Untersuchungen zum infektiösen Aufnahmeweg des humanen Papillomvirus HPV33

Nicht-umhüllte humane Papillomviren binden an Heparansulfatproteoglykane (HSPG) der Zelloberfläche und werden durch Endocytose in Zielzellen aufgenommen. Um eine effiziente Infektion zu etablieren, muss die virale DNA in den Zellkern transportiert werden. Auf welche Art und Weise hierbei die Endosomenmembran überwunden wird, war bislang völlig unklar. Die Suche nach potentiellen membrandestabilisierenden Eigenschaften der Kapsidproteine L1 und L2 von HPV führte im Vorfeld der vorliegenden Dissertation zur Identifizierung eines carboxyterminalen Peptids des minoren L2-Proteins, welches als sehr mikrobizid und fungizid beschrieben werden konnte. Es ist gekennzeichnet durch einen Bereich basischer und einen Bereich hydrophober Aminosäuren. Da das minore L2-Protein für den Infektionsprozess von Papillomviren essentiell ist, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Rolle des C-terminalen Peptids für den Transport des infektiösen Materials durch die zelluläre Membranbarriere genauer untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das carboxyterminale L2-Peptid von HPV33 nach externer Zugabe eine cytotoxische Wirkung auf höhere eukaryotische Zellen hat. Es lokalisiert an zellulären Membranen und induziert eine pH-abhängige Reduktion des ATP-Gehalts von Säugerzellen. Weiter wurde nachgewiesen, dass das Peptid die Cytoplasmamembran permeabilisieren und für kleine, hydrophile Substanzen wie Propidiumjodid durchlässig machen kann. Mutationen innerhalb des Peptids verdeutlichten die Notwendigkeit beider Bereiche, basischer und hydrophober Aminosäuren, für den membrandestabilisierenden Effekt. Im Folgenden wurde die intrazelluläre Aktivität des L2-Peptids mit Hilfe von GFP2-Peptid-Fusionen analysiert. Das Peptid ist in der Lage, eine Integration des globulären GFP-Dimers in Membranen zu vermitteln, was bei einem hohen Prozentsatz der exprimierenden Zellen zum Absterben führt. Auch wt 33L2 weist im Gegensatz zu C-terminalen Deletions- und Punktmutanten die Fähigkeit zur Membranassoziation auf. Abschließend wurde der Effekt von Mutationen innerhalb dieses L2-Peptids auf die Infektiösität von L1/L2-Pseudovirionen beschrieben. Die Mutationen haben keinen Einfluss auf den Einbau des L2-Proteins in die Pseudovirionen und auf die DNA-Verpackung. Die Virusmorphogenese ist somit nicht negativ beeinträchtigt. Die Infektiösität der HPV33- wie auch von HPV16-Pseudovirionen mit C-terminal mutiertem L2-Protein ist jedoch auf das Niveau von solchen reduziert, die nur aus dem majoren L1 bestehen und geht gegen Null. Zusammenfassend kann man festhalten, dass das minore Kapsidprotein L2 von HPV am Carboxyterminus eine membrandestabilisierende Aktivität besitzt, welche unter Papillomviren konserviert und für eine effektive Infektion essentiell ist.

Molecular characterization of the immune modulatory function of matrix metalloproteinase-7, a factor in the tumour micromilieu

Matrix metalloproteinases are the components of the tumour microenvironment which play a crucial role in tumour progression. Matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) is expressed in a variety of tumours and the expression is associated with an aggressive malignant phenotype and poor prognosis. A role for MMP-7 in the immune escape of tumours has been postulated, but the mechanisms are not clearly understood. The present study was focused on identifying physiological inactivators of MMP-7 and also to unravel the mechanisms involved in MMP-7 mediated immune escape. This study shows that human leukocyte elastase (HLE), secreted by polymorphonuclear leukocytes cleaves MMP-7 in the catalytic domain as revealed by N-terminal sequencing. Further analysis demonstrates that the activity of MMP-7 was drastically decreased after HLE treatment in a time and dose dependent manner. MMP-7 induces apoptosis resistance in tumour cells by cleaving CD95 and CD95L. The effect of HLE on MMP-7 mediated apoptosis resistance was analysed. In vitro stimulation of apoptosis by anti-Apo-1 (anti-CD95 antibody) and the chemotherapeutic drug doxorubicin is reduced by MMP-7. Also tumour specific cytotoxic T cells do not effectively kill tumour cells in the presence of MMP-7. This study revealed that HLE abrogates the negative effect of MMP-7 on apoptosis induced by CD95 stimulation, doxorubicin or cytotoxic T cells and restores apoptosis sensitivity of tumour cells. To gain insight into the possible immune modulatory functions of MMP-7, experiments were performed to identify new immune relevant substrates. The human T cell line, Jurkat, was selected for these studies. Hsc70 which is involved in uncoating of clathrin vesicles was found in the supernatants of the MMP-7 treated cells indicating a modulatory role of MMP-7 on endocytosis. Further studies demonstrated that MMP-7 leads to decreased clathrin staining in HEK293, HepG2, Jurkat, CD4+ T cells and dendritic cells. Results also show MMP-7 treatment increased surface expression of cytotoxic T lymphocyte associated protein-4 (CTLA-4) which accumulated due to inhibition of the clathrin mediated internalization in CD4+CD25+ cells.

