Untersuchungen zur Rolle des BH3-only-Proteins Bid bei der Stress-induzierten Apoptose in Karzinomzelllinien

Als BH3-only Protein gehört Bid zu den proapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2 Familie, die während der Apoptose die Freisetzung Caspase-aktivierender Proteine aus den Mitochondrien kontrollieren. Bid zählt zu den potentesten BH3-only Proteinen und wird von vielen transformierten und nichttransformierten Zellen konstitutiv exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, Bid durch RNA-Interferenz stabil zu depletieren, um Bid-abhängige Apoptosewege in HeLa Zervixkarzinomzellen zu identifizieren, die von intrinsischen Stressstimuli sowie von konventionellen und neuartigen Chemotherapeutika induziert werden. Da Bid im Todesrezeptor-vermittelten Signalweg der Apoptose durch Caspase-8 gespalten und aktiviert wird, waren die Bid-depletierten Zellen signifikant vor der Fas/CD95-, TRAIL- oder TNF-α-induzierten Apoptose geschützt und zeigten nach Exposition mit allen drei Todesrezeptorliganden eine drastisch reduzierte Effektorcaspase-Aktivität und eine höhere Proliferationsrate als die Kontrollzellen. Eine ektopische Bidexpression in Bid knock down (kd) Zellen hob die Protektion vor der Fas- und TRAIL-induzierten Apoptose auf. Der Proteasominhibitor Epoxomicin, der Proteinkinase-Inhibitor Staurosporin oder die ER Stress-induzierenden Agenzien Tunicamycin, Thapsigargin und Brefeldin A lösten hingegen einen Bid-unabhängigen Zelltod aus. Allerdings konnten subletale Tunicamycin- oder Thapsigarginkonzentrationen HeLa Zellen für die TRAIL-induzierte Apoptose sensitivieren. Da der Synergieeffekt auf einer ER Stress-vermittelten Amplifizierung des Todesrezeptorwegs beruhte, zu der eine Tunicamycin-induzierte Steigerung der Expression des Todesrezeptors DR5 signifikant beitrug, erfolgte diese Sensitivierung nur in Bid-profizienten Zellen. Bid war in HeLa Zellen außerdem an der apoptotischen Signalkaskade beteiligt, die von den DNA-schädigenden Agenzien Etoposid, Doxorubicin und Oxaliplatin (Oxa) ausgelöst wird. Nach Behandlung mit Oxa zeigten die Bid kd Zellen eine verzögerte Caspase-2, -3, -8 und -9 Aktivierung, einen geringeren Verlust des mitochondrialen Membranpotentials sowie eine reduzierte Apoptose- und eine höhere Proliferationsrate als Bid-profiziente Zellen. Neben Bid war ein weiteres BH3-only Protein, Puma, an der Oxa-induzierten Effektorcaspase-Aktivierung beteiligt, da eine Puma-spezifische siRNA unabhängig vom Bidstatus der Zellen antiapoptotisch wirkte. Im letzten Teil der Arbeit wurde untersucht, welche Proteasen für die durch gentoxische Agenzien induzierte Spaltung und Aktivierung von Bid verantwortlich sind. Obwohl Caspasen für die Exekutionphase der Oxa-induzierten Apoptose notwendig waren, trugen sie weder zur initialen Bidaktivierung noch zur mitochondrialen Depolarisierung bei, da sie erst postmitochondrial aktiviert wurden. Konventionelle Calpaine hingegen wurden nach DNA-Schädigung bereits stromaufwärts der Mitochondrien aktiviert und der Calpaininhibitor Calpeptin reduzierte nicht nur die Bid- und Caspasespaltung, sondern auch die mitochondriale Depolarisierung signifikant. Diese Protektion durch Calpeptin fiel in Bid-depletierten Zellen signifikant geringer als in Bid-profizienten Kontrollzellen aus. Auch war in Oxa-behandelten Bid kd Zellen, die eine durch Caspase-2, -3 und -8 nicht spaltbare Bidmutante exprimierten, trunkiertes Bid nachweisbar, dessen Generierung durch Calpain-, aber nicht durch Caspaseinhibierung verhindert werden konnte. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse auf eine Calpain-abhängige Bidaktivierung stromaufwärts der Mitochondrien hin und zeigen, dass die BH3-only Proteine Bid und Puma wichtige Vermittler der Oxa-induzierten Apoptose in HeLa Zellen darstellen.

