Bedeutung von allelen Varianten des Hexose-Transporters Hxt3p und der Hexokinasen Hxk1p und Hxk2p für Aufnahme und Verwertung von Glucose und Fructose durch Weinhefen

In Hinsicht darauf, dass sich S. cerevisiae-Stämme im Laufe der Domestizierung und Anpassung an verschiedene Habitate genetisch verändert haben, wurde in dieser Arbeit eine repräsentative Auswahl von Labor-, kommerziellen und in der Natur vorkommenden Saccharomyces-Stämmen und ihren Interspezies-Hybriden auf die Verbreitung alleler Varianten der Hexokinase-Gene HXK1 und HXK2 getestet. Von den Hexose-Transportern stand Hxt3p im Mittelpunkt, da seine essentielle Rolle bei der Vergärung von Glucose und Fructose bereits belegt wurde.rnIn dieser Arbeit wurde gezeigt, dass es bedeutende Unterschiede in der Vergärung von Glucose und Fructose zwischen Weinhefen der Gattung Saccharomyces gibt, die z.T. mit Struktur-Varianten des Hexose-Transporter Hxt3p korrelieren. rnInsgesamt 51 Hefestämme wurden auf ihre allele Variante des HXT3-Gens untersucht. Dabei haben sich drei Hauptgruppen (die Fermichamp®-Typ Gruppe, Bierhefen und Hybrid-Stämme) mit unterschiedlichem HXT3-Allel ergeben. Im Zusammenhang mit der Weinherstellung wurden signifikante Nukleotid-Substitutionen innerhalb des HXT3-Gens der robusten S. cerevisiae-Stämme (wie z.B. Sekthefen, kommerzielle Starterkulturen) und Hybrid-Stämmen festgestellt. Diese Hefen zeichneten sich durch die Fähigkeit aus, den Most trotz stressigen Umwelt-Bedingungen (wie hohe Ethanol-Konzentration, reduzierter Ammonium-Gehalt, ungünstiges Glucose:Fructose-Verhältnis) zu vergären. rnDie Experimente deuten darauf hin, dass die HXT3-Allel-Variante des als Starterkultur verwendbaren Stammes Fermichamp®, für den verstärkten Fructose-Abbau verantwortlich ist. Ein gleiches Verhalten der Stämme mit dieser Allel-Variante wurde ebenfalls beobachtet. Getestet wurden die S. cerevisiae-Stämme Fermichamp® und 54.41, die bezüglich Hxt3p-Aminosäuresequenz gleich sind, gegenüber zwei S. cerevisiae-Stämmen mit dem HXT3-Standard-Alleltyp Fermivin® und 33. Der Unterschied in der Hexose-Verwertung zwischen Stämmen mit Fermichamp®- und Standard-Alleltyp war in der Mitte des Gärverlaufs am deutlichsten zu beobachten. Beide Gruppen, sowohl mit HXT3 Fermichamp®- als auch Fermivin®-Alleltyp vergoren die Glucose schneller als die Fructose. Der Unterschied aber zwischen diesen HXT3-Alleltypen bei der Zucker-Verwertung lag darin, dass der Fermichamp®-Typ eine kleinere Differenz in der Abbau-Geschwindigkeit der beiden Hexosen zeigte als der Fermivin®-Typ. Die Zuckeraufnahme-Messungen haben die relativ gute Fructose-Aufnahme dieser Stämme bestätigt.rnEbenfalls korrelierte der fructophile Charakter des Triple-Hybrides S. cerevisiae x S. kudriavzevii x S. bayanus-Stamm HL78 in Transportexperimenten mit verstärkter Aufnahme von Fructose im Vergleich zu Glucose. Insgesamt zeigte dieser Stamm ähnliches Verhalten wie die S. cerevisiae-Stämme Fermichamp® und 54.41. rnIn dieser Arbeit wurde ein Struktur-Modell des Hexose-Transporters Hxt3p erstellt. Als Basis diente die zu 30 % homologe Struktur des Proton/Xylose-Symporters XylE aus Escherichia coli. Anhand des Hxt3p-Modells konnten Sequenzbereiche mit hoher Variabilität (Hotspots) in drei Hxt3p-Isoformen der Hauptgruppen (die Fermichamp®-Typ Gruppe, Bierhefen und Hybrid-Stämme) detektiert werden. Diese signifikanten Aminosäure-Substitutionen, die eine mögliche Veränderung der physikalischen und chemischen Eigenschaften des Carriers mit sich bringen, konzentrieren sich auf drei Bereiche. Dazu gehören die Region zwischen den N- und C-terminalen Domänen, die cytosolische Domäne und der Outside-Loop zwischen Transmembranregion 9 und Transmembranregion 10. rnObwohl die Transportmessungen keinen Zusammenhang zwischen Stämmen mit unterschiedlichen HXT3-Allelen und ihrer Toleranz gegenüber Ethanol ergaben, wurde ein signifikanter Anstieg in der Zuckeraufnahme nach vorheriger 24-stündiger Inkubation mit 4 Vol% Ethanol bei den Teststämmen beobachtet. rnInsgesamt könnten allele Varianten von HXT3-Gen ein nützliches Kriterium bei der Suche nach robusten Hefen für die Weinherstellung oder für andere industrielle Anwendungen sein. Die Auswirkung dieser Modifikationen auf die Struktur und Effizienz des Hexose-Transporters, sowie der mögliche Zusammenhang mit Ethanol-Resistenz müssen weiter ausführlich untersucht werden. rnEin Zusammenhang zwischen den niedrig variablen Allel-Varianten der Hexokinase-Gene HXK1 und HXK2 und dem Zucker-Metabolismus wurde nicht gefunden. Die Hexokinasen der untersuchten Stämme wiesen allerdings generell eine signifikante geringere Affinität zu Fructose im Vergleich zu Glucose auf. Hier liegt sicherlich eine Hauptursache für den Anstieg des Fructose:Glucose-Verhältnisses im Laufe der Vergärung von Traubenmosten.rn

