Misregulation of the tumour suppressor gene CYLD drives hyperactivation of T cells leading to intestinal pathology

The tumour suppressor gene cyld is mutated in familial cylindromatosis, an autosomal-dominant condition that predisposes to multiple skin tumours. The deubiquitinase CYLD acts as a negative regulator of NF-κB signaling. To analyse the function of CYLD in vivo we used the CYLDex7/8 mice, which are characterized by loss of the full-length transcript and overexpression of a short splice variant of CYLD (sCYLD). In CYLDex7/8 mice the overexpression of sCYLD results in splenomegaly and lymphadenopathy. Additionally, the B cell population in spleen and lymph nodes is increased at the expense of T cells. Analysis of CYLDex7/8 T cells showed a significant reduction of CD4 single positive (SP) and CD8 SP T cells in the thymus and in the periphery. By investigating the impact of sCYLD in TCR signaling in thymocytes, we could demonstrate that sCYLD partially inhibited the activation of Zap70 and thereby negatively regulated TCR signaling. In vitro as well as in vivo we could show that CD4+ T cells displayed a hyperactive phenotype, proliferated to a better extent than WT cells and expressed high amounts of inflammatory cytokines such as IL-6 and IL-17A. Western Blots of steady state thymocytes and peripheral CD4+ T cells were performed, showing that the noncanonical pathway was highly upregulated visualized by the expression levels of RelB and p100 leading to a hyperactive phenotype of CD4+ T cells. In order to investigate the contribution of sCYLD in positive and negative selection in the thymus in vivo, the HY-TCR transgene (HYtg) was crossed to CYLDex7/8 mice. The analysis of CYLDex7/8 HYtg males revealed an increase in CD4+CD8+ DP as well as in CD8+ SP thymocytes, suggesting a less pronounced negative selection in CYLD mutant mice compared to HYtg control mice. Interestingly, the impaired negative selection in the thymus was accompanied by a strong colitis phenotype at early ages (4 weeks). Since medullary TECs (mTECs) play an important role in the late stage of T cell development by negatively selecting autoreactive thymocytes, the levels of mTECs in the medullary compartment was investigated. Of note, low numbers of mTECs were observed, combined with decreased expression levels of the mTEC markers UEA-1, keratin-5, claudin-3 and claudin-4. The reduction of mTECs in the medullary compartment could explain the inflammatory phenotype of CD4+ T cells in CYLDex7/8 mice leading to the severe intestinal pathology observed in these mice. Taken together, these results show an important role of sCYLD in T cell development and function as well as in NF-кB signaling of T cells.

Spin polarized transport in manganese oxide double-perovskite thin films

Gegenstand dieser Arbeit war die Untersuchung von metallischen gemischtvalenten Manganaten und magnetischen Doppelperowskiten. Aufgrund ihres großen negativen Magnetowiderstandes (MW) sind diese halbmetallischen Oxide interessant für mögliche technische Anwendungen, z.B. als Leseköpfe in Festplatten. Es wurden die kristallographischen, elektronischen und magnetischen Eigenschaften von epitaktischen Dünnschichten und polykristallinen Pulverproben bestimmt.Epitaktische Dünnschichten der Verbindungen La_0.67Ca_0.33MnO₃ und La_0.67Sr_0.33MnO₃ wurdenmit Kaltkathodenzerstäubung und Laserablation auf einkristallinen Substraten wie SrTiO₃abgeschieden. Mit Hall-Effekt Messungen wurde ein Zusammenbruch der Ladungsträgerdichte bei der Curie-Temperatur T_C beobachtet.Mit dem Wechsel des Dotierungsatoms A von Ca (T_C=232 K) zu Sr (T_C=345 K)in La_0.67A_0.33MnO₃ konnte die Feldsensitivität des Widerstandes bei Raumtemperatur gesteigert werden. Um die Sensitivität weiter zu erhöhen wurde die hohe Spinpolarisation von nahezu 100% in Tunnelexperimenten ausgenutzt. Dazu wurden biepitaktische La_0.67Ca_0.33MnO₃ Schichten auf SrTiO₃ Bikristallsubstraten hergestellt. Die Abhängigkeit des Tunnelmagnetowiderstandes (TMW) vom magnetischen Feld, Temperatur und Strum war ein Schwerpunkt der Untersuchung. Mittels spinpolarisierten Tunnelns durch die künstliche Korngrenze konnte ein hysteretischer TMW von 70% bei 4 K in kleinen Magnetfeldern von 120 Oe gemessen werden. Eine weitere magnetische Oxidverbindung, der Doppelperowskit Sr₂FeMoO₆ miteine Curie-Temperatur oberhalb 400 K und einem großen MW wurde mittels Laserablation hergestellt. Die Proben zeigten erstmals das Sättigunsmoment, welches von einer idealen ferrimagnetischen Anordnung der Fe und Mo Ionen erwartet wird. Mit Hilfe von Magnetotransportmessungen und Röntgendiffraktometrie konnte eine Abhängigkeit zwischen Kristallstruktur (Ordnung oder Unordnung im Fe, Mo Untergitter) und elektronischem Transport (metallisch oder halbleitend) aufgedeckt werden.Eine zweiter Doppelperowskit Ca₂FeReO₆ wurde im Detail als Pulverprobe untersucht. Diese Verbindung besitzt die höchste Curie-Temperatur von 540 K, die bis jetzt in magnetischen Perowskiten gefunden wurde. Mit Neutronenstreuung wurde eine verzerrte monoklinische Struktur und eine Phasenseparation aufgedeckt.

