The oxidation capacity of the atmosphere - OH and HO 2 radical measurements in a boreal forest environment using laser induced fluorescence spectroscopy

Das wichtigste Oxidationsmittel für den Abbau flüchtiger Kohlenwasserstoffverbindungen (VOC, engl.: volatile organic compounds) in der Atmosphäre ist das Hydroxylradikal (OH), welches sich in einem schnellen chemischen Gleichgewicht mit dem Hydroperoxylradical (HO2) befindet. Bisherige Messungen und Modellvergleiche dieser Radikalspezies in Waldgebieten haben signifikante Lücken im Verständnis der zugrundeliegenden Prozesse aufgezeigt.rnIm Rahmen dieser Doktorarbeit wurden Messungen von OH- und HO2-Radikalen mittelsrnlaserinduzierten Fluoreszensmesstechnik (LIF, engl.: laser-induced fluorescence) in einem Nadelwald in Süd-Finnland während der Messkampagne HUMPPA–COPEC–2010 (Hyytiälä United Measurements of Photochemistry and Particles in Air – Comprehensive Organic Precursor Emission and Concentration study) im Sommer 2010 durchgeführt. Unterschiedliche Komponenten des LIF-Instruments wurden verbessert. Eine modifizierte Methode zur Bestimmung des Hintergrundsignals (engl.: InletPreInjector technique) wurde in den Messaufbaurnintegriert und erstmals zur Messung von atmosphärischem OH verwendet. Vergleichsmessungen zweier Instrumente basierend auf unterschiedlichen Methoden zur Messung von OH-Radikalen, chemische Ionisationsmassenspektrometrie (CIMS - engl.: chemical ionization mass spectrometry) und LIF-Technik, zeigten eine gute Übereinstimmung. Die Vergleichsmessungen belegen das Vermögen und die Leistungsfähigkeit des modifizierten LIF-Instruments atmosphärische OH Konzentrationen akkurat zu messen. Nachfolgend wurde das LIF-Instrument auf der obersten Plattform eines 20m hohen Turmes positioniert, um knapp oberhalb der Baumkronen die Radikal-Chemie an der Schnittstelle zwischen Ökosystem und Atmosphäre zu untersuchen. Umfangreiche Messungen - dies beinhaltet Messungen der totalen OH-Reaktivität - wurden durchgeführt und unter Verwendung von Gleichgewichtszustandsberechnungen und einem Boxmodell, in welches die gemessenen Daten als Randbedingungen eingehen, analysiert. Wenn moderate OH-Reaktivitäten(k′(OH)≤ 15 s−1) vorlagen, sind OH-Produktionsraten, die aus gemessenen Konzentrationen von OH-Vorläuferspezies berechnet wurden, konsistent mit Produktionsraten, die unter der Gleichgewichtsannahme von Messungen des totalen OH Verlustes abgeleitet wurden. Die primären photolytischen OH-Quellen tragen mit einem Anteil von bis zu einem Drittel zur Gesamt-OH-Produktion bei. Es wurde gezeigt, dass OH-Rezyklierung unter Bedingungen moderater OH-Reaktivität hauptsächlich durch die Reaktionen von HO2 mit NO oder O3 bestimmt ist. Während Zeiten hoher OH-Reaktivität (k′(OH) > 15 s−1) wurden zusätzliche Rezyklierungspfade, die nicht über die Reaktionen von HO2 mit NO oder O3, sondern direkt OH bilden, aufgezeigt.rnFür Hydroxylradikale stimmen Boxmodell-Simulationen und Messungen gut übereinrn(OHmod/OHobs=1.04±0.16), während HO2-Mischungsverhältnisse in der Simulation signifikant unterschätzt werden (HO2mod/HO2obs=0.3±0.2) und die simulierte OH-Reaktivität nicht mit der gemessenen OH-Reaktivität übereinstimmt. Die gleichzeitige Unterschätzung der HO2-Mischungsverhältnisse und der OH-Reaktivität, während OH-Konzentrationen von der Simulation gut beschrieben werden, legt nahe, dass die fehlende OH-Reaktivität in der Simulation eine noch unberücksichtigte HO2-Quelle darstellt. Zusätzliche, OH-unabhängigernRO2/HO2-Quellen, wie z.B. der thermische Zerfall von herantransportiertem peroxyacetylnitrat (PAN) und die Photolyse von Glyoxal sind indiziert.