Na +-coupled betaine symporters involved in osmotic stress response in prokaryotes and eukaryotes

The betaine/GABA transporter BGT1 is one of the most important osmolyte transporters in the kidney. BGT1 is a member of the neurotransmitter sodium symporter (NSS) family, facilitates Na+/Cl--coupled betaine uptake to cope with hyperosmotic stress. Betaine transport in kidney cells is upregulated under hypertonic conditions by a yet unknown mechanism when increasing amounts of intracellular BGT1 are inserted into the plasma membrane. Re-establishing isotonicity results in ensuing depletion of BGT1 from the membrane. BGT1 phosphorylation on serines and threonines might be a regulation mechanism. In the present study, four potential PKC phosphorylation sites were mutated to alanines and the responses to PKC activators, phorbol 12-myristate acetate (PMA) and dioctanoyl-sn-glycerol (DOG) were determined. GABA-sensitive currents were diminished after 30 min preincubation with these PKC activators. Staurosporine blocked the response to DOG. Three mutants evoked normal GABA-sensitive currents but currents in oocytes expressing the mutant T40A were greatly diminished. [3H]GABA uptake was also determined in HEK-293 cells expressing EGFP-tagged BGT1 with the same mutations. Three mutants showed normal upregulation of GABA uptake after hypertonic stress, and downregulation by PMA was normal compared to EGFP-BGT1. In contrast, GABA uptake by the T40A mutant showed no response to hypertonicity or PMA. Confocal microscopy of the EGFP-BGT1 mutants expressed in MDCK cells, grown on glass or filters, revealed that T40A was present in the cytoplasm after 24 h hypertonic stress while the other mutants and EGFP-BGT1 were predominantely present in the plasma membrane. All four mutants co-migrated with EGFP-BGT1 on Western blots suggesting they are full-length proteins. In conclusion, T235, S428, and S564 are not involved in downregulation of BGT1 due to phosphorylation by PKC. However, T40 near the N-terminus may be part of a hot spot important for normal trafficking or insertion of BGT1 into the plasma membrane. Additionally, a link between substrate transport regulation, insertion of BGT1 into the plasma membrane and N-glycosylation in the extracellular loop 2 (EL2) could be revealed. The functional importance of two predicted N-glycosylation sites, which are conserved in EL2 within the NSS family were investigated for trafficking, transport and regulated plasma membrane insertion by immunogold-labelling, electron microscopy, mutagenesis, two-electrode voltage clamp measurements in Xenopus laevis oocytes and uptake of radioactive-labelled substrate into MDCK cells. Trafficking and plasma membrane insertion of BGT1 was clearly promoted by proper N-glycosylation in both, oocytes and MDCK cells. De-glycosylation with PNGase F or tunicamycin led to a decrease in substrate affinity and transport rate. Mutagenesis studies revealed that in BGT1 N183 is the major N-glycosylation site responsible for full protein activity. Replacement of N183 with aspartate resulted in a mutant, which was not able to bind N-glycans suggesting that N171 is a non-glycosylated site in BGT1. N183D exhibited close to WT transport properties in oocytes. Surprisingly, in MDCK cells plasma membrane insertion of the N183D mutant was no longer regulated by osmotic stress indicating unambiguously that association with N-glycans at this position is linked to osmotic stress-induced transport regulation in BGT1. The molecular transport mechanism of BGT1 remains largely unknown in the absence of a crystal structure. Therefore investigating the structure-function relationship of BGT1 by a combination of structural biology (2D and 3D crystallization) and membrane protein biochemistry (cell culture, substrate transport by radioactive labeled GABA uptake into cells and proteoliposomes) was the aim of this work. While the functional assays are well established, structure determination of eukaryotic membrane transporters is still a challenge. Therefore, a suitable heterologous expression system could be defined, starting with cloning and overexpression of an optimized gene. The achieved expression levels in P. pastoris were high enough to proceed with isolation of BGT1. Furthermore, purification protocols could be established and resulted in pure protein, which could even be reconstituted in an active form. The quality and homogeneity of the protein allowed already 2D and 3D crystallization, in which initial crystals could be obtained. Interestingly, the striking structural similarity of BGT1 to the bacterial betaine transporter BetP, which became a paradigm for osmoregulated betaine transport, provided information on substrate coordination in BGT1. The structure of a BetP mutant that showed activity for GABA was solved to 3.2Å in complex with GABA in an inward facing open state. This structure shed some light into the molecular transport mechanisms in BGT1 and might help in future to design conformationally locked BGT1 to enforce the on-going structure determination.

Rolle der FOS-Proteine und des MAPK-Signallings in der Regulation der zellulären Antwort auf genotoxischen Stress

Die mittlere Überlebenszeit nach Erkennung eines Glioblastoms ohne Behandlung liegt bei 3 Monaten und kann durch die Behandlung mit Temozolomid (TMZ) auf etwa 15 Monate gesteigert werden. Neben TMZ sind die chlorethylierenden Nitrosoharnstoffe die meistversprechendsten und am häufigsten eingesetzten Chemotherapeutika in der Gliomtherapie. Hier liegt die mittlere Überlebenszeit bei 17,3 Monaten. Um die Therapie des Glioblastoms noch effektiver zu gestalten und Resistenzen zu begegnen, werden unterschiedlichste Ansätze untersucht. Eine zentrale Rolle spielen hierbei das activator protein 1 (AP-1) und die mitogen aktivierten Proteinkinasen (MAPK), deren Funktion in bisherigen Arbeiten noch unzureichend beleuchtet wurde.rnBesonders mit der Rolle des AP-1-bildenden Proteins FRA-1 in der Therapie des Glioblastoms haben sich bisher nur wenige Arbeiten beschäftigt, weshalb im ersten Teil der vorliegenden Arbeit dessen Funktion in der Regulation der Chemosensitivität gegenüber dem chlorethylierenden Agenz ACNU genauer untersucht wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die FRA 1-Expression durch Behandlung mit ACNU induziert wird. Die Induktion erfolgte über die beiden MAPKs ERK1/2 und p38K. JNK hatte keinen Einfluss auf die Induktion. Durch die Herunterregulation der FRA-1-Expression mit Hilfe von siRNA und eines shRNA exprimierenden Plasmids kam es zu einer signifikanten Sensitivierung gegenüber ACNU. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Herunterregulation der FRA-1-Expression in einer verminderten AP 1-Bildung, bedingt durch eine reduzierte Menge an FRA-1 im AP-1-Komplex resultiert. Die Sensitivierung gegenüber ACNU ist weder durch eine Veränderung in der DNA-Reparatur, noch in der Modulation der FAS-Ligand- bzw. FAS-Rezeptor-Expression bedingt. Auch die hier untersuchten BCL 2-Familienmitglieder wiesen keine Unterschiede in der Expression durch Modulation der FRA 1-Expression auf. Allerdings kam es durch die verminderte FRA-1-Expression zu einer Reduktion der Zellzahl in der G2/M-Phase nach Behandlung mit ACNU. Diese ging einher mit einer reduzierten Menge an phosphoryliertem und unphosphoryliertem CHK1, weshalb davon auszugehen ist, dass FRA 1 nach ACNU-Behandlung in Gliomzellen vor der Apoptose schützt, indem es modulierend auf die Zellzykluskontrolle einwirkt.rnIm zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Regulation der apoptotischen Antwort nach Behandlung mit ACNU und TMZ genauer beleuchtet, wobei ein spezielles Augen¬merk auf AP 1 und die MAPKs gelegt wurde. Hier konnte gezeigt werden, dass die Apoptose nach Behandlung mit ACNU bzw. TMZ sowohl durch Spaltung von Pro-Caspase 8, als auch Pro-Caspase 9 eingeleitet wird. Dabei akkumulierte in beiden Fällen p53 vermehrt im Zellkern. Eine Inhibierung der transkriptionellen Aktivität von p53 führte nach ACNU-Behandlung zu einer Sensitivierung der Zellen, nach TMZ-Behandlung kam es zu einem leichten Anstieg in der Vitälität. Der FAS-Rezeptor wurde nach ACNU- und nach TMZ-Behandlung aktiviert und auch die DNA-Reparaturproteine DDB2 und XPC wurden in beiden Fällen vermehrt exprimiert. Für die MAPKs JNK und ERK1/2 konnte gezeigt werden, dass diese pro-apoptotisch wirken. Die AP-1-Bildung nach ACNU-Behandlung erfolgte bereits nach 24 h und war von langer Dauer, wohingegen nach TMZ-Behandlung nur eine transiente AP 1-Bildung zu relativ späten Zeitpunkten detektiert werden konnte. Ebenso konnte für das AP-1-Zielgen FAS-Ligand nach ACNU-Behandlung eine relativ schnelle, lang anhaltende Aktivierung detektiert werden, wohingegen nach TMZ-Behandlung zu einem späten Zeitpunkt ein kurzer Anstieg im Signal zu verzeichnen war. In späteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass das BCL-2-Familienmitglied BIM eine zentrale Rolle in der Regulation des intrinsischen Apoptosesignalweges nach Behandlung mit ACNU und TMZ spielt. Die hier entstanden Ergebnisse tragen entscheidend zum Verständnis der durch diese beiden Agenzien gesteuerten, apoptotischen Signalwege bei und bieten eine fundierte Grundlage für weitere Untersuchungen.rn