Die Funktion der Rho GTPasen in den von Toll-Rezeptoren induzierten Signaltransduktionswegen

Die Funktion von Rho GTPasen in den von Toll-Rezeptoren induzierten Signaltransduktionswegen Der Toll-ähnliche Rezeptor 2 (hTLR2) ist wie der TNFa-Rezeptor und das bei Drosophila identifizierte Imd-Protein in der Lage, über einen bisher ungeklärten Mechanismus, sowohl die Aktivierung von NF-kB als auch Apoptose zu induzieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die aktive Form der GTPase Rho in beiden Signaltransduktionswegen eine entscheidende Kontrollfunktion übernimmt. So führt die Stimulierung von TLR2 zu einer Aktivierung von RhoA in epithelialen und monozytischen Zellinien. Die aktivierte GTPase rekrutiert die Kinase PKCz und induziert so die IkB-unabhängige Aktivierung des p65/Rel-Transkriptionskomplexes. Aktives RhoA kontrolliert darüberhinaus einen weiteren Signaltransduktionsweg, der die TLR2-abhängigen, früh-apoptptischen Membranveränderungen unter der Beteiligung der Kinasen ROCK und MLCK herbeiführt. Die Rho-abhängige Regulation dieser gegensätzlichen Signalantworten wird durch die direkte Interaktion mit spezifischen Downstreamtargets, die jeweils nur Bestandteil eines Signalweges sind, ermöglicht. Die GTPase Rho stellt somit ein Schlüsselelement in der von TLR2 induzierten primären Immunantwort dar.

Simulation studies of correlation functions and relaxation in polymeric systems

We investigate the statics and dynamics of a glassy,non-entangled, short bead-spring polymer melt with moleculardynamics simulations. Temperature ranges from slightlyabove the mode-coupling critical temperature to the liquidregime where features of a glassy liquid are absent. Ouraim is to work out the polymer specific effects on therelaxation and particle correlation. We find the intra-chain static structure unaffected bytemperature, it depends only on the distance of monomersalong the backbone. In contrast, the distinct inter-chainstructure shows pronounced site-dependence effects at thelength-scales of the chain and the nearest neighbordistance. There, we also find the strongest temperaturedependence which drives the glass transition. Both the siteaveraged coupling of the monomer and center of mass (CM) andthe CM-CM coupling are weak and presumably not responsiblefor a peak in the coherent relaxation time at the chain'slength scale. Chains rather emerge as soft, easilyinterpenetrating objects. Three particle correlations arewell reproduced by the convolution approximation with theexception of model dependent deviations. In the spatially heterogeneous dynamics of our system weidentify highly mobile monomers which tend to follow eachother in one-dimensional paths forming ``strings''. Thesestrings have an exponential length distribution and aregenerally short compared to the chain length. Thus, arelaxation mechanism in which neighboring mobile monomersmove along the backbone of the chain seems unlikely.However, the correlation of bonded neighbors is enhanced. When liquids are confined between two surfaces in relativesliding motion kinetic friction is observed. We study ageneric model setup by molecular dynamics simulations for awide range of sliding speeds, temperatures, loads, andlubricant coverings for simple and molecular fluids. Instabilities in the particle trajectories are identified asthe origin of kinetic friction. They lead to high particlevelocities of fluid atoms which are gradually dissipatedresulting in a friction force. In commensurate systemsfluid atoms follow continuous trajectories for sub-monolayercoverings and consequently, friction vanishes at low slidingspeeds. For incommensurate systems the velocity probabilitydistribution exhibits approximately exponential tails. Weconnect this velocity distribution to the kinetic frictionforce which reaches a constant value at low sliding speeds. This approach agrees well with the friction obtaineddirectly from simulations and explains Amontons' law on themicroscopic level. Molecular bonds in commensurate systemslead to incommensurate behavior, but do not change thequalitative behavior of incommensurate systems. However,crossed chains form stable load bearing asperities whichstrongly increase friction.

