Zuckertransport und Regulation des Hexosestoffwechsels bei Oenococcus oeni

Das Milchsäurebakterium Oenococcus oeni, welches für den biologischen Säureabbau im Wein eingesetzt wird, verstoffwechselt Hexosen über den Phosphoketolaseweg. Dabei können beträchtliche Mengen Acetat entstehen. Die Ursachen dafür wurden untersucht, insbesondere der Fructosestoffwechsel. Außerdem wurde der Hexosetransport untersucht, über den bei O. oeni noch nichts bekannt war. Die Aufnahme von Hexosen in die Zelle erfolgt mit hoher Affinität (KM=10 µM) über einen Symport mit H+, aber mit sehr niedriger spezifischer Aktivität (Vmax=9 U / g TG). Zusätzlich werden Hexosen mit ausreichender Aktivität über (vermutlich erleichterte) Diffusion in die Zelle transportiert, allerdings nur bei hohen Hexosekonzentrationen. Es wurden Gene gefunden, die für ein Hexose- Phosphotransferasesystem kodieren, welches in O. oeni keine bedeutende Rolle beim Transport spielt, aber vermutlich eine regulative Funktion hat. Zur Bildung von Essigsäure tragen verschiedene Faktoren bei: Der Ethanolweg, der in der heterofermentativen Milchsäuregärung die Reoxidation von NAD(P)H bewerkstelligt, ist durch die niedrige spezifische Aktivität der Acetaldehyddehydrogenase limitiert. Diese Limitierung wird noch verstärkt, wenn die zellulären Gehalte von Coenzym A aufgrund von Pantothensäuremangel niedrig sind. O. oeni umgeht durch Bildung von Erythrit die Limitierung, und Acetylphosphat wird nicht zu Ethanol reduziert, sondern als Acetat ausgeschieden. Bei Cofermentation von Hexosen mit externen Elektronenakzeptoren, wie Fructose, Pyruvat oder Sauerstoff, werden letztere zur Reoxidation von NAD(P)H genutzt, und als Folge wird Acetat ausgeschieden. Der Fluss von Fructose in den Phosphoketolaseweg wird durch das Enzym Phosphoglucoseisomerase verhindert, wenn dieses durch 6-Phosphogluconat gehemmt wird. Als Konsequenz wird Fructose im Mannitweg reduziert, was die Bildung von Essigsäure im Phosphoketolaseweg fördert. Bei niedrigen Wachstums- und Stoffwechselraten, z.B. bei C-Limitierung, ist der Ethanolweg nicht limitierend für den Stoffwechsel, und Hexosen werden über heterofermentative Milchsäuregärung umgesetzt, ohne daß Acetat entsteht. Pyruvat kann gleichzeitig als Elektronenakzeptor und als Energiequelle dienen: O. oeni ist in der Lage, Pyruvat mittels Disproportionierung zu Lactat und Acetat+CO2 zu fermentieren, und dabei Energie zu konservieren (0,5 ATP / Pyruvat).

Mikrobiologie der Fermentation in NawaRo-Biogasanlagen unter besonderer Berücksichtigung des Abbaus von Propionsäure

In NawaRo-Biogasanlagen (BGA) kann es durch das Angebot an leicht fermentierbaren Kohlenstoff¬quel¬len zu einer bakteriell bedingten Übersäuerung durch unerwünschte kurzkettige Fettsäuren kommen. Häufiger kommt es zur Akkumulation von Propionsäure. Methanogene Archaea können bei niedrigen pH-Werten nicht mehr wachsen. Somit kann der gesamte Prozess der mikrobiellen Bildung von Biogas zum Erliegen kom¬men, was für die Biogasbetreiber zu erheblichen finanziellen Verlusten führt. Das Ziel dieser Disserta¬tion war die Aufklärung der anaeroben bakteriellen Population, die in Biogasanlagen Propionsäure ab¬bauen kann. Aus Propionat entsteht dabei Acetat und Wasserstoff. Da dieser anaerobe Prozess endergon verläuft, kann Propionsäure anaerob nur abgebaut werden, wenn der Wasserstoffpartialdruck niedrig ge¬halten wird. Diese Aufgabe erfüllen in Biogasanalgen methanogene Archaea. Die sog. sekundären Gärer leben somit in synthropher Kultur mit methanogenen Archaea.rnIn dieser Arbeit wurden die Mikroorganismen von Propionsäure-abbauenden Anreicherungskulturen aus vier NawaRo-BGA‘s identifiziert und ihr Substrat- und Produktspektrum analysiert. Die Anreicherungskul¬turen wurden vom Prüf- und Forschungsinstitut e. V. in Pirmasens zur Verfügung gestellt. Durch Analyse der bakteriellen 16S rDNA-Sequenzen der erhaltenen stabilen Propionsäure-abbauenden Mischkulturen wurde gezeigt, dass sich unter den Bakterien hauptsächlich Verwandte von den Clostridiales, aber auch Bacteroides sp., δ-, ε- so¬wie γ-Proteobakterien, Spirochäten, Synergistales und ungewöhnlicher Weise auch Thermotogales befanden. Aus Propionsäure-abbauenden Mischkulturen und aus Fermentern mesophiler NawaRo-Biogasanlagen wurden anaerobe Bakterien und methanogene Archaea angereichert und isoliert. Es wurden aus den Propionsäure-abbauenden Mischkulturen Stämme in Reinkultur erhalten, die entsprechend der 16S rDNA-Analyse als Clostridium sartagoforme Stamm Ap1a520 und Proteiniphilum acetatigenes Stamm Fp1a520 identifiziert wurden. Sowohl aus Fermentern und Nachgärern von drei NawaRo-BGA‘s als auch aus zwei Laborfermentern des Leibniz-Instituts für Agrartechnik in Potsdam-Bornim e.V. (ATB) wurden Reinkulturen von methanogenen Archaea erhalten. Diese konnten den Species Methanobacterium formicicum, Metha¬noculleus bourgensis, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, Methanosarcina sp., Methanosaeta concilii und Methanomethylovorans sp. zugeordnet werden. Damit wurden in dieser Arbeit unter anderem die typischen bisher nur durch molekularbiologische Methoden identifizierten Species methanogener Ar¬chaea aus unterschiedlichen Fermentern in Reinkultur erhalten. Dabei wurde gezeigt, dass die specifically amplified polymorphic DNA-PCR (SAPD-PCR) eine geeignete Methode darstellt, Stämme der gleichen Art methanogener Archaea voneinander zu unterscheiden. Die Methanproduktion der kultivierten methanoge¬nen Archaea wurde gaschromatographisch analysiert. Es zeigte sich, dass die hydrogenotrophe Metha¬nogenese der effizientere und ergiebigere Weg zur Bildung von Methan ist. Mit der Bestimmung der Zellzahl des Isolates Methanoculleus bourgensis Stamm TAF1.1 bei gleichzeitiger Messung der Methanbildung wurde gezeigt, dass die Methanbildung nicht zwangsläufig mit dem Wachstum korreliert. Ne-ben Pflanzenfasern beinhalteten das hergestellte Reaktorfiltrat in den Kultivierungsansätzen Acetat, die essentielle Aminosäure Valin und den Zuckeralkohol Glycerol. Gezielte Misch¬kul¬turen von sekundären Gärern mit methanogenen Isolaten ergaben einen fördernden Einfluss auf diese Bak¬terien durch hydrogenotrophe Archaea. Diese Bakterien bauten Substrate ab oder bildeten Produkte, die sie unter den gegebenen Bedingungen ohne hydrogenotrophe Archaea nicht umsetzen konnten.

Mikrobielle Synthese von Biopolymeren aus der nachwachsenden Rohstoffquelle Weizenstroh

Weizenstroh als erneuerbare Ressource zur Produktion von Biopolymeren und wichtigen Grundchemikalien stellt eine ökologisch sinnvolle Alternative dar. Durch die vom PFI durchgeführte Thermodruckhydrolyse konnte das Weizenstroh und die darin enthaltenen Zucker fast vollständig mobilisiert werden. Ein umfangreiches Screening nach Organismen, welche die Zucker des Weizenstrohs verwerten konnten, ergab, dass einige wenige Stämme zur PHB-Bildung aus Xylose befähigt waren (10 %). Zur PHB-Synthese aus Glucose waren indes ca. doppelt so viele Organismen in der Lage (20 %). Zwei der insgesamt 118 untersuchten Organismen zeigten besonders gute PHB-Bildung sowohl mit Xylose als auch mit Glucose als Substrat. Dabei handelte es sich um die hauseigenen Stämme Bacillus licheniformis KHC 3 und Bacillus megaterium KNaC 2. Nach Enttoxifizierung der hemicellulosischen Fraktion konnte diese als C-Quelle im Mineral Medium eingesetzt werden. Burkholderia sacchari DSM 17165 und Hydrogenophaga pseudoflava DSM 1034, sowie die hauseigenen Isolate Bacillus licheniformis KHC 3 und Bacillus megaterium KNaC 2 wurden für die Synthese von PHB aus der hemicellulosischen Fraktion verwendet. Die Zucker der hemicellulosischen Fraktion (Xylose, Glucose, Arabinose) konnten durch diese Organismen zur PHB-Synthese genutzt werden. Hierbei stellte sich heraus, dass die beiden Bacillus-Stämme besser zur Produktion von PHB aus dem hemicellulosischen Hydrolysat geeignet waren als die Stämme der DSMZ. Die alternative Umsetzung der im hemicellulosischem Hydrolysat enthaltenen Zucker (Xylose, Glucose und Arabinose) in die wichtigen Grundchemikalien Lactat und Acetat konnte durch die Verwendung von heterofermentativen Milchsäurebakterien verwirklicht werden. Die Bildung dieser wichtigen Grundchemikalien stellt eine interessante Alternative zur PHB-Synthese dar. Die Menge an teuren Zusätzen wie Tomatensaft, welcher für das Wachstum der MSB essentiell war, konnte reduziert werden. Die Glucose der zweiten Fraktion des Weizenstrohs, der cellulosischen Fraktion, konnte ebenfalls durch den Einsatz von Mikroorganismen in PHB umgewandelt werden. Kommerzielle Cellulasen der Firma Novozymes konnten große Mengen an Glucose (≥10 g/l) aus der cellulosischen Fraktion freisetzen. Diese freie Glucose wurde mit Hilfe von Cupriavidus necator DSM 545, Cupriavidus necator NCIMB 11599, Bacillus licheniformis KHC 3 und Bacillus megaterium KNaC 2 zu PHB fermentiert. Wie auch beim hemicellulosischen Hydrolysat konnten hier die beiden Bacillus-Stämme die besten Ergebnisse erzielen. Bei ihnen machte die PHB mehr als die Hälfte der Trockenmasse aus. Die Abtrennung des Zielprodukts ohne die Verwendung von umweltschädlichen Lösungsmitteln wurde durch die Lyse der Zielzellen durch eigens isolierte Enzyme aus Streptomyceten verwirklicht. Die Zelllyse durch die Enzyme aus Streptomyces globisporus subsp. caucasius DSM 40814 und Streptomyces albidoflavus DSM 40233 war erfolgreich und zeigte vor allem bei den Bacillen hohe Wirkung (83 % und 99 % Zelllyse). Bei dem Gram-negativen Organismus Cupriavidus necator DSM 428 konnte die anfangs niedrige Zelllyse von 38 % durch Ultraschallbehandlung auf ca. 75 % erhöht werden.

Bedeutung von allelen Varianten des Hexose-Transporters Hxt3p und der Hexokinasen Hxk1p und Hxk2p für Aufnahme und Verwertung von Glucose und Fructose durch Weinhefen

In Hinsicht darauf, dass sich S. cerevisiae-Stämme im Laufe der Domestizierung und Anpassung an verschiedene Habitate genetisch verändert haben, wurde in dieser Arbeit eine repräsentative Auswahl von Labor-, kommerziellen und in der Natur vorkommenden Saccharomyces-Stämmen und ihren Interspezies-Hybriden auf die Verbreitung alleler Varianten der Hexokinase-Gene HXK1 und HXK2 getestet. Von den Hexose-Transportern stand Hxt3p im Mittelpunkt, da seine essentielle Rolle bei der Vergärung von Glucose und Fructose bereits belegt wurde.rnIn dieser Arbeit wurde gezeigt, dass es bedeutende Unterschiede in der Vergärung von Glucose und Fructose zwischen Weinhefen der Gattung Saccharomyces gibt, die z.T. mit Struktur-Varianten des Hexose-Transporter Hxt3p korrelieren. rnInsgesamt 51 Hefestämme wurden auf ihre allele Variante des HXT3-Gens untersucht. Dabei haben sich drei Hauptgruppen (die Fermichamp®-Typ Gruppe, Bierhefen und Hybrid-Stämme) mit unterschiedlichem HXT3-Allel ergeben. Im Zusammenhang mit der Weinherstellung wurden signifikante Nukleotid-Substitutionen innerhalb des HXT3-Gens der robusten S. cerevisiae-Stämme (wie z.B. Sekthefen, kommerzielle Starterkulturen) und Hybrid-Stämmen festgestellt. Diese Hefen zeichneten sich durch die Fähigkeit aus, den Most trotz stressigen Umwelt-Bedingungen (wie hohe Ethanol-Konzentration, reduzierter Ammonium-Gehalt, ungünstiges Glucose:Fructose-Verhältnis) zu vergären. rnDie Experimente deuten darauf hin, dass die HXT3-Allel-Variante des als Starterkultur verwendbaren Stammes Fermichamp®, für den verstärkten Fructose-Abbau verantwortlich ist. Ein gleiches Verhalten der Stämme mit dieser Allel-Variante wurde ebenfalls beobachtet. Getestet wurden die S. cerevisiae-Stämme Fermichamp® und 54.41, die bezüglich Hxt3p-Aminosäuresequenz gleich sind, gegenüber zwei S. cerevisiae-Stämmen mit dem HXT3-Standard-Alleltyp Fermivin® und 33. Der Unterschied in der Hexose-Verwertung zwischen Stämmen mit Fermichamp®- und Standard-Alleltyp war in der Mitte des Gärverlaufs am deutlichsten zu beobachten. Beide Gruppen, sowohl mit HXT3 Fermichamp®- als auch Fermivin®-Alleltyp vergoren die Glucose schneller als die Fructose. Der Unterschied aber zwischen diesen HXT3-Alleltypen bei der Zucker-Verwertung lag darin, dass der Fermichamp®-Typ eine kleinere Differenz in der Abbau-Geschwindigkeit der beiden Hexosen zeigte als der Fermivin®-Typ. Die Zuckeraufnahme-Messungen haben die relativ gute Fructose-Aufnahme dieser Stämme bestätigt.rnEbenfalls korrelierte der fructophile Charakter des Triple-Hybrides S. cerevisiae x S. kudriavzevii x S. bayanus-Stamm HL78 in Transportexperimenten mit verstärkter Aufnahme von Fructose im Vergleich zu Glucose. Insgesamt zeigte dieser Stamm ähnliches Verhalten wie die S. cerevisiae-Stämme Fermichamp® und 54.41. rnIn dieser Arbeit wurde ein Struktur-Modell des Hexose-Transporters Hxt3p erstellt. Als Basis diente die zu 30 % homologe Struktur des Proton/Xylose-Symporters XylE aus Escherichia coli. Anhand des Hxt3p-Modells konnten Sequenzbereiche mit hoher Variabilität (Hotspots) in drei Hxt3p-Isoformen der Hauptgruppen (die Fermichamp®-Typ Gruppe, Bierhefen und Hybrid-Stämme) detektiert werden. Diese signifikanten Aminosäure-Substitutionen, die eine mögliche Veränderung der physikalischen und chemischen Eigenschaften des Carriers mit sich bringen, konzentrieren sich auf drei Bereiche. Dazu gehören die Region zwischen den N- und C-terminalen Domänen, die cytosolische Domäne und der Outside-Loop zwischen Transmembranregion 9 und Transmembranregion 10. rnObwohl die Transportmessungen keinen Zusammenhang zwischen Stämmen mit unterschiedlichen HXT3-Allelen und ihrer Toleranz gegenüber Ethanol ergaben, wurde ein signifikanter Anstieg in der Zuckeraufnahme nach vorheriger 24-stündiger Inkubation mit 4 Vol% Ethanol bei den Teststämmen beobachtet. rnInsgesamt könnten allele Varianten von HXT3-Gen ein nützliches Kriterium bei der Suche nach robusten Hefen für die Weinherstellung oder für andere industrielle Anwendungen sein. Die Auswirkung dieser Modifikationen auf die Struktur und Effizienz des Hexose-Transporters, sowie der mögliche Zusammenhang mit Ethanol-Resistenz müssen weiter ausführlich untersucht werden. rnEin Zusammenhang zwischen den niedrig variablen Allel-Varianten der Hexokinase-Gene HXK1 und HXK2 und dem Zucker-Metabolismus wurde nicht gefunden. Die Hexokinasen der untersuchten Stämme wiesen allerdings generell eine signifikante geringere Affinität zu Fructose im Vergleich zu Glucose auf. Hier liegt sicherlich eine Hauptursache für den Anstieg des Fructose:Glucose-Verhältnisses im Laufe der Vergärung von Traubenmosten.rn