Interactions of gold nanoparticles with polymeric membranes

This thesis focuses on the interactions of nanoparticles with artificial membranes. The synthesis of the block copolymer poly(dimethylsiloxane)-block-poly(2-methyloxazoline) (PDMS-b-PMOXA) is described, as well as the formation of polymersomes in water. These polymersomes act as minimal cell models, consisting of an artificial bilayer membrane only, allowing the study of the interactions between nanoparticles and polymeric membranes. Both spherical and rod-shaped gold nanoparticles (AuNPs) were used in this study and they were characterized using light scattering (PCS), transmission electron microscopy (TEM), UV/Vis spectroscopy, and polarization anisotropy measurements. The polymer grafting on the spherical cores is asymmetric (shell asphericity) but is parallel to the inherent, due to polycrystallinity, core anisotropy, resulting in a characteristic scattering of the AuNPs in PCS.rnInteractions of polymersomes and AuNPs were investigated by PCS, cryo-TEM and UV/Vis. Three possible scenarios upon mixing of polymersomes and AuNPs can be distinguished by using only PCS: (i) no interactions between particles and vesicles, (ii) attachment of the particles to the outer side of the vesicles (decoration), and (iii) uptake of particles into the vesicles. It is shown that all three scenarios are possible, solely depending on the particle’s surface functionalization. In addition, it was revealed that the AuNPs need to be attached to the inner side of the membrane instead of diffusing freely within the vesicle. The present experimental findings essentially help with the understanding of the interactions of nanoparticles with membranes and show that the process of endocytosis can be attributed to physical processes only. rn

Die regulatorische Funktion des Usher-Syndrom-Proteins SANS in Proteinnetzwerken

Die vorliegende kumulative Arbeit umfasst Analysen zur Aufklärung der molekularen Grundlagen des humanen Usher-Syndroms (USH), der häufigsten Ursache kombinierter vererblicher Taub-Blindheit. Ziel dieser Arbeit war es, neue Erkenntnisse zur Funktion der USH-Proteine und den von ihnen organisierten Protein-Netzwerken in der Photorezeptorzelle zu erhalten. Dadurch sollten weitere Einsichten in die molekularen Ursachen des retinalen Phänotyps von USH gewonnen werden. Die Ergebnisse dieser Analysen wurden in einem Übersichtsartikel (I) und zwei Originalarbeiten (II, III) zusammengestellt.rn Im Übersichtsartikel (I) wurden die vorliegenden Hinweise zusammengefasst, die USH auf Grundlage der molekularen Verbindungen ebenfalls als Ciliopathien definiert. Zudem wird die Bedeutung des periciliären USH-Proteinnetzwerkes für das sensorische Cilium (Außensegment) der Photorezeptorzelle herausgestellt. rn In Publikation II wurde der Aufbau des USH1-USH2-Proteinnetzwerkes als Teil des periciliären Komplexes analysiert, der beim cargo handover von vesikulärer Fracht vom Innensegment- auf den ciliären Transport für die Photorezeptorzelle essentiell ist. Experimentell wurde Ush2a als neuer SANS-Interaktionspartner validiert. Des Weiteren wurde ein ternärer Komplex aus den USH-Proteinen SANS, Ush2a und Whirlin identifiziert, dessen Zusammensetzung durch die phosphorylierungsabhängige Interaktion zwischen SANS und Ush2a reguliert werden könnte. Dieser ternäre Komplex kann sowohl der Integrität der Zielmembran dienen als auch am Transfer von Molekülen ins Außensegment beteiligt sein.rn In Publikation III wurde das MAGUK-Protein Magi2 als neuer Interaktionspartner von SANS identifiziert und die Interaktion durch komplementäre Interaktionsassays validiert. Dabei wurde ein internes PDZ-Binde-Motiv in der SAM-Domäne von SANS identifiziert, das die Interaktion zur PDZ5-Domäne von Magi2 phosphorylierungsabhängig vermittelt. Dadurch wurde bestätigt, dass SANS durch post-translationale Modifizierung reguliert wird. Weiterführende Experimente zur Funktion des Magi2-SANS-Komplexes zeigen, dass Magi2 an Prozess der Rezeptor-vermittelten Endocytose beteiligt ist. Die Phosphorylierung von SANS durch die Kinase CK2 spielt bei der Endocytose ebenfalls eine wichtige Rolle. Der Phosphorylierungsstatus von SANS moduliert die Interaktion zu Magi2 und reguliert dadurch negativ den Prozess der Endocytose. In RNAi-Studien wurde die durch Magi2-vermittelte Endocytose darüber hinaus mit dem Prozess der Ciliogenese verknüpft. Die Analyse der subzellulären Verteilung der Interaktionspartner lokalisieren Magi2 im periciliären Komplex und assoziieren das periciliäre USH-Proteinnetzwerk dadurch mit dem Prozess der Endocytose in der ciliary pocket. Der SANS-Magi2-Komplex sollte demnach für Aufbau und Funktion des sensorischen Ciliums der Photorezeptorzelle eine wichtige Rolle spielen.rn Die Gesamtheit an Informationen, die aus den Publikationen dieser Dissertation und aus den Kooperationsprojekten (*) resultieren, haben die Kenntnisse zur zellulären Funktion der USH-Proteine und ihrer Interaktionspartner und damit über die pathogenen Mechanismen von USH erweitert. Dies bildet die Basis, um fundierte Therapiestrategien zu entwickeln.