Comparative DNA sequence and methylation analyses of orthologous genes in humans and non-human primates: Genetic and epigenetic footprints of evolution

Welche genetische Unterschiede machen uns verschieden von unseren nächsten Verwandten, den Schimpansen, und andererseits so ähnlich zu den Schimpansen? Was wir untersuchen und auch verstehen wollen, ist die komplexe Beziehung zwischen den multiplen genetischen und epigenetischen Unterschieden, deren Interaktion mit diversen Umwelt- und Kulturfaktoren in den beobachteten phänotypischen Unterschieden resultieren. Um aufzuklären, ob chromosomale Rearrangements zur Divergenz zwischen Mensch und Schimpanse beigetragen haben und welche selektiven Kräfte ihre Evolution geprägt haben, habe ich die kodierenden Sequenzen von 2 Mb umfassenden, die perizentrischen Inversionsbruchpunkte flankierenden Regionen auf den Chromosomen 1, 4, 5, 9, 12, 17 und 18 untersucht. Als Kontrolle dienten dabei 4 Mb umfassende kollineare Regionen auf den rearrangierten Chromosomen, welche mindestens 10 Mb von den Bruchpunktregionen entfernt lagen. Dabei konnte ich in den Bruchpunkten flankierenden Regionen im Vergleich zu den Kontrollregionen keine höhere Proteinevolutionsrate feststellen. Meine Ergebnisse unterstützen nicht die chromosomale Speziationshypothese für Mensch und Schimpanse, da der Anteil der positiv selektierten Gene (5,1% in den Bruchpunkten flankierenden Regionen und 7% in den Kontrollregionen) in beiden Regionen ähnlich war. Durch den Vergleich der Anzahl der positiv und negativ selektierten Gene per Chromosom konnte ich feststellen, dass Chromosom 9 die meisten und Chromosom 5 die wenigsten positiv selektierten Gene in den Bruchpunkt flankierenden Regionen und Kontrollregionen enthalten. Die Anzahl der negativ selektierten Gene (68) war dabei viel höher als die Anzahl der positiv selektierten Gene (17). Eine bioinformatische Analyse von publizierten Microarray-Expressionsdaten (Affymetrix Chip U95 und U133v2) ergab 31 Gene, die zwischen Mensch und Schimpanse differentiell exprimiert sind. Durch Untersuchung des dN/dS-Verhältnisses dieser 31 Gene konnte ich 7 Gene als negativ selektiert und nur 1 Gen als positiv selektiert identifizieren. Dieser Befund steht im Einklang mit dem Konzept, dass Genexpressionslevel unter stabilisierender Selektion evolvieren. Die meisten positiv selektierten Gene spielen überdies eine Rolle bei der Fortpflanzung. Viele dieser Speziesunterschiede resultieren eher aus Änderungen in der Genregulation als aus strukturellen Änderungen der Genprodukte. Man nimmt an, dass die meisten Unterschiede in der Genregulation sich auf transkriptioneller Ebene manifestieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Unterschiede in der DNA-Methylierung zwischen Mensch und Schimpanse untersucht. Dazu wurden die Methylierungsmuster der Promotor-CpG-Inseln von 12 Genen im Cortex von Menschen und Schimpansen mittels klassischer Bisulfit-Sequenzierung und Bisulfit-Pyrosequenzierung analysiert. Die Kandidatengene wurden wegen ihrer differentiellen Expressionsmuster zwischen Mensch und Schimpanse sowie wegen Ihrer Assoziation mit menschlichen Krankheiten oder dem genomischen Imprinting ausgewählt. Mit Ausnahme einiger individueller Positionen zeigte die Mehrzahl der analysierten Gene keine hohe intra- oder interspezifische Variation der DNA-Methylierung zwischen den beiden Spezies. Nur bei einem Gen, CCRK, waren deutliche intraspezifische und interspezifische Unterschiede im Grad der DNA-Methylierung festzustellen. Die differentiell methylierten CpG-Positionen lagen innerhalb eines repetitiven Alu-Sg1-Elements. Die Untersuchung des CCRK-Gens liefert eine umfassende Analyse der intra- und interspezifischen Variabilität der DNA-Methylierung einer Alu-Insertion in eine regulatorische Region. Die beobachteten Speziesunterschiede deuten darauf hin, dass die Methylierungsmuster des CCRK-Gens wahrscheinlich in Adaption an spezifische Anforderungen zur Feinabstimmung der CCRK-Regulation unter positiver Selektion evolvieren. Der Promotor des CCRK-Gens ist anfällig für epigenetische Modifikationen durch DNA-Methylierung, welche zu komplexen Transkriptionsmustern führen können. Durch ihre genomische Mobilität, ihren hohen CpG-Anteil und ihren Einfluss auf die Genexpression sind Alu-Insertionen exzellente Kandidaten für die Förderung von Veränderungen während der Entwicklungsregulation von Primatengenen. Der Vergleich der intra- und interspezifischen Methylierung von spezifischen Alu-Insertionen in anderen Genen und Geweben stellt eine erfolgversprechende Strategie dar.

Sequence-controlled synthesis of soluble oligo(p-benzamide)s

This work focused on the synthesis of novel monomers for the design of a series of oligo(p-benzamide)s following two approaches: iterative solution synthesis and automated solid phase protocols. These approaches present a useful method to the sequence-controlled synthesis of side-chain and main-chain functionalized oligomers for the preparation of an immense variety of nanoscaffolds. The challenge in the synthesis of such materials was their modification, while maintaining the characteristic properties (physical-chemical properties, shape persistence and anisotropy). The strategy for the preparation of predictable superstructures was devote to the selective control of noncovalent interactions, monodispersity and monomer sequence. In addition to this, the structure-properties correlation of the prepared rod-like soluble materials was pointed. The first approach involved the solution-based aramide synthesis via introduction of 2,4-dimethoxybenzyl N-amide protective group via an iterative synthetic strategy The second approach focused on the implementation of the salicylic acid scaffold to introduce substituents on the aromatic backbone for the stabilization of the OPBA-rotamers. The prepared oligomers were analyzed regarding their solubility and aggregation properties by systematically changing the degree of rotational freedom of the amide bonds, side chain polarity, monomer sequence and degree of oligomerization. The syntheses were performed on a modified commercial peptide synthesizer using a combination of fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) and aramide chemistry. The automated synthesis allowed the preparation of aramides with potential applications as nanoscaffolds in supramolecular chemistry, e.g. comb-like-

Untersuchungen zur autoimmunen Genese der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura

Untersuchungen zur autoimmunen Genese der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura. rnEinführung: Die idiopathische thrombotisch thrombozytopenische Purpura (TTP) ist eine lebensbedrohliche Mikroangiopathie und wird durch ein Autoantikörper-induziertes Defizit der ADAMTS13-Protease ausgelöst. Eine Assoziation zwischen Krankheitsprädisposition und Vorliegen bestimmter humaner Leukozytenantigene (HLA) wird vermutet. Untersuchungen zu diesem Zusammenhang stellen einen Teil dieser Arbeit dar. rnAutoimmunkrankheiten tendieren zum gemeinsamen Auftreten innerhalb eines Individuums. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird untersucht, ob eine solche Kookkurrenz verschiedener Autoimmunkrankheiten auch bei Patienten mit idiopathischer TTP beobachtet werden kann.rnMethodik: Zur Untersuchung der ersten Fragestellung werden die HLA-Klasse I und II-Merkmale von 54 deutschen TTP-Patienten bestimmt. Alle Patienten weisen Autoantikörper gegen ADAMTS13 und eine Protease-Aktivität <5% vor. Die Blutproben werden mittels Sequence Specific Primer-Polymerase Chain Reaction (PCR) und Sequence Specific Oligonucleotid-PCR auf HLA-DRB1, -DRB3-5 und –DQB1 untersucht. Als Referenz dienen die Werte deutscher Knochenmark- und Blutspender, erhalten über www.allelefrequencies.net. Die statistische Auswertung erfolgt mittels zweiseitigem Binomialtest und die resultierenden p-Werte werden nach Benjamini-Hochberg korrigiert.rnZur Beantwortung der zweiten Fragestellung werden 76 deutsche TTP-Patienten anhand eines standardisierten Fragebogens nach Begleiterkrankungen befragt. Als Vergleichswerte dient die Prävalenz der jeweiligen Erkrankung in der Allgemeinbevölkerung. Die statistische Auswertung erfolgt mittels zweiseitigem Binomialtest. Da die p-Werte nicht korrigiert werden, sind die Ergebnisse nur deskriptiv zu verstehen.rnErgebnis: Der Vergleich der HLA-Frequenzen ergibt ein signifikant gehäuftes Vorkommen von HLA-DQB1*02:02 (p<0,001) und -DRB1*11 (p=0,003) innerhalb des Patientenkollektivs. 20% (DQB1*02:02) bzw. 48,1% (DRB1*11) der TTP-Patienten sind im Gegensatz zu nur 1,2% (DQB1*02:02) bzw. 23,5% (DRB1*11) innerhalb der Vergleichsgruppe für das jeweilige HLA-Merkmal positiv.rnDie Befragung der TTP-Patienten bezüglich weiterer Erkrankungen ergab im Vergleich mit der Allgemeinbevölkerung fünf auffällig häufig im Patientenkollektiv vorkommende Autoimmunkrankheiten: Hashimoto Thyreoiditis (23,5% in der Patientengruppe zu 0,7% in der Allgemeinbevölkerung; p<0,001), systemischer Lupus erythematodes (6,5% der Patienten im Gegensatz zu 0,025% in der Allgemeinbevölkerung, p<0,001), Immunthrombozytopenie (6,3% der Patienten zu 0,02% in der Allgemeinbevölkerung; p<0,001), Psoriasis (9,4% der Patienten zu 2,5% in der Allgemeinbevölkerung; p=0,005) und glutensensitive Enteropathie (3,1% der Patienten zu 0,2% in der Allgemeinbevölkerung; p=0,007). rnSchlussfolgerung: Das vermehrte Vorkommen bestimmter HLA-Merkmale im Patientenkollektiv spricht für eine prädisponierende Wirkung dieser Antigene im Krankheitsgeschehen. Eine mögliche HLA-vermittelte Assoziation zwischen TTP und den genannten Autoimmunkrankheiten wird vermutet, kann jedoch nicht in allen Fällen die beobachtete Kookkurrenz ausreichend erklären. Insgesamt bestätigt die vorliegende Arbeit die Assoziation verschiedener Autoimmunkrankheiten untereinander und spricht für eine genetische Prädisposition zur Ausbildung autoimmuner Störungen. rn