Theoretical studies of fluid membrane mechanics

Biologische Membranen sind Fettmolekül-Doppelschichten, die sich wie zweidimensionale Flüssigkeiten verhalten. Die Energie einer solchen fluiden Oberfläche kann häufig mit Hilfe eines Hamiltonians beschrieben werden, der invariant unter Reparametrisierungen der Oberfläche ist und nur von ihrer Geometrie abhängt. Beiträge innerer Freiheitsgrade und der Umgebung können in den Formalismus mit einbezogen werden. Dieser Ansatz wird in der vorliegenden Arbeit dazu verwendet, die Mechanik fluider Membranen und ähnlicher Oberflächen zu untersuchen. Spannungen und Drehmomente in der Oberfläche lassen sich durch kovariante Tensoren ausdrücken. Diese können dann z. B. dazu verwendet werden, die Gleichgewichtsposition der Kontaktlinie zu bestimmen, an der sich zwei aneinander haftende Oberflächen voneinander trennen. Mit Ausnahme von Kapillarphänomenen ist die Oberflächenenergie nicht nur abhängig von Translationen der Kontaktlinie, sondern auch von Änderungen in der Steigung oder sogar Krümmung. Die sich ergebenden Randbedingungen entsprechen den Gleichgewichtsbedingungen an Kräfte und Drehmomente, falls sich die Kontaktlinie frei bewegen kann. Wenn eine der Oberflächen starr ist, muss die Variation lokal dieser Fläche folgen. Spannungen und Drehmomente tragen dann zu einer einzigen Gleichgewichtsbedingung bei; ihre Beiträge können nicht mehr einzeln identifiziert werden. Um quantitative Aussagen über das Verhalten einer fluiden Oberfläche zu machen, müssen ihre elastischen Eigenschaften bekannt sein. Der "Nanotrommel"-Versuchsaufbau ermöglicht es, Membraneigenschaften lokal zu untersuchen: Er besteht aus einer porenüberspannenden Membran, die während des Experiments durch die Spitze eines Rasterkraftmikroskops in die Pore gedrückt wird. Der lineare Verlauf der resultierenden Kraft-Abstands-Kurven kann mit Hilfe der in dieser Arbeit entwickelten Theorie reproduziert werden, wenn der Einfluss von Adhäsion zwischen Spitze und Membran vernachlässigt wird. Bezieht man diesen Effekt in die Rechnungen mit ein, ändert sich das Resultat erheblich: Kraft-Abstands-Kurven sind nicht länger linear, Hysterese und nichtverschwindende Trennkräfte treten auf. Die Voraussagen der Rechnungen könnten in zukünftigen Experimenten dazu verwendet werden, Parameter wie die Biegesteifigkeit der Membran mit einer Auflösung im Nanometerbereich zu bestimmen. Wenn die Materialeigenschaften bekannt sind, können Probleme der Membranmechanik genauer betrachtet werden. Oberflächenvermittelte Wechselwirkungen sind in diesem Zusammenhang ein interessantes Beispiel. Mit Hilfe des oben erwähnten Spannungstensors können analytische Ausdrücke für die krümmungsvermittelte Kraft zwischen zwei Teilchen, die z. B. Proteine repräsentieren, hergeleitet werden. Zusätzlich wird das Gleichgewicht der Kräfte und Drehmomente genutzt, um mehrere Bedingungen an die Geometrie der Membran abzuleiten. Für den Fall zweier unendlich langer Zylinder auf der Membran werden diese Bedingungen zusammen mit Profilberechnungen kombiniert, um quantitative Aussagen über die Wechselwirkung zu treffen. Theorie und Experiment stoßen an ihre Grenzen, wenn es darum geht, die Relevanz von krümmungsvermittelten Wechselwirkungen in der biologischen Zelle korrekt zu beurteilen. In einem solchen Fall bieten Computersimulationen einen alternativen Ansatz: Die hier präsentierten Simulationen sagen voraus, dass Proteine zusammenfinden und Membranbläschen (Vesikel) bilden können, sobald jedes der Proteine eine Mindestkrümmung in der Membran induziert. Der Radius der Vesikel hängt dabei stark von der lokal aufgeprägten Krümmung ab. Das Resultat der Simulationen wird in dieser Arbeit durch ein approximatives theoretisches Modell qualitativ bestätigt.

Time-resolved surface enhanced resonance Raman spectro-electrochemistry of heme proteins

The membrane protein Cytochrome c Oxidase (CcO) is one of the most important functional bio-molecules. It appears in almost every eukaryotic cell and many bacteria. Although the different species differ in the number of subunits, the functional differences are merely marginal. CcO is the terminal link in the electron transfer pathway of the mitochondrial respiratory chain. Electrons transferred to the catalytic center of the enzyme conduce to the reduction of molecular oxygen to water. Oxygen reduction is coupled to the pumping of protons into the inter-membrane space and hence generates a difference in electrochemical potential of protons across the inner mitochondrial membrane. This potential difference drives the synthesis of adenosine triphosphate (ATP), which is the universal energy carrier within all biological cells. rnrnThe goal of the present work is to contribute to a better understanding of the functional mechanism of CcO by using time-resolved surface enhanced resonance Raman spectroscopy (TR-SERRS). Despite intensive research effort within the last decades, the functional mechanism of CcO is still subject to controversial discussions. It was the primary goal of this dissertation to initiate electron transfer to the redox centers CuA, heme a, heme a3 and CuB electrochemically and to observe the corresponding redox transitions in-situ with a focus on the two heme structures by using SERRS. A measuring cell was developed, which allowed combination of electrochemical excitation with Raman spectroscopy for the purpose of performing the accordant measurements. Cytochrome c was used as a benchmark system to test the new measuring cell and to prove the feasibility of appropriate Raman measurements. In contrast to CcO the heme protein cc contains only a single heme structure. Nevertheless, characteristic Raman bands of the hemes can be observed for both proteins.rnrnIn order to investigate CcO it was immobilized on top of a silver substrate and embedded into an artificial membrane. The catalytic activity of CcO and therefore the complete functional capability of the enzyme within the biomimetic membrane architecture was verified using cyclic voltammetry. Raman spectroscopy was performed using a special nano-structured silver surface, which was developed within the scope of the present work. This new substrate combined two fundamental properties. It facilitated the formation of a protein tethered bilayer lipid membrane (ptBLM) and it allowed obtaining Raman spectra with sufficient high signal-to-noise ratios.rnSpectro-electrochemical investigations showed that at open circuit potential the enzyme exists in a mixed-valence state, with heme a and and heme a3 in the reduced and oxidized state, respectively. This was considered as an intermediate state between the non-activated and the fully activated state of CcO. Time-resolved SERRS measurements revealed that a hampered electron transfer to the redox center heme a3 characterizes this intermediate state.rn

Long-term potentiation and neural network activity in the neonatal rat cerebral cortex in vivo

Long-term potentiation in the neonatal rat rnbarrel cortex in vivo rnLong-term potentiation (LTP) is important for the activity-dependent formation of early cortical circuits. In the neonatal rodent barrel cortex LTP has been so far only studied in vitro. I combined voltage-sensitive dye imaging with extracellular multi-electrode recordings to study whisker stimulation-induced LTP for both the slope of field potential and the number of multi-unit activity in the whisker-to-barrel cortex pathway of the neonatal rat barrel cortex in vivo. Single whisker stimulation at 2 Hz for 10 min induced an age-dependent expression of LTP in postnatal day (P) 0 to P14 rats with the strongest expression of LTP at P3-P5. The magnitude of LTP was largest in the stimulated barrel-related column, smaller in the surrounding septal region and no LTP could be observed in the neighboring barrel. Current source density analyses revealed an LTP-associated increase of synaptic current sinks in layer IV / lower layer II/III at P3-P5 and in the cortical plate / upper layer V at P0-P1. This study demonstrates for the first time an age-dependent and spatially confined LTP in the barrel cortex of the newborn rat in vivo. These activity-dependent modifications during the critical period may play an important role in the development and refinement of the topographic map in the barrel cortex. (An et al., 2012)rnEarly motor activity triggered by gamma and spindle bursts in neonatal rat motor cortexrnSelf-generated neuronal activity generated in subcortical regions drives early spontaneous motor activity, which is a hallmark of the developing sensorimotor system. However, the neuronal activity patterns and functions of neonatal primary motor cortex (M1) in the early movements are still unknown. I combined voltage-sensitive dye imaging with simultaneous extracellular multi-electrode recordings in the neonatal rat S1 and M1 in vivo. At P3-P5, gamma and spindle bursts observed in M1 could trigger early paw movements. Furthermore, the paw movements could be also elicited by the focal electrical stimulation of M1 at layer V. Local inactivation of M1 could significantly attenuate paw movements, suggesting that the neonatal M1 operates in motor mode. In contrast, the neonatal M1 can also operate in sensory mode. Early spontaneous movements and sensory stimulations of paw trigger gamma and spindle bursts in M1. Blockade of peripheral sensory input from the paw completely abolished sensory evoked gamma and spindle bursts. Moreover, both sensory evoked and spontaneously occurring gamma and spindle bursts mediated interactions between S1 and M1. Accordingly, local inactivation of the S1 profoundly reduced paw stimulation-induced and spontaneously occurring gamma and spindle bursts in M1, indicating that S1 plays a critical role in generation of the activity patterns in M1. This study proposes that both self-generated and sensory evoked gamma and spindle bursts in M1 may contribute to the refinement and maturation of corticospinal and sensorimotor networks required for sensorimotor coordination.rn

LoneStar : Design and evaluation of an energy-efficient, disk-based archival storage system

Bandlaufwerke waren bisher die vorherrschende Technologie, um die anfallenden Datenmengen in Archivsystemen zu speichern. Mit Zugriffsmustern, die immer aktiver werden, und Speichermedien wie Festplatten die kostenmäßig aufholen, muss die Architektur vor Speichersystemen zur Archivierung neu überdacht werden. Zuverlässigkeit, Integrität und Haltbarkeit sind die Haupteigenschaften der digitalen Archivierung. Allerdings nimmt auch die Zugriffsgeschwindigkeit einen erhöhten Stellenwert ein, wenn aktive Archive ihre gesamten Inhalte für den direkten Zugriff bereitstellen. Ein band-basiertes System kann die hierfür benötigte Parallelität, Latenz und Durchsatz nicht liefern, was in der Regel durch festplattenbasierte Systeme als Zwischenspeicher kompensiert wird.rnIn dieser Arbeit untersuchen wir die Herausforderungen und Möglichkeiten ein festplattenbasiertes Speichersystem zu entwickeln, das auf eine hohe Zuverlässigkeit und Energieeffizienz zielt und das sich sowohl für aktive als auch für kalte Archivumgebungen eignet. Zuerst analysieren wir die Speichersysteme und Zugriffsmuster eines großen digitalen Archivs und präsentieren damit ein mögliches Einsatzgebiet für unsere Architektur. Daraufhin stellen wir Mechanismen vor um die Zuverlässigkeit einer einzelnen Festplatte zu verbessern und präsentieren sowie evaluieren einen neuen, energieeffizienten, zwei- dimensionalen RAID Ansatz der für „Schreibe ein Mal, lese mehrfach“ Zugriffe optimiert ist. Letztlich stellen wir Protokollierungs- und Zwischenspeichermechanismen vor, die die zugrundeliegenden Ziele unterstützen und evaluieren das RAID System in einer Dateisystemumgebung.