Concerning the fact that S. cerevisiae strains have genetically altered during domestication and adaptation to different habitats, in a number of laboratory, industrial and naturally occurring Saccharomyces strains and interspecies hybrids the distribution of allelic variations of hexokinase genes HXK1 and HXK2 was studied. Because of its essential function for the whole fermentation process the hexose transporter Hxt3p was investigated.rnIn this work it was shown that there are different fermentation performances between wine yeasts of the genus Saccharomyces, which correlate partly with structural variants of the hexose transporter Hxt3p.rnA total of 51 yeast strains were evaluated for their allelic variants of the HXT3 gene. Three main groups (group with Fermichamp®-like allele, brewery yeasts and hybrid strains) with different HXT3 allele variants could be distinguished. Moreover significant nucleotide substitutions within the HXT3 gene of high performance S. cerevisiae strains (such as sparkling wine yeasts, commercial wine strains) and hybrid strains were detected. These yeasts were characterized by the ability to finish grape wine fermentations in spite of stressful environmental conditions (such as high ethanol concentration, reduced ammonia levels, unfavorable glucose: fructose ratio).rnThe experiments suggested that the HXT3 allelic variant of the commercial wine strain Fermichamp® is responsible for enhanced fructose consumption. A similar behavior in other strains harboring the same type of hexose transporter was also observed. The S. cerevisiae strains Fermichamp® and 54.41, which have the same amino acid sequence of Hxt3p, were tested against two S. cerevisiae strains Fermivin® and 33 with reference type Hxt3p. The difference in hexose consumption between strains with Fermichamp®-like allele and strains with reference allele could be observed most clearly in the middle of the fermentation process. Both groups, as well with HXT3 Fermichamp®-like allele as with HXT3 Fermivin®-like allele, fermented glucose faster than fructose. However, the Fermichamp®-type showed a smaller difference in the degradation rate of the two hexoses than the Fermivin®-type did. The sugar uptake measurements have confirmed the relatively good fructose uptake of these strains.rnIn addition, the enhanced fructose consumption of triple hybrid S. cerevisiae x S. kudriavzevii x S. bayanus strain HL78 correlated with increased uptake of fructose compared to glucose. Overall, this strain showed similar behavior to the S. cerevisiae strains Fermichamp® and 54.41.rnIn this work, a structure model of hexose transporter Hxt3p was designed, using the structure of the closely related E. coli proton/xylose symporter XylE as template. Both proteins have a sequence identity of 30.0 %. Based on the Hxt3p model, sequence regions with high variability (hotspots) in three Hxt3p isoforms of the main groups (group with Fermichamp®-like allele, brewery yeasts and hybrid strains) were detected. Significant amino acid substitutions which possibly modify the physical and chemical properties of the carrier could be identified in three regions. These regions are the interface between N-terminal and C-terminal domain, the cytosolic domain and the extracellular loop between TM9 and TM10.rnAlthough the sugar uptake measurements showed no correlation between strains with different HXT3 alleles and their tolerance to ethanol, a significant increase in sugar uptake was observed after incubation for 24 hours with 4 % ethanol.rnOverall, the allelic type of HXT3 gene may be a useful criterion to select high performance strains for winemaking and other industrial applications. The impact of these modifications on the structure and efficiency of this hexose transporter and the possible association with ethanol resistance needs further detailed investigations.rnA correlation between the low variable allelic variants of hexokinase genes HXK1 and HXK2 and sugar metabolism was not found. The hexokinases of strains studied showed, however, generally a significant lower affinity for fructose compared to glucose. This is certainly a major cause of the increase of fructose: glucose ratio during the fermentation of grape musts.rn