Prozessierung des humanen GARP–Rezeptors und die physiologischen Auswirkungen

GARP (Glycoprotein A Repetitions Predominant) ist ein Oberflächenrezeptor auf regulatorischen T–Zellen (TRegs), der den latenten TGF–β (Transforming Growth Factor–β) bindet. Ein Funktionsverlust von T Regs hat gravierende Autoimmunerkrankungen wie das Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X–linked Syndrome (IPEX), Multiple Sklerose (MS) oder Rheumatoide Arthritis (RA) zur Folge. GARP stellt über eine Erhöhung der Aktivierbarkeit von TGF–β den regulatorischen Phänotyp von TRegs sicher und inhibiert die Ausbreitung von autoreaktiven TH17 Zellen.rn In dieser Arbeit stand die Regulation von GARP selbst im Mittelpunkt. Es konnte gezeigt werden, dass es sich innerhalb der kiefertragenden Vertebraten um ein strikt konserviertes Protein handelt. Datenbankanalysen machten deutlich, dass es zuerst in basalen Knochenfischen zusammen mit anderen Komponenten der adaptiven Immunantwort auftritt. Ein 3D–Modell, welches über Homologiemodellierung erstellt wurde, gab Aufschluss über die Struktur des Rezeptors und mögliche intramolekulare Disulfidbrücken. Für in vitro Versuche wurde eine lösliche Variante von GARP durch einen Austausch der Transmembrandomäne durch C–terminale Meprin α Domänen konstruiert. Diese Variante wurde in der eukaryotischen Zellkultur zuverlässig in den Überstand sezerniert und konnte chromatografisch gereinigt werden. Mit diesem rekombinanten GARP wurden Prozessierungsversuche mit Autoimmunpathogenese assoziierten Proteasen durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die Serinproteasen Trypsin, Neutrophile Elastase und Plasmin, sowie die Metalloprotease MMP2 in der Lage sind, GARP vollständig zu degradieren. In TGF–β sensitiven Proliferationsuntersuchungen stellte sich heraus, dass die entstandenen Fragmente immer noch in der Lage waren die Aktivierbarkeit von TGF–β zu erhöhen. Neben der Degradierung durch die oben genannten Proteasen konnte ebenfalls beobachtet werden, dass MMP9 und Ovastacin in der Lage sind GARP spezifisch zu schneiden. Ovastacin mRNA wurde in dieser Arbeit das erste Mal außerhalb der Oocyte, in T–Zellen beschrieben. Mit GARP wurde zudem das zweite Proteinsubstrat, neben dem Zona Pellucida Protein 2 identifiziert. Das durch MMP9 erzeugte N–terminale Fragment besitzt zwar die Eigenschaft, an TGF–β zu binden, kann aber die Aktivierbarkeit von TGF–β nicht mehr wie das intakte GARP erleichtern. rnDiese Arbeit zeigte, dass GARP durch Proteolyse reguliert wird, wobei die entstehenden Fragmente unterschiedlichen Einfluss auf die Aktivierbarkeit von TGF–β haben. Dieses Wissen bildet die Grundlage für weitere Untersuchungen im translationalen Forschungsbereich, um die gewonnenen Erkenntnisse zur Immunmodulation in der Therapie verschiedener Krankheiten einsetzen zu können.rn

Control of protein degradation pathways by BAG proteins and changes during aging

Many age-related neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, amyotrophic lateral sclerosis and polyglutamine disorders, including Huntington’s disease, are associated with the aberrant formation of protein aggregates. These protein aggregates and/or their precursors are believed to be causally linked to the pathogenesis of such protein conformation disorders, also referred to as proteinopathies. The accumulation of protein aggregates, frequently under conditions of an age-related increase in oxidative stress, implies the failure of protein quality control and the resulting proteome instability as an upstream event of proteinopathies. As aging is a main risk factor of many proteinopathies, potential alterations of protein quality control pathways that accompany the biological aging process could be a crucial factor for the onset of these disorders.rnrnThe focus of this dissertation lies on age-related alterations of protein quality control mechanisms that are regulated by the co-chaperones of the BAG (Bcl-2-associated athanogene) family. BAG proteins are thought to promote nucleotide exchange on Hsc/Hsp70 and to couple the release of chaperone-bound substrates to distinct down-stream cellular processes. The present study demonstrates that BAG1 and BAG3 are reciprocally regulated during aging leading to an increased BAG3 to BAG1 ratio in cellular models of replicative senescence as well as in neurons of the aging rodent brain. Furthermore, BAG1 and BAG3 were identified as key regulators of protein degradation pathways. BAG1 was found to be essential for effective degradation of polyubiquitinated proteins by the ubiquitin/proteasome system, possibly by promoting Hsc/Hsp70 substrate transfer to the 26S proteasome. In contrast, BAG3 was identified to stimulate the turnover of polyubiquitinated proteins by macroautophagy, a catabolic process mediated by lysosomal hydrolases. BAG3-regulated protein degradation was found to depend on the function of the ubiquitin-receptor protein SQSTM1 which is known to sequester polyubiquitinated proteins for macroautophagic degradation. It could be further demonstrated that SQSTM1 expression is tightly coupled to BAG3 expression and that BAG3 can physically interact with SQSTM1. Moreover, immunofluorescence-based microscopic analyses revealed that BAG3 co-localizes with SQSTM1 in protein sequestration structures suggesting a direct role of BAG3 in substrate delivery to SQSTM1 for macroautophagic degradation. Consistent with these findings, the age-related switch from BAG1 to BAG3 was found to determine that aged cells use the macroautophagic system more intensely for the turnover of polyubiquitinated proteins, in particular of insoluble, aggregated quality control substrates. Finally, in vivo expression analysis of macroautophagy markers in young and old mice as well as analysis of the lysosomal enzymatic activity strongly indicated that the macroautophagy pathway is also recruited in the nervous system during the organismal aging process.rnrnTogether these findings suggest that protein turnover by macroautophagy is gaining importance during the aging process as insoluble quality control substrates are increasingly produced that cannot be degraded by the proteasomal system. For this reason, a switch from the proteasome regulator BAG1 to the macroautophagy stimulator BAG3 occurs during cell aging. Hence, it can be concluded that the BAG3-mediated recruitment of the macroauto-phagy pathway is an important adaptation of the protein quality control system to maintain protein homeostasis in the presence of an enhanced pro-oxidant and aggregation-prone milieu characteristic of aging. Future studies will explore whether an impairment of this adaptation process may contribute to age-related proteinopathies.