Structural characterisation of tBLMs

Biological membranes are one of the vital key elements of life but are also highly complex architectures. Therefore, various model membrane systems have been developed to enable systematic investigations of different membrane related processes. A biomimetic model architecture should provide a simplified system, which allows for systematic investigation of the membrane while maintaining the essential membrane characteristics such as membrane fluidity or electrical sealing properties. This work has been focused on two complementary parts. In a first part, the behaviour of the whey protein ß-lactoglobulin (ßlg) at a membrane interface has been investigated. Protein-lipid interactions have been studied using Langmuir monolayers at the air-water interface and tethered bilayer lipid membranes. A combination of different surface analytical techniques such as surface plasmon spectroscopy, neutron reflectivity and electrochemical techniques allowed for a detailed analysis of the underlying processes. Those experiments showed that the protein adsorbed in native confirmation, slightly flattened, to hydrophobic monolayers. If hydrophilic bilayers with defects were present, ßlg penetrated the upper layer. Interactions with phospholipids were only observed if the protein was denatured beforehand. Experiments at the air-water interface showed a more rigid conformation of the protein at acidic pH compared to alkaline pH. In the second part of this work, the structure of different model membrane systems has been investigated. Solid supported membrane systems have been established as powerful biomimetic architectures, which allow for the systematic investigation of various membrane related processes. Additionally, these systems have been proposed for biosensing applications. Tethered bilayer lipid membranes (tBLMS) are one type of solid supported membranes. The structure of the anchor lipid that tethers the membrane to the solid support has a significant impact on the membrane properties. Especially the sub-membrane part, which is defined by the spacer group, is important for the biological activity of incorporated membrane proteins. Various anchor lipids have been synthesised with different spacer and anchor groups. An increase of the spacer length led to a direct increase of the water reservoir beneath the membrane. However, this elongation also resulted in an amplified roughness of the monolayer and subsequently to diminished mechanical and electrical bilayer qualities. Additionally, a cholesterol-spacer had been designed to modulate the membrane fluidity. Model membrane systems with additional cholesterol-spacer or upper bilayer leaflets with additional cholesterol also exhibited an increased water reservoir with only slightly diminished mechanical and electrical abilities. Both parts show that tBLMs are very effective model systems that can be applied as biomimetic platforms to study for example lipid-protein interactions. They also enable the incorporation of ion channels and allow for potential biosensing application.

Untersuchung der Struktur und Assemblierung des Lichtsammelkomplexes II höherer Pflanzen mittels elektronenparamagnetischer Resonanz (EPR)

Der Haupt-Lichtsammelkomplex (LHCII) des Photosyntheseapparates höherer Pflanzen gehört zu den häufigsten Membranproteinen der Erde. Seine Kristallstruktur ist bekannt. Das Apoprotein kann rekombinant in Escherichia coli überexprimiert und somit molekularbiologisch vielfältig verändert werden. In Detergenzlösung besitzt das denaturierte Protein die erstaunliche Fähigkeit, sich spontan zu funktionalen Protein-Pigment-Komplexen zu organisieren, welche strukturell nahezu identisch sind mit nativem LHCII. Der Faltungsprozess findet in vitro im Zeitbereich von Sekunden bis Minuten statt und ist abhängig von der Bindung der Cofaktoren Chlorophyll a und b sowie verschiedenen Carotinoiden.rn Diese Eigenschaften machen LHCII besonders geeignet für Strukturuntersuchungen mittels der elektronenparamagnetischen Resonanz (EPR)-Spektrokopie. Diese setzt eine punktspezifische Spinmarkierung des LHCII voraus, die in dieser Arbeit zunächst optimiert wurde. Einschließlich der Beiträge Anderer stand eine breite Auswahl von über 40 spinmarkierten Mutanten des LHCII bereit, einen N-terminalen „Cys walk“ eingeschlossen. Weder der hierfür notwendige Austausch einzelner Aminosäuren noch die Anknüpfung des Spinmarkers beeinträchtigten die Funktion des LHCII. Zudem konnte ein Protokoll zur Präparation heterogen spinmarkierter LHCII-Trimere entwickelt werden, also von Trimeren, die jeweils nur ein Monomer mit einer Spinmarkierung enthalten.rn Spinmarkierte Proben des Detergenz-solubilisierten LHCII wurden unter Verwendung verschiedener EPR-Techniken strukturell analysiert. Als besonders aussagekräftig erwies sich die Messung der Wasserzugänglichkeit einzelner Aminosäurepositionen anhand der Electron Spin Echo Envelope Modulation (ESEEM). In Kombination mit der etablierten Double Electron-Electron Resonance (DEER)-Technik zur Detektion von Abständen zwischen zwei Spinmarkern wurde der membranständige Kernbereich des LHCII in Lösung eingehend untersucht und strukturell der Kristallstruktur für sehr ähnlich befunden. Die Vermessung kristallographisch nicht erfasster Bereiche nahe dem N-Terminus offenbarte die schon früher detektierte Strukturdynamik der Domäne in Abhängigkeit des Oligomerisierungsgrades. Der neue, noch zu vervollständigende Datensatz aus Abstandsverteilungen und ESEEM-Wasserzugänglichkeiten monomerer wie trimerer Proben sollte in naher Zukunft die sehr genaue Modellierung der N-terminalen Domäne des LHCII ermöglichen.rn In einem weiteren Abschnitt der Arbeit wurde die Faltung des LHCII-Apoproteins bei der LHCII-Assemblierung in vitro untersucht. Vorausgegangene fluoreszenzspektroskopi-sche Arbeiten hatten gezeigt, dass die Bindung von Chlorophyll a und b in aufeinanderfolgenden Schritten im Zeitbereich von weniger als einer Minute bzw. mehreren Minuten erfolgten. Sowohl die Wasserzugänglichkeit einzelner Aminosäurepositionen als auch Spin-Spin-Abstände änderten sich in ähnlichen Zeitbereichen. Die Daten deuten darauf hin, dass die Ausbildung der mittleren Transmembran-Helix mit der schnelleren Chlorophyll-a-Bindung einhergeht, während sich die Superhelix aus den beiden anderen Transmembranhelices erst im langsameren Schritt, zusammen mit der Chlorophyll-b-Bindung, ausbildet.rn

Weinproteine - Allergenität und Trubbildung

Wein ist eine komplexe Lösung bestehend aus verschiedensten Komponenten wie Alkohol, Polyphenolen, Polysacchariden, Sulfiten und auch Proteinen. Auch wenn Proteine nur in geringen Mengen im Wein enthalten sind, beeinflussen sie die Qualität maßgeblich. Hier ist zum einen deren potentielle Unverträglichkeit bis hin zur Allergie zu nennen, und zum anderen der Einfluss der Weinproteine auf die Trübung. Im Rahmen einer epidemiologischen Studie der Arbeitsgruppe Fronk/Decker wurde festgestellt, dass es in der Weinregion Mainz ein starkes Interesse gibt die Ursache einer Weinunverträglichkeit zu untersuchen. Für weiterführende Untersuchungen wurde im Rahmen meiner Arbeit das Lipid Transfer Protein (LTP), welches als einziges Allergen der Traube bekannt ist, aus Trauben und Wein in hohem Reinheitsgrad isoliert. Es konnte gezeigt werden, dass dessen Struktur bei der Weinherstellung nicht maßgeblich verändert wurde. In einer klinischen Studie mit 29 Probanden wurde die potentielle Allergenität von Weinproteinen, im Besonderen des LTPs untersucht. Allerdings konnte bei den untersuchten Probanden keine echte IgE-Antikörper-vermittelte Allergie auf das LTP nachgewiesen werden. Daher wird die Ursache der beschriebenen Unverträglichkeiten bei anderen Weininhaltsstoffen oder auch auf pollenassoziierten Kreuzreaktionen vermutet. Bei der Entstehung einer Weintrübung sind zahlreiche Inhaltstoffe beteiligt. Die Rolle der Proteine ist in diesem Zusammenhang noch nicht abschließend geklärt. In dieser Arbeit wurde die Komplexität der Proteinzusammensetzung in Abhängigkeit von Lage, Jahrgang, Rebsorte sowie Behandlungsmaßnahmen gezeigt. Hinsichtlich der Stabilisierung und Trübungsrelevanz der Weinproteine konnte mittels biochemischer, bioinformatischer und biophysikalischer Methoden gezeigt werden, dass nur ein Teil der im Wein enthaltenen Thaumatin-ähnlichen Proteine und Chitinasen an der Trubbildung beteiligt sind. Die Invertase hingegen denaturiert erst ab einer Temperatur von ca. 83 °C und aggregiert in der Trübung. Somit führt dieses Protein bei Wärmetests zu Bentonitbedarfsermittlung in diesem Temperaturbereich zu einer Überschätzung. Die Versuche zur temperaturabhängigen Aggregation von Proteinen zeigen, wie wichtig die Berücksichtigung der Umgebungsfaktoren bei der Trubbildung ist. So konnten unterschiedliche Wechselwirkungen im Puffer- und realen Weinsystem von potentiell trübungsstabilisierenden Polysacchariden mit den Weinproteinen detektiert werden. Für das Arabinogalactan beispielsweise wurde in den Versuchen im Weinsystem eine destabilisierende Wirkung gefunden, während es bei den Versuchen im Puffersystem eine positive Wirkung auf die Stabilisierung der Probe zeigte. Es zeigte sich, dass die verschiedenen Weininhaltsstoffe in einer komplexen Wechselwirkung zueinander stehen und somit eine molekulare Interpretation erschweren.