werden. Beide Interaktionspartner sind in den Retinae verschiedener Spezies partiell ko-lokalisiert und partizipieren im periciliären USH-Proteinnetzwerk. Die Assoziation von SANS und Myomegalin mit dem Mikrotubuli-Cytoskelett weist auf eine Funktion des Proteinkomplexes in gerichteten Transportprozessen innerhalb der Photorezeptoren hin und bekräftigt die Hypothese einer Rolle von SANS und assoziierten Netzwerken mit Transportprozessen.rnDas hier gewonnene erweiterte Verständnis der molekularen Grundlagen sowie die Aufklärung der zellulären Funktion der Proteinnetzwerke ermöglichen die Entwicklung therapeutischer Strategien für USH. Ein Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf der Entwicklung genbasierter Therapiestrategien und deren Evaluation, wobei der Schwerpunkt auf der Therapiestrategie der Genreparatur lag. Die mit Hilfe von Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) induzierte Homologe Rekombination für die Genkorrektur wurde exemplarisch an der 91C>T/p.R31X-Mutation im USH1C-Gen gezeigt. Effiziente ZFN wurden identifiziert, generiert und erfolgreich im Zellkulturmodellsystem eingesetzt. Die Analysen demonstrierten eine Reparatur der Mutation durch Homologe Rekombination auf genomischer Ebene und die Expression des wiederhergestellten Proteins. Durch die Genkorrektur im endogenen Lokus sind Größe des Gens, Isoformen oder die Art der Mutation keine limitierenden Faktoren für die Therapie. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente unterstreichen das enorme Potential ZFN-basierter Therapiestrategien hin zu personalisierten Therapieformen nicht nur für USH sondern auch für andere erbliche Erkrankungen, deren genetische Grundlagen bekannt